Tinh sạch một phần và nghiên cứu một số tính chất của superoxide dismuatase (SOD1) từ tôm sú (Penaeus monodon)

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 93–101 
DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14737 
93 
PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A SUPEROXIDE 
DISTIMUTASE (SOD1) FROM BLACK TIGER SHRIMPS Penaeus monodon 
Tran Minh Hien
1
, Nguyen Thi Hong Loan
1,2
, Trinh Dinh Quynh
1
, 
Ngo Thi Trang
2
, Dang Thi Lua
3
, Phan Tuan Nghia
1,2,* 
1
Key Laboratory of Protein and Enzyme Technology, VNU University of Science, Vietnam 
National University, Hanoi 
2
Faculty of Biology, VNU University of Science, Vietnam National University, Hanoi 
3
Research Institute for Aquaculture No. 1 
Received 26 December 2019, accepted 9 March 2020 
ABSTRACT 
Superroxide dismutase (SOD, EC.1.15.1.1) is the enzyme which dismutates superoxide radicals 
and plays an important role in protection of living cells against oxidative stress. SOD is also 
involved in immune response in shrimps. In this study, it was found that the total SOD activity of 
black tiger shrimp muscular tissues is 10 fold higher than that of the haemolymph, however, the 
specific activity of SOD in the shrimp haemolymph is 9.2 fold higher than that of muscular 
tissues. By using active gel electrophoresis, 2 different SOD forms were found in black tiger 
shrimps (one in muscular tissues and two in haemolymph). 
Using DE-52 cellulose and Q-Sepharose ion exchange column chromatography, one SOD 
(SOD1) from black tiger shrimp haemolymph was partially purified, and its purity was 31.2 
times higher than that of the starting haemolymph. The SOD1 was shown to have mainly one 
protein band of approximately 24 kDa on SDS-PAGE. SOD1 was most active at 45
o
C and pH of 
5.5. At a concentration of 5 mM, Mn
2+
 strongly activated SOD1 (up 200% activity), Ca
2+
 và Zn
2+
could increase approximately 20% activity while Cu
2+
 inhibited more than 60% ativity of the 
enzyme. 
Keywords: (Penaeus monodon) black tiger shrimps, ion exchange chromatography, purification, 
superoxide dismutase. 
Citation: Tran Minh Hien, Nguyen Thi Hong Loan, Trinh Dinh Quynh, Ngo Thi Trang, Dang Thi Lua, Phan Tuan 
Nghia, 2020. Partial purification and characterization of a superoxide distimutase (SOD1) from black tiger shrimps 
Penaeus monodon. Tap chi Sinh hoc (Journal of Biology), 42(1): 93–101. https://doi.org/10.15625/0866-
7160/v42n1.14737. 
*Corresponding author email: phantuannghia@vnu.edu.vn 
©2020 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 
TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 93–101 
DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14737 
94 
TINH SẠCH MỘT PHẦN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA 
SUPEROXIDE DISMUATASE (SOD1) TỪ TÔM SÚ (Penaeus monodon) 
Trần Minh Hiền1, Nguyễn Thị Hồng Loan1,2, Trịnh Đình Quỳnh1, 
Ngô Thị Trang2, Đặng Thị Lụa3, Phan Tuấn Nghĩa1,2,* 
1
Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự 
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 
2
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 
3
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I 
Ngày nhận bài 26-12-2019, ngày chấp nhận 9-3-2020 
TÓM TẮT 
Superoxide dismutase (SOD, EC.1.15.1.1) là enzyme phân hủy gốc superoxide, thuộc nhóm các 
dạng oxi phản ứng và có vai trò quan trọng trong bảo vệ tổn thương oxi hóa ở các cơ thể sinh vật, 
đặc biệt, SOD còn có vai trò trong đáp ứng miễn dịch ở tôm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã 
phát hiện thấy hoạt độ SOD tổng số của mô cơ tôm sú cao hơn 10 lần so với của huyết tương, tuy 
nhiên hoạt độ riêng SOD trong huyết tương lại cao hơn trong cơ gấp 9,2 lần so với trong mô cơ, 
điều này chứng tỏ có sự tập trung của SOD trong huyết tương. Bằng phương pháp điện di gel 
hoạt tính, chúng tôi phát hiện thấy có 2 dạng SOD trong huyết tương trong khi chỉ có một dạng 
SOD trong mô cơ của tôm sú. 
Sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion qua cột DE-52 cellulose và Q-sepharose, chúng tôi đã 
thu nhận được một chế phẩm SOD (SOD1) có độ sạch cao hơn ban đầu 31,2 lần; trên điện di gel 
polyacrylamide có chứa SDS, chế phẩm cho một băng protein chính có khối lượng phân tử 
khoảng 24 kDa. SOD1 hoạt động tốt nhất ở 45oC và pH 5,5. Ở nồng độ 5 mM, Mn2+ có tác dụng 
hoạt hóa mạnh SOD1 (tăng lên tới 200%), Ca2+ và Zn2+ có khả năng làm tăng 20% hoạt độ 
enzyme, trong khi đó Cu2+ lại ức chế hơn 60% hoạt độ của SOD1. 
Từ khoá: Sắc ký trao đổi ion, superoxide dismutase, tinh sạch, tôm sú. 
*Địa chỉ liên hệ email: phantuannghia@vnu.edu.vn 
MỞ ĐẦU 
Superoxide dismutase (SOD, 
EC.1.15.1.1) là một enzyme xúc tác phản 
ứng chuyển hóa gốc O2·ˉ thành H2O2 và có 
chức năng cân bằng nồng độ các dạng oxi 
phản ứng và bảo vệ tế bào khỏi các stress oxi 
hóa (Fridovich, 1975). 
Trong các loài giáp xác nói chung, nhiều 
đồng dạng (isoform) của SOD đã được phát 
hiện, các SOD này được chia thành 2 nhóm 
dựa vào bản chất của cofactor kim loại. Nhóm 
thứ nhất được ký hiệu là Cu, ZnSOD, cấu trúc 
từ 2 tiểu đơn vị giống nhau, với khối lượng 
phân tử (KLPT) khoảng 16 kDa, chứa một 
nguyên tử Cu2+ và một nguyên tử Zn2+ trong 
trung tâm hoạt động, thường định khu trong tế 
bào chất. Đây là dạng SOD phổ biến nhất 
trong các tế bào nhân thực và có trình tự axit 
amin bảo thủ từ các loài nấm cho đến động 
vật có vú (Brouwer et al., 2003). Cơ chế hoạt 
động của enzyme này dựa trên tính khử và oxi 
hóa của nguyên tử Cu2+ trong trung tâm hoạt 
động khi liên kết với gốc O2·ˉ, do đó Cu
2+ 
không thể bị thay thế bởi kim loại khác và 
Cu
2+
có khả năng hồi tính enzyme, trong khi 
Partial purification and characterization 
95 
Zn
2+
 có thể được thay thế bởi một vài ion kim 
loại khác như Co2+, Hg2+ hay Cd2+ mà không 
ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Cu, ZnSOD 
bị ức chế thuận nghịch bởi cyanide. H2O2 ở 
nồng độ từ 0,01 mM có khả năng khử nguyên 
tử Cu2+ ở trung tâm hoạt động dẫn đến sự ức 
chế hoạt tính enzyme, đồng thời cũng có khả 
năng phá hủy cấu trúc enzyme dẫn đến sự mất 
hoạt tính hoàn toàn (Fridovich, 1975). Đây là 
một tính chất thú vị của SOD khi H2O2 là một 
sản phẩm trong phản ứng do nó xúc tác. Có lẽ 
do đó, Cu và ZnSOD thường chỉ định khu 
trong tế bào chất, nơi nồng độ H2O2 luôn được 
khống chế ở mức rất thấp bởi nhiều enzyme 
khác như catalase, peroxidase, (Hodgson & 
Fridovich 1975). Nhóm SOD thứ hai có chứa 
Mn
2+ 
trong trung tâm hoạt động, ký hiệu 
MnSOD, thường định khu trong ty thể. 
Enzyme này có dạng homodimer, cấu thành từ 
hai tiểu đơn vị giống nhau có KLPT vào 
khoảng 24‒25 kDa. MnSOD được phiên mã 
và dịch mã từ gen nhân thành dạng tiền chất, 
sau đó được di chuyển từ tế bào chất vào ty 
thể sau khi được loại bỏ một đoạn peptide 
định hướng ở đầu N (Brouwer et al., 2003). 
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy MnSOD có 
nguồn gốc hoàn toàn khác so với Cu, ZnSOD, 
mặc dù cơ chế hoạt động của 2 enzyme này là 
tương tự nhau. MnSOD ở các sinh vật nhân 
thực có sự tương đồng cao với MnSOD của 
các loài vi khuẩn, gợi ý rằng chúng có nguồn 
gốc rất gần gũi (Fridovich, 1975). Giống với 
Cu, ZnSOD, MnSOD cũng có trình tự axit 
amin mang tính bảo thủ cao từ vi khuẩn cho 
tới động vật. Tuy vậy, MnSOD lại không 
nhạy cảm với cyanide và không bị ức chế bởi 
H2O2, do đó có khả năng hoạt động ở những 
nơi có nồng độ các chất oxi hóa cao như ty thể 
(Hodgson & Fridovich, 1975). 
Trong các nhóm giáp xác sử dụng 
hemocyanin để vận chuyển oxi, đã có các báo 
cáo về một hiện tượng độc đáo xảy ra trên một 
số loài, đó là sự thay thế Cu, ZnSOD bằng 
MnSOD trong tế bào chất. Giả thuyết của 
nhóm tác giả đề xuất cho rằng sự biến mất của 
Cu, ZnSOD xảy ra vì cạnh tranh nguồn nguyên 
tử Cu với quá trình tổng hợp hemocyanin. 
Thay vào đó, enzyme MnSOD trong tế bào 
chất (cytMnSOD) được hình thành qua sự nhân 
đôi gen mã hóa MnSOD trong ty thể 
(mtMnSOD) và đã thay thế cho Cu, ZnSOD ở 
tế bào chất (cytCu, ZnSOD) (Hodgson & 
Fridovich, 1975; Brouwer et al. 2003; Gómez-
Anduro et al., 2006). Sự khác biệt chủ yếu giữa 
2 loại cytMnSOD và mtMnSOD là một đoạn 
trình tự định hướng ở đầu N khiến cytMnSOD 
thiếu đi cấu trúc đặc trưng để di chuyển được 
vào ty thể và do đó định khu lại ở tế bào chất, 
trong khi ở mtMnSOD, đoạn trình tự này bị cắt 
bỏ khỏi dạng tiền chất trước khi enzyme di 
chuyển vào định khu ở ty thể (Gómez-Anduro 
et al., 2006). 
Với đối tượng tôm sú Penaeus monodon, 
các nghiên cứu về SOD của loài này mới chỉ 
dừng ở giải trình tự gen và cho thấy có 2 loại 
SOD trong tôm sú là mtMnSOD (GenBank: 
AGI99530.1) và cytMnSOD (GenBank: 
ANZ80590.1). Trình tự axit amin được suy ra 
từ trình tự gen cho thấy mtMnSOD có 220 gốc 
axit amin và KLPT xấp xỉ 24,1 kDa, 
cytMnSOD có 287 gốc axit amin và KLPT xấp 
xỉ 31,4 kDa. Tuy vậy, chưa có nghiên cứu nào 
khẳng định được số lượng các đồng dạng SOD 
trong P. monodon cũng như tách chiết, tinh 
sạch hay nghiên cứu tính chất enzyme này. 
Trong hệ miễn dịch của các loài tôm, quá 
trình thực bào sử dụng các dạng oxi phản ứng 
(reactive oxygen species-ROS) để tiêu diệt tác 
nhân xâm nhiễm có thể gây hại đến tế bào 
khỏe mạnh, do ROS có tác dụng phá hủy cấu 
trúc của các đại phân tử sinh học như protein, 
carbohydrate, lipid và nucleotide (Yao et al., 
2004). SOD chuyển hóa gốc O2·ˉ (sản phẩm 
đầu tiên và cũng là sản phẩm nhiều nhất của 
quá trình bùng nổ hô hấp trong đáp ứng miễn 
dịch ở tôm) thành oxi và H2O2. Kết hợp với 
các enzyme khác như catalase, peroxidase, 
SOD xử lý các ROS dư thừa, khử độc cho tế 
bào sau đáp ứng miễn dịch. Hoạt động này có 
ý nghĩa thiết yếu đối với sự sống của tế bào 
(Yao et al., 2007). Chính vì vậy nghiên cứu về 
SOD góp phần làm sáng tỏ các cơ chế đáp 
ứng miễn dịch ở tôm. 
Mặc dầu đã có nhiều nghiên cứu khác 
nhau về SOD ở tôm, tuy vậy cho đến nay 
chưa có dẫn liệu nào được công bố về tinh 
Tran Minh Hien et al. 
96 
sạch và tính chất của SOD trên tôm sú. Đây là 
lý do để chúng tôi thực hiện công trình nghiên 
cứu này. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU 
Vật liệu là tôm sú sống, được Viện 
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I cung cấp 
với khối lượng đồng đều, từ 12–15 g/con. 
Các thiết bị chính được sử dụng bao gồm 
cột sắc ký (GE Healthcare, USA), máy đo 
quang phổ UV/VIS DU-800 (Beckman Coulter, 
USA), hệ thống điện di đứng (Biorad, USA), 
dụng cụ Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 
Unit MWCO 10 kDa (Sigma-Aldrich, USA). 
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 
bao gồm xanthine, xanthine oxidase, 
cytochrome c, albumin huyết thanh bò được 
mua từ Sigma Aldrich (USA), các hóa chất 
còn lại đều được mua từ các hãng tin cậy 
(Sigma-Aldrich, Serva...) và đạt độ tinh khiết 
phân tích. 
Chuẩn bị dịch chiết chứa SOD từ tôm sú 
Tôm sú sống được giải phẫu để thu tim và 
cơ. Mẫu được nghiền và đồng nhất trong đệm 
lạnh Tris- HCl 50 mM, pH 8 chứa NaCl 50 
mM theo tỉ lệ 200 mg mẫu/ml đệm. Dịch đồng 
nhất sau đó được ly tâm ở 10.000 vòng/phút 
trong 10 phút ở 4oC để thu dịch trong. 
Định lượng protein 
Nồng độ protein trong dịch chiết được 
định lượng theo phương pháp Bradford dựa 
trên nguyên lí về sự thay đổi bước sóng hấp 
thụ của thuốc thử Bradford sau khi tạo phức 
đặc hiệu với protein (Bradford, 1976), sử 
dụng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn. 
Xác định hoạt độ SOD 
Hoạt độ SOD được xác định theo phương 
pháp của McCord Fridovich (1969), trong đó 
xanthine oxidase (XO) xúc tác phản ứng oxi 
hóa xanthine đồng thời tạo ra gốc superoxide. 
Khi phản ứng có mặt cytochrome c (Fe3+) thì 
hợp chất này bị khử bởi gốc superoxide thành 
sản phẩm có bước sóng hấp thụ tối ưu ở 550 
nm. Hoạt độ của enzyme SOD được đo bằng 
mức độ ức chế phản ứng khử cytochrome c. 
Phản ứng được thực hiện ở 25oC trong đệm 
phosphate kali 50 mM, pH 7,8 chứa EDTA 
0,1 mM. Hỗn hợp phản ứng gồm xanthine 
0,05 mM, cytochrome c 0,01 mM và lượng 
xanthine oxidase vừa đủ sao cho độ hấp thụ 
đo ở bước sóng 550 nm đạt 0,025 ± 0,005 đơn 
vị hấp thụ/phút. Một đơn vị hoạt độ (U) SOD 
là lượng enzyme ức chế 50% phản ứng khử 
cytochrome c (tương đương với mức độ làm 
giảm độ hấp thụ 0,0125 ± 0,005 đơn vị hấp 
thụ/phút). 
Việc xác định ảnh hưởng của các ion kim 
loại Cu2+, Mn2+, Ca2+ và Zn2+ được thực hiện 
bằng cách bổ sung các muối tương ứng 
(CuCl2, MnCl2, CaCl2, ZnCl2) vào chế phẩm 
SOD ở nồng độ cuối 5 mM và ủ hỗn hợp 
trong 20 phút, sau đó đo hoạt độ SOD còn lại. 
Mức độ ảnh hưởng của các chất được đánh 
giá bằng việc so sánh giữa hoạt độ khi không 
có và có chất ảnh hưởng. 
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệu 
được xử lý thống kê trung bình bằng phần 
mềm Microsof Excel 2013. 
Xác định đồng dạng SOD 
Các dạng SOD được phát hiện bằng 
phương pháp điện di gel polyacrylamide 
không biến tính kết hợp ủ cơ chất đặc hiệu 
theo Beauchamp & Fridovich (1971). Gel 
polyacrylamide không biến tính được chuẩn bị 
theo phương pháp của Laemmli (1970) nhưng 
đã loại bỏ SDS và chất khử (dithiothreitol hay 
β-mercaptoethanol) trong thành phần gel và 
đệm mẫu. 
Gel sau khi điện di được ngâm trong dung 
dịch nitro blue tetrazolium chloride (NBT) 
2,45 mM trong 20 phút, được ủ tiếp với đệm 
phosphate kali 50 mM, pH 7,8 có chứa 
TEMED 0,028 M và riboflavin 0,028 mM 
trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó được 
phơi sáng. Dưới tác dụng của ánh sáng, 
riboflavin sinh ra gốc superoxide, gốc này khử 
NBT thành formazan, làm toàn bộ bản gel có 
màu xanh tím. Tại những vùng có SOD, nhờ 
hoạt tính của enzyme, phản ứng khử NBT bị 
ức chế tạo thành những vạch sáng màu. 
H2O2 được thêm vào dung dịch riboflavin 
ở nồng độ cuối 5 mM để phân biệt các loại 
SOD dựa trên tính chất bị ức chế bởi H2O2 hay 
Partial purification and characterization 
97 
không của các loại SOD (Brouwer et al., 1997; 
McCord & Fridovich, 1969). 
Xác định độ tinh sạch của SOD 
Độ tinh sạch của chế phẩm SOD được 
kiểm tra bằng phương pháp điện di gel 
polyacrylamide có SDS (SDS–PAGE) theo 
phương pháp của Laemmli (1976), sử dụng 
thang chuẩn PageRuler Plus Prestained 
Protein Ladder 10–250 kDa (Thermo Fisher 
Scientific, USA). 
Gel sau điện di được nhuộm trong dung 
dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 
(CBB) 0,025%, methanol 30%, axit acetic 
10% và tẩy màu bằng cùng dung dịch pha 
CBB cho đến khi các nền gel sáng và các 
băng protein hiện rõ. 
Tách, tinh sạch SOD bằng sắc ký qua cột 
trao đổi ion DE-52 cellulose 
Dịch chiết từ huyết tương tôm sú được 
tinh sạch qua cột trao đổi ion DE-52 cellulose 
(3 × 23 cm) đã được cân bằng trong đệm Tris-
HCl 50 mM, pH 8 chứa NaCl 50 mM. Các 
protein không gắn cột được rửa khỏi cột bằng 
cùng đệm trên và protein gắn cột được rửa 
chiết bằng gradient nồng độ NaCl từ 50–1.000 
mM pha trong cùng đệm trên. Tổng thể tích 
rửa chiết bằng 10 lần thể tích gel. Các phân 
đoạn rửa chiết được xác định nồng độ protein 
dựa trên độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm (A280) 
và được xác định hoạt tính SOD theo phương pháp 
của McCord và Fridovich (1969). 
Những phân đoạn có hoạt tính SOD được 
gộp lại, cô đặc và chuyển sang đệm acetate 
natri 50 mM, pH 5 chứa NaCl 50 mM bằng 
dụng cụ Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 
Unit MWCO 10 kDa theo hướng dẫn của nhà 
sản xuất (Sigma Aldrich, USA). 
Tách, tinh sạch SOD bằng sắc ký qua cột 
trao đổi ion Q-sepharose 
Chế phẩm SOD thu được từ cột DE-52 
cellulose sau cô đặc và đổi đệm được tiếp tục 
tinh sạch qua cột trao đổi ion Q-Sepharose ở 
điều kiện pH 5, đệm acetate natri 50 mM chứa 
NaCl 50 mM. Các protein không gắn cột được 
rửa khỏi cột bằng cùng đệm trên, các protein 
gắn cột được rửa chiết bằng gradient nồng độ 
NaCl từ 50– 600 mM pha trong cùng đệm trên 
với tổng thể tích rửa chiết gấp 8 lần thể tích 
gel. Các phân đoạn rửa chiết được đo nồng độ 
protein qua giá trị A280 và đo hoạt độ SOD, 
đồng thời đánh giá độ tinh sạch qua SDS-
PAGE. Các phân đoạn có hoạt tính SOD được 
gộp lại, cô đặc bằng dụng cụ Amicon Ultra-15 
Centrifugal Filter Unit MWCO 10 kDa và bảo 
quản ở (-)20oC đến khi dùng cho các thí 
nghiệm tiếp theo. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Hoạt độ của SOD trong mô cơ và trong 
huyết tương tôm sú 
Kết quả xác định hoạt độ SOD của mô cơ 
và huyết tương tôm sú (hình 1) cho thấy hoạt 
độ SOD tổng số trong mô cơ là 1107 ± 137,4 
U/con và trong huyết tương là 112,8 ± 96 
U/con (hình 1A). Như vậy, hoạt độ tổng số 
của SOD trong mô cơ cao hơn trong huyết 
tương gấp 10 lần (P < 0,05). 
Hình 1. Hoạt độ tổng số SOD (A) và hoạt độ riêng SOD (B) của mô cơ và huyết tương tôm sú 
Tran Minh Hien et al. 
98 
Trên cơ sở hàm lượng protein và hoạt độ 
SOD, hoạt độ riêng của SOD đã được tính ra, 
kết quả thu được cho thấy hoạt độ riêng SOD 
của mô cơ tôm sú là 2 ± 0,8 U/mg protein và 
của huyết tương là 18,5 ± 4,1 U/mg protein 
(hình 1B). Như vậy, hoạt độ riêng của SOD 
trong huyết tương cao hơn trong mô cơ gấp 
9,2 lần (P < 0,05). 
Có thể thấy, hoạt độ SOD tổng số của mô 
cơ tôm sú cao hơn trong huyết tương, điều này 
chủ yếu do lượng mô cơ lớn hơn nhiều so với 
lượng huyết thanh của một con tôm (cụ thể tỷ 
lệ khối lượng giữa mô cơ và huyết tương 
trong nghiên cứu này là 72,6 lần). Tuy vậy, 
hoạt độ riêng SOD của huyết tương cao hơn 
so với trong mô cơ, điều này chứng tỏ tỉ lệ 
SOD/protein tổng số của huyết tương cao hơn 
so với trong mô cơ. 
 1 2 
Hình 2. Điện di không biến tính phát hiện các 
dạng của SOD trong mô cơ và huyết tương 
tôm sú: 1: Dịch chiết mô cơ; 2: Dịch chiết 
huyết tương 
Sử dụng phương pháp điện di trên gel 
polyacrylamide không biến tính và ủ trong cơ 
chất đặc hiệu đã cho phép phát hiện thấy có 2 
dạng của SOD, trong đó huyết tương có 2 
dạng SOD và mô cơ chỉ có một loại SOD 
(hình 2), cả hai SOD này đều bị bất hoạt khi 
được xử lý nhiệt ở 100oC trong 15 phút, và 
kết quả thu được (dẫn liệu không nêu ở đây) 
cho thấy cả hai dạng SOD của tôm sú đều 
không bị bất hoạt bởi H2O2 (ở nồng độ 5 
mM), do đó chúng thuộc nhóm MnSOD. Kết 
quả phát hiện hai dạng SOD ở tôm sú trong 
nghiên cứu này là hoàn toàn trùng khớp với 
dữ liệu trên GenBank về hai trình tự gen 
mtMnSOD (AGI99530.1) và cytMnSOD 
(ANZ80590.1) của tôm sú. 
Sự khác nhau về hoạt độ SOD cũng như 
phổ băng SOD giữa mô cơ và huyết tương 
tôm sú là những dẫn liệu đầu tiên được báo 
cáo trong nghiên cứu này. Việc phát hiện thấy 
hoạt độ riêng SOD của huyết tương tôm sú 
cao hơn trong mô cơ, kèm theo sự có mặt của 
cả hai dạng SOD trong huyết tương, trong khi 
trong mô cơ chỉ có một dạng SOD cũng là 
những dẫn liệu thú vị gợi ý về vai trò quan 
trọng của SOD ở trong huyết tương, nơi diễn 
ra các đáp ứng miễn dịch chủ yếu của tôm. 
Tách và tinh sạch SOD trong huyết tương 
tôm sú 
Sử dụng cột sắc ký trao đổi ion DE-52 
cellulose ở điều kiện pH 8, dịch chiết huyết 
tương tôm sú sau khi qua cột DE-52 cellulose 
cho 2 đỉnh hoạt tính SOD được rửa chiết ra ở 
nồng độ NaCl lần lượt là 400 mM và 600 mM 
(hình 3A). Đỉnh SOD thứ nhất (ký hiệu là 
SOD1) có hoạt độ tổng số là 1001,6 U và hoạt 
độ riêng 25,04 U/mg protein. Đỉnh SOD thứ 
hai (ký hiệu là SOD2) có hoạt độ tổng số là 
930 U và hoạt độ riêng 80,19 U/mg protein. 
Để tiếp tục tinh sạch SOD1, các phân 
đoạn qua cột DE-52 cellulose thuộc đỉnh 
SOD1 được gộp lại và tiếp tục cho tinh sạch 
qua cột trao đổi ion Q-Sepharose, sử dụng 
đệm acetate natri 50 mM, pH = 5 có chứa 
NaCl 50 mM. Kết quả thu được (hình 3B) cho 
thấy phần protein gắn cột được rửa chiết ra ở 
nồng độ NaCl 400 mM dưới dạng một đỉnh 
lớn, đỉnh này có hoạt tính SOD. Chế phẩm 
SOD1 sau khi sắc ký qua 2 cột trao đổi ion có 
hoạt độ tổng số là 894,5 U và hoạt độ riêng là 
357,8 U/mg protein. Như vậy qua bước này, 
độ sạch của chế phẩm đã tăng lên gấp 31,2 lần 
so với dịch chiết ban đầu (bảng 1). 
Partial purification and characterization 
99 
0
100
200
300
400
500
600
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 5 10 15 20 25
P
ro
te
in
 (
A
2
8
0
)
Số phân đoạn
Protein (A280)
[NaCl] (mM)
Hoạt độ SOD (U)
0
H
o
ạ
t 
đ
ộ
 S
O
D
 (
U
) 
[N
a
C
l]
 (
m
M
) 
600 
400 
200 
100 
500 
300 
0
200
400
600
800
1000
0
2
4
6
8
0 20 40 60 80
P
ro
te
in
 (
A
2
8
0
)
Số phân đoạn
Protein (A280)
Hoạt độ SOD (U)
[NaCl] (mM)
0
SOD1 SOD2
A
H
o
ạ
t 
đ
ộ
 S
O
D
 (
U
) 
900 
700 
500 
300 
100 
[N
a
C
l]
 (
m
M
) 
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 5 10 15 20 25
P
ro
te
in
 (
A
2
8
0
)
Số phân đoạn
Protein (A280)
[NaCl] (mM)
Hoạt độ SOD (U)
0
H
o
ạ
t 
đ
ộ
 S
O
D
 (
U
) 
[N
a
C
l]
 (
m
M
) 
600 
400 
200 
100 
500 
300 
0
200
400
600
800
1000
0
0 20 40 60 80
P
ro
te
in
 (
A
2
8
0
)
ố â oạ
i ( )
 ( )
l] ( )
0
H
o
ạ
t 
đ
ộ
 S
O
D
 (
U
) 
900 
700 
500 
300 
100 
[N
a
C
l]
 (
m
M
) 
B 
Hình 3. Sắc ký đồ của dịch chiết huyết tương tôm sú qua cột trao đổi 
ion DE-52 cellulose pH=8 (A) và qua cột Q-sepharose pH=5 (B) 
Bảng 1. Tóm tắt các bước tinh sạch SOD1 của tôm sú 
Các bước tinh sạch 
Protein tổng số 
(mg) 
Hoạt độ tổng số 
(U) 
Hoạt độ riêng 
(U/mg protein) 
Độ tinh sạch 
(lần) 
Dịch chiết huyết tương 515,8 5911,1 11,5 1 
DE-52 cellulose 40,0 1001,6 25,0 2,2 
Q-Sepharose 2,5 894,5 357,8 31,2 
thường tồn tại ở dạng homodimer hoặc homotetramer được cấu thành từ các 
đơn vị có KLPT giống nhau (Yao et al. 2004). 
1. 
2. Hình 4. SDS-PAGE chế phẩm SOD1 của tôm sú 
 1 2 3 4 5 6 
 + 
25- 
35- 
KDa 
250- 
130- 
100- 
70- 
55- 
Hình 4. SDS-PAGE chế phẩm SOD1 
của tôm sú 
Ghi chú: 1: Thang chuẩn protein; 2: Dịch chiết 
huyết tương; 3: Chế phẩm SOD1 qua cột DE-52 
celluose đã được cô đặc; 4: Phân đoạn không gắn 
cột Q-Sepharose; 5: Phân đoạn đỉnh protein rửa 
chiết cột Q-Sepharose; 6: Phân đoạn có hoạt tính 
SOD rửa chiết qua cột Q-Sepharose. 
Kết quả phân tích SDS-PAGE chế phẩm 
SOD1 của tôm sú (hình 4) cho thấy chế phẩm 
SOD1 qua cột DE-52 celluose vẫn còn chứa 
nhiều băng protein khác nhau, tuy vậy chế 
phẩm SOD1 sau khi qua cột Q-Sepharose chỉ 
cho một băng protein chủ yếu có KLPT xấp xỉ 
24 kDa (đường chạy 6), chứng tỏ các bước sắc 
ký đã cho phép loại bỏ nhiều protein không 
mong muốn và chế phẩm SOD1 là khá tinh 
sạch. Kết quả này gợi ý SOD1 thu nhận được 
là mtMnSOD (GenBank: AGI99530.1) chứa 
220 gốc axit amin tính theo dữ liệu về gen và 
có KLPT tính toán lý thuyết khoảng 24,1 kDa. 
Nhìn chung, các loại MnSOD tinh sạch từ các 
loài khác nhau thường tồn tại ở dạng 
homodimer hoặc homotetramer được cấu 
thành từ các đơn vị có KLPT giống nhau (Yao 
et al. 2004). 
Một số tính chất của SOD1 
Khi tiến hành xác định hoạt độ của SOD1 
ở các nhiệt độ khác nhau, kết quả thu được 
cho thấy, SOD1 thể hiện hoạt động tốt ở 
khoảng 40–50oC, và hoạt động tối thích ở 
45
o
C (hình 5A). Kết quả xác định hoạt độ của 
SOD1 ở các pH khác nhau cho thấy SOD1 
hoạt độ khác nhau không nhiều trong khoảng 
pH từ 5 đến 6, tuy vậy enzyme hoạt động tốt 
nhất ở pH 5,5 (hình 5B). 
Khi bổ sung vào hỗn hợp phản ứng các 
ion kim loại Cu2+, Mn2+, Ca2+ và Zn2+ dưới 
dạng các muối tương ứng (CuCl2, MnCl2, 
CaCl2, ZnCl2) ở nồng độ 5 mM, kết quả xác 
định hoạt độ SOD còn lại (hình 6) cho thấy 
Tran Minh Hien et al. 
100 
Mn
2+ 
có khả năng hoạt hóa SOD1 lên đến 
200%. Kết quả này hoàn toàn đồng nhất với 
nhận định trên đây của chúng tôi cho rằng 
SOD1 thuộc vào nhóm MnSOD. Cu2+ 5 mM 
có khả năng ức chế hơn 50% hoạt độ SOD1, 
trong khi đó Ca2+ và Zn2+ ở nồng độ 5 mM 
hoạt hóa nhẹ SOD1 (tăng khoảng 20% hoạt 
độ). Tính chất này của SOD1 ở tôm sú khác 
với MnSOD tinh sạch từ mô cơ của tôm càng 
sông Macrobrachium nipponense (Yao et al. 
2004), hay Cu,ZnSOD được tinh sạch từ 
huyết tương của tôm càng sông M. nipponense 
(Yao et al., 2007), cụ thể hai SOD của M. 
nipponense đều bị ức chế bởi Ca2+ và Zn2+. 
Đây cũng là một sự khác biệt thú vị của SOD1 
ở tôm sú cần được tiếp tục nghiên cứu. 
Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên hoạt độ SOD1 của tôm sú 
1. nipponense (Yao et al. 2007), cụ thể hai SOD của M. nipponense đều bị ức 
chế bởi Ca2+ và Zn2+. Đây cũng là một sự khác biệt thú vị của SOD1 ở tôm 
sú cần được tiếp tục nghiên cứu. 
2. 
3. Hình 6. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt độ SOD1 tôm sú 
0
50
100
150
200
250
H
o
ạ
t 
đ
ộ
 t
ư
ơ
n
g
 đ
ố
i 
(%
)
Cu2+
Mn2+
Ca2+
Zn2+
Hình 6. Ảnh hưởng của một số ion kim loại 
lên hoạt độ SOD1 tôm sú (Các kim loại Cu2+, 
Mn
2+
, Ca
2+
, Zn
2+
 tại nồng độ 5 mM) 
KẾT LUẬN 
Đã xác định được hoạt độ SOD trong mô 
cơ và trong huyết tương của tôm sú và phát 
hiện thấy hoạt độ riêng của SOD trong huyết 
tương cao hơn trong mô cơ tới 9,2 lần. Có hai 
loại SOD ở trong tôm sú, trong đó trong huyết 
tương có hai loại và trong mô cơ có một loại, 
cả hai đều không bị ức chế bởi H2O2. Đã tinh 
sạch tới mức gần đồng nhất về điện di một 
SOD (SOD1) từ huyết tương tôm sú, SOD1 
hoạt động tối thích ở 45oC; pH 5,5; bị ức chế 
bởi Cu2+, được hoạt hóa mạnh bởi Mn2+ (tăng 
thêm
100% hoạt độ), và Ca2+ và Zn2+ hoạt hóa 
một phần (tăng khoảng 20% hoạt độ). Đây là 
nghiên cứu đầu tiên về tinh sạch và nghiên 
cứu tính chất của SOD1 của tôm sú. 
Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu được thực 
hiện với sự hỗ trợ kinh phí cho Nhóm Nghiên 
cứu mạnh Công nghệ Enzyme và Protein của 
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (năm 
2019) và một phần kinh phí của đề tài 
NAFOSTED, mã số 106.02.2018.07. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Beauchamp C. and Fridovich I., 1971. 
Superoxide dismutase: improved assays 
and an assay applicable to acrylamide 
gels. Anal. Biochem., 44(1): 276−287. 
Bradford M. M., 1976. A rapid and sensitive 
method for the quantitation of microgram 
quantities of protein utilizing the principle 
of protein-dye binding. Anal. Biochem., 
72(1-2): 248−254. 
Brouwer M., Brouwer T. H., Grater W., and 
Brown-Peterson N., 2003. Replacement of 
a cytosolic copper/zinc superoxide 
dismutase by a novel cytosolic manganese 
superoxide dismutase in crustaceans that 
use copper (haemocyanin) for oxygen 
transport. Biochem. J., 374(1): 219−228. 
Partial purification and characterization 
101 
Brouwer M., Brouwer T. H., Grater W., 
Enghild J. J., and Thogersen I. B., 1997. 
The paradigm that all oxygen-respiring 
eukaryotes have cytosolic CuZn-
superoxide dismutase and that Mn-
superoxide dismutase is localized to the 
mitochondria does not apply to a large 
group of marine arthropods. Biochemistry, 
36(43): 13381−13388. 
Fridovich I., 1975. Superoxide dismutases. 
Ann. Rev. Biochem., 44(1):147−159. 
Gómez-Anduro G A., Barillas-Mury C. V., 
Peregrino-Uriarte A. B., Gupta L., 
Gollas-Galvan T., Hermandez-Lopes J., 
Yepiz-Plascencia G., 2006. The cytosolic 
manganese superoxide dismutase from the 
shrimp Litopenaeus vannamei: molecular 
cloning and expression. Develop. Comp. 
Immunol., 30(10): 893−900. 
Hodgson E. K. and Fridovich I., 1975. 
Interaction of bovine erythrocyte 
superoxide dismutase with hydrogen 
peroxide. Inactivation of the enzyme., 
Biochemistry, 14(24): 5294−5299. 
Laemmli U. K., 1970. Cleavage of structural 
proteins during the assembly of the head 
of bacteriophage T4. Nature, 227(4): 
680−685. 
McCord J. M. and Fridovich I., 1969. 
Superoxide dismutase an enzymic 
function for erythrocuprein 
(hemocuprein). J. Biol. Chem., 244(22): 
6049−6055. 
Yao C. L., Wang A. L., Wang W. N., and Sun 
R. Y., 2004. Purification and partial 
characterization of Mn superoxide 
dismutase from muscle tissue of the 
shrimp Macrobrachium nipponense. 
Aquaculture, 241(1-4): 621−631. 
Yao C. L., Wang A. L., Wang Z. Y., Wang 
W. N., and Sun R. Y., 2007. Purification 
and partial characterization of Cu, Zn 
superoxide dismutase from haemolymph 
of Oriental river prawn Macrobrachium 
nipponense. Aquaculture, 270(1): 
559−565.