Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải nitrat trong dưa cải muối chua (Brassica juncea Coss)

12 Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 
PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN PHÂN GIẢI NITRAT 
TRONG DƯA CẢI MUỐI CHUA (Brassica juncea Coss) 
VÕ THỊ XUÂN HƯƠNG1, TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG1 
NGUYỄN NGỌC BẢO CHÂU2, NGUYỄN BẢO QUỐC1,* 
1Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 
2Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh 
*Email: baoquoc@hcmuaf.edu.vn 
(Ngày nhận: 31/07/2018; Ngày nhận lại: 07/10/2018; Ngày duyệt đăng: 15/10/2018) 
TÓM TẮT 
Nghiên cứu được tiến hành thu thập các mẫu dưa cải (Brassica juncea Coss) tại chợ Thủ 
Đức – Thành phố Hồ Chí Minh, sau đó xác định hàm lượng nitrat theo ngày ủ chua bằng phương 
pháp so màu với Natri salixylat. Từ 10 mẫu dưa cải khác nhau được thu thập tại chợ tiến hành 
phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân giải nitrat trên môi trường đặc trưng Giltay chứa 
cơ chất là KNO3, kết hợp với kiểm tra các đặc tính sinh hóa của các chủng phân lập được, kết 
quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng nitrat của 10 mẫu dưa cải trên thị trường cho thấy hàm lượng 
nitrat không đạt tiêu chuẩn có hàm lượng 2.000 – 5.000 mg/kg theo quy định của Tổ chức Y tế 
thế giới (WHO) ở các ngày thứ nhất, hai và ba trong thời gian lên men và chỉ tiêu đạt tiêu chuẩn 
sau 4 và 5 ngày lên men. Quá trình phân lập vi sinh phản nitrat đã sàng lọc được 6 dòng vi khuẩn 
có khả năng khử nitrat trên môi trường Giltay và tuyển chọn 2 dòng vi khuẩn có khả năng khử 
nitrate cao khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể nitrat. Kết quả khảo sát hàm lượng nitrat trong 
dưa cải ở các mẫu bổ sung vi khuẩn M1, M2 cho thấy hàm lượng nitrate thấp hơn so với những 
mẫu không bổ sung vi khuẩn. Tiến hành giải trình tự, so sánh và phân tích phả hệ thư mục di 
truyền phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-joining xác định loài vi khuẩn có khả năng 
chuyển hóa nitrate là Bacillus aryabhattai. 
Từ khóa: Bacillus aryabhattai; Cải muối chua; Vi khuẩn phân giải nitrate. 
Isolation and identification of the denitrifying bacteria from fermented cabbage 
(Brassica juncea Coss) 
ABSTRACT 
The study was conducted to evaluate the nitrate reduction in fermented mustard cabbage and 
determine the nitrate level during the fermentation process. A total of 10 samples of fermented 
mustard cabbage were collected from some retailers at Thu Duc market. The samples were used 
to determine the nitrate concentration using color compared with sodium salicylate. Then we 
isolated and cultured the strains of nitrate-reducing bacteria in a specific Giltay medium 
containing KNO3, as well as testing biochemical characteristics. The cabbage was fermented 
with additional nitrate-decomposing bacteria and the nitrate concentration was compared with 
the control treatment. The experimental results showed that the nitrate level of the 10 collected 
Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 13 
samples of fermented cabbage varied between 2.000 – 5.000mg/kg, exceeding the allowable 
level of the World Health Organization (WHO), during the three first days of the fermentation. 
The standard indicators were achieved after 4 and 5 days of the fermentation. In this study, we 
isolated at least 6 bacterial strains capable of reducing nitrate in a Giltay medium and selected 
two bacterial strains from others. The results of sequencing, identification and phylogenetic 
analysis based on NJ method showed that two strains of denitrifying bacteria are Bacillus 
aryabhattai. 
Keywords: Bacillus aryabhattai; Denitrifying bacteria; Fermented cabbage. 
1. Đặt vấn đề 
Dưa cải muối chua là một loại rau lên 
men truyền thống ở Việt Nam từ cải bẹ dưa 
muối (Brassica juncea Coss), hệ vi sinh 
khuẩn acid lactic trong loại rau lên men này bị 
ảnh hưởng bởi các quá trình lên men khác 
nhau và điều kiện môi trường, (Chao và cộng 
sự, 2013). Đối với các loại rau cải thường sử 
dụng phân đạm urê để chăm bón, quá trình lên 
men sẽ khiến hàm lượng nitrat có trong rau bị 
khử thành nitrite. Quá trình lên men nitrat 
trong mô thực vật chuyển thành nitrite, nồng 
độ nitrite tăng theo thời gian, tăng cao trong 
vài ngày đầu và giảm dần khi dưa đã vàng và 
tăng cao trở lại khi dưa bị hư hỏng (Spoelstra, 
1985; Park and Cheigh, 1992). Số lượng nhiều 
nitrat tiêu thụ gián tiếp qua thực phẩm có thể 
gây hại cho sức khỏe (Leszczynska và cộng 
sự, 2009; Chan, 2011). Trong hệ thống tiêu 
hóa, nitrat có thể chuyển đổi thành nitrit do đó 
phản ứng với các amin sản xuất các hợp chất 
N-nitroso như Nitrosamin có khả năng gây 
ung thư ở dạ dày (Yordanov và cộng sự, 
2001; Santamaria, 2006). Nitrit còn là một 
trong những chất chuyển biến oxyhemoglobin 
thành chất không hoạt động được gọi là 
Methemoglobin làm giảm quá trình vận 
chuyển oxy trong máu (Greer and Shannon, 
2005; Lê Thị Kim Tiến và Nguyễn Văn Ly, 
2012). Đặc biệt, rau lên men nằm trong danh 
sách của tổ chức Y tế thế giới cảnh báo có 
chất gây ung thư (World Health Organization, 
2012). 
Quá trình lên men lactic trong rau quả 
muối chua là kết quả hoạt động của một số vi 
khuẩn và một số nấm men, ví dụ như trong 
bắp cải hoạt động mạnh là Bacillus brassicae 
fermentati, Lactobacillus brevis, Leuconostoc 
mesenteroides, Luteimonas cucumeris và 
Lactobacillus pentoaceticus. Quá trình lên 
men lactic còn có thể gây ra bởi B. leichmani, 
B. beyerincki, B. ventricoccus và một số vi 
sinh vật khác. Các vi sinh vật lactic có hoạt 
động khác nhau nên cường độ lên men lactic 
của sản phẩm phụ thuộc vào hệ vi sinh vật có 
trong đó. Dạng của hệ vi sinh vật cũng ảnh 
hưởng tới tính chất đặc trưng của sản phẩm 
cuối cùng của quá trình phân hủy đường 
(Quách Đĩnh và cộng sự, 2008). 
Quy trình lên men làm dưa cải muối chua 
bán ra thị trường ở Việt Nam được thực hiện 
khác nhau tuỳ theo vùng, miền, và nếu sản 
phẩm bán trên thị trường được lên men không 
đúng quy trình sẽ gây nguy hiểm đến sức 
khoẻ của con người. Do đó, việc loại bỏ hoặc 
làm giảm nitrat trong thực phẩm trước khi đưa 
vào sử dụng là rất cần thiết. Nghiên cứu nhằm 
mục đích phân lập, tuyển chọn và định danh 
các dòng vi khuẩn phân giải được hàm lượng 
nitrat có trong dưa muối chua và ứng dụng 
chúng để lên men dưa muối chua tại chợ Thủ 
Đức, TP.HCM. 
2. Vật liệu và Phương pháp 
2.1. Vật liệu 
- Nguyên liệu: 10 mẫu dưa cải mới muối 
chua trong vòng 24h sử dụng trong nghiên 
cứu được thu mua ngẫu nhiên tại một số địa 
điểm ở chợ Thủ Đức. 
- Hóa chất: Chất chuẩn KNO3: sấy khan 
không lẫn nitrite, nước cất, Natri salixilat, 
H2SO4 đậm đặc, C4H4KNaO6.4H2O, NaOH. 
- Môi trường nuôi cấy và phân lập: Môi 
14 Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 
trường Giltay; môi trường O/F (môi trường 
phát hiện khả năng oxy hóa hoặc lên men 
glucose); môi trường VP-MR (môi trường 
phát hiện các sản phẩm acid từ quá trình 
chuyển hóa glucose); môi trường urea (phát 
hiện enzyme urease); môi trường phenol red 
lactose broth (khả năng lên men lactose); môi 
trường nutrient agar (thử khả năng di động). 
- Phương pháp nhuộm Gram, khử nitrat, 
di động, Oxidase, hoạt tính catalase, lên men 
glucose, lên men lactose, sử dụng citrate, sinh 
indole, tan chảy gelatinenase. 
- Hóa chất ly trích DNA, thực hiện phản 
ứng và chạy điện di sản phẩm PCR. Dung 
dịch đệm TE Buffer (pH=8), CH3COONa 3M, 
cồn 99%, Ethanol 70%, nước cất khử ion. 
PCR buffer 0,5 X, Gotaq green Master Mix 
(Promerga, USA) MgCl2 2 mM, Mỗi dNTP 
200µM, mồi xuôi 0,5µM, mồi ngược 0,5µM, 
Taq DNA polymerase 1 IU, Agarose 1%, 
TBE (Tris borate EDTA) (pH=8) 0,5 X, thuốc 
nhuộm Blue gel loading buffer 6x. 
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
2.2.1. Thu thập mẫu 
Cách tiến hành: 10 mẫu dưa cải được mua 
về để trong hũ nhựa 1 lít đã được vô trùng. 
Mỗi mẫu dưa cải đem phân tích được lặp lại 3 
lần và khảo sát hàm lượng nitrat liên tục trong 
5 ngày sau khi ủ chua 1 ngày theo phương 
pháp so màu với natrisalicylate. 
2.2.2. Khảo sát hàm lượng nitrat trong 
mẫu dưa cải muối chua bằng phương pháp so 
màu với Natri salicylate 
Hợp chất nitrat trong mẫu phản ứng với 
Natri salixylate trong môi trường axit cho một 
phức có màu vàng của muối axit 
nitrosalixylic. Sau đó đo độ hấp thụ quang ở 
bước sóng 410 nm. Phương pháp xác định 
theo TCVN 4562-88. 
2.2.3. Phân lập, tuyển chọn và kiểm tra 
chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrat 
trong dưa cải muối chua 
Lấy 10 mẫu dưa cải đã được thu mua, pha 
loãng các mẫu nước dưa cải ở các nồng độ 
102, 10-3, 10-4, 10-5 bằng nước cất vô trùng. 
Cho 15ml môi trường thạch đặc trưng Giltay 
đã tiệt trùng vào đĩa petri. Dùng micropipet 
hút 0,1ml mẫu nước dưa cải pha loãng 10-5 
dàn đều trên mặt thạch bằng que gạt thủy tinh 
vô trùng. Sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 
24 giờ. Chọn lọc những khuẩn lạc tròn, có 
màu trắng sữa, đục, có khả năng mọc trên môi 
trường nuôi cấy, tiến hành cấy phân lập và 
làm thuần cũng trên môi trường Giltay 
(Nguyễn Hoài Hương, 2009). Các chủng sau 
khi được làm thuần và được hoạt hóa trên môi 
trường thạch nghiêng ủ ở nhiệt độ phòng 
trong thời gian 18-24 giờ. Sau đó, thực hiện 
nhuộm Gram và thử khả năng khử nitrat bộ 
test NO3. Lựa chọn 2 chủng vi khuẩn có khả 
năng chuyển hóa nitrat cao nhất. 
Các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển 
hóa nitrat trên môi trường Giltay, được nuôi 
cấy trong môi trường dịch thể nitrat, lần lượt 
thực hiện các thử nghiệm sinh hóa: thử 
nghiệm di động, catalase, oxydase, thử 
nghiệm O/F, lên men lactose, len men 
glucose, thử nghiệm citrate, indole, VP, 
gelatine, thử nghiệm urea. Việc kiểm tra thêm 
các đặc tính sinh hóa khác sẽ giúp ích cho 
việc định danh các chủng phân lập được. Vi 
khuẩn sẽ được phân loại dựa theo khoá phân 
loại của Bergey, 1957. 
2.2.4. Bổ sung vi khuẩn vào quy trình 
muối chua dưa cải và xác định hàm lượng 
nitrat trong mẫu dưa cải bằng phương pháp 
so màu với natrisalicylate 
Thí nghiệm được bố trí nhằm đánh giá 
khả năng khử nitrat trong dưa cải của các 
chủng phân lập được. Các nghiệm thức được 
bố trí trong hũ nhựa 1 lít, mỗi hũ chứa 500g 
dưa cải. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức (NT): 
3 nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn chuyển 
hóa nitrat và một nghiệm thức đối chứng, mỗi 
nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thông qua quá trình 
khảo sát quy trình muối chua dưa cải ở quanh 
khu chợ Thủ Đức đồng thời tham khảo các tài 
liệu liên quan. Tiến hành muối chua dưa cải 
với thời gian thử nghiệm là 5 ngày. 
Nghiệm thức 1 (ĐC): muối dưa cải không 
Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 15 
bổ sung vi khuẩn. 
Nghiệm thức 2: bổ sung 1ml (106 - 107 
cfu/ml) canh trường chủng M1. 
Nghiệm thức 3: bổ sung 1ml (106 - 107 
cfu/ml) canh trường chủng M2. 
Nghiệm thức 4: bổ sung kết hợp 0,5 ml 
canh trường chủng M1 và 0,5ml canh trường 
chủng M2 có mật độ khoảng 106 - 107 cfu/ml. 
Cách tiến hành: Môi trường dịch thể 
nitrat (Trần Linh Thước, 2002) được chuẩn bị 
trong 2 bình tam giác 250ml với 100ml môi 
trường/bình và được hấp khử trùng ở 121oC 
trong 20 phút. Cấy chủng M1 và M2 từ ống 
thạch nghiêng vào môi trường đã chuẩn bị, 
mang đi lắc ở nhiệt độ 37oC với tốc độ lắc 100 
vòng/phút trong 48 giờ. Canh trường vi khuẩn 
sau 48 giờ nuôi cấy thu dịch dùng để bổ sung 
vào các nghiệm thức đồng thời xác định mật 
độ vi khuẩn tại thời điểm sau 48h. 
- Phương pháp xác định hàm lượng nitrat 
sau khi muối chua dưa cải bằng phương pháp 
so màu với natrisalycilate theo TCVN 4562-
88, tiến hành khảo sát liên tục trong 5 ngày. 
- Phương pháp đánh giá các thông số môi 
trường thí nghiệm: tiến hành đo pH 1 lần/ngày 
vào lúc 8 giờ bằng máy đo pH. Mẫu dưa cải 
được đánh giá vào 2 thời điểm sau ngày lên 
men thứ nhất và thứ năm để xác định lượng 
acid tổng số bằng phương pháp chuẩn độ 
Therne. 
- Xác định mật độ tế bào vi khuẩn chuyển 
hóa nitrat ở ngày thứ nhất và thứ năm sau khi 
muối dưa. 
2.3. Phương pháp phân tích 
2.3.1. Xác định hàm lượng nitrat trong 
dưa cải muối chua 
Công thức xác định hàm lượng nitrate 
dựa vào phương trình đường chuẩn nitrate 
bằng phương pháp quang phổ UV-Vis. Hàm 
lượng nitrat trong 1 kg dưa cải được tính theo 
công thức như sau (mg/kg): 
Cx nồng độ NO3- tính theo đường chuẩn 
(mg/l); Vđm1 là thể tích định mức - 400ml; 
Vđm2 là thể tích định mức khi cho thuốc thử - 
13ml; K độ pha loãng – 20; m khối lượng mẫu 
phân tích - 50g; n là thể tích hút mẫu để đo 
OD, 5ml. 
2.3.2. Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật 
sinh học phân tử 
 Tách chiết DNA vi khuẩn bằng phương 
pháp đun sôi: Mẫu vi khuẩn được nuôi cấy 
tăng sinh ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Sau đó 
hút 1ml tăng sinh vi khuẩn cho vào ống tube 
eppendorf 1,5ml ly tâm 8000 vòng/phút trong 
3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy thu kết tủa. Sau 
đó thêm 300µl TE buffer, votex để trộn đều tế 
bào vi khuẩn. Cho vào nồi nước đang sôi ở 
100oC trong vòng 15 phút. Sau đó sốc nhiệt ở - 
20oC trong 5 phút và ly tâm 13000 vòng/phút 
trong 5 phút. Tiếp tục hút 200µl dung dịch nổi 
phía trên cho vào ống tube 1,5ml mới, cho 
thêm 20µl CH3COONa, 600µl Etanol 70% ủ 
trong tủ - 20oC trong 1 đến 2 giờ. Ly tâm 
13000 vòng/phút, bỏ dịch nổi để khô trong 10 
phút ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng cho thêm 
50µl TE buffer hoặc nước cất khử ion. Bảo 
quản mẫu DNA ở - 20oC. 
Phản ứng tiến hành với cặp mồi không 
chuyên biệt nhằm khuếch đại vùng gen 
16SrRNA16S-rRNA-F(5′-AGAGTTTGATC 
CTGGCTCAG-3');16S-rRNA-R(5′-AAGG 
AGGTGATCCAGCCGCA-3′) (Rezaee và 
cộng sự, 2010). Thực hiện phản ứng PCR với 
tổng thể tích 25µl: 1,25µl primer-F; 1,25µl 
primer-R; 1µl mẫu DNA; 12,5µl GoTaq 
polymerase vào ống tube PCR. Bổ sung thêm 
9µl nước cất khử ion. Tất cả đều được trộn 
đều trước khi thực hiện phản ứng PCR. Quy 
trình chạy phản ứng PCR theo chương trình 
luân nhiệt như sau: 95oC trong 4 phút, sau đó 
lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: Biến 
tính 95oC trong 30 giây, bắt cặp mồi ở 53oC 
trong 30 giây, tổng hợp DNA ở 72oC trong 1 
phút. Cuối cùng phản ứng duy trì ở 72oC 
trong 5 phút. Bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR 
được điện di trên gel agarose 1%, trong dung 
dịch đệm TBE buffer 0,5 X ở 100V, 90 mA 
trong 20 phút. Trộn đều mẫu và loader với tỉ 
16 Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 
lệ: 0,5µl loadingdye buffer 6X và 5µl sản 
phẩm PCR vào trong các giếng của gel và 
được chụp bằng máy đọc và chụp ảnh gel 
MultiDa-lt Digital Imaging System. Thang 
chuẩn 100 bp được mua từ công ty Fermentas. 
Sản phẩm PCR vùng 16S-rRNA được gửi 
giải trình tự tại công ty First Base, Malaysia. 
Trình tự của sản phẩm PCR được so sánh với 
trình tự 16S rRNA của các loài vi khuẩn 
Bacillus khác trên ngân hàng gen bao gồm: 
B.firmus (HQ397586.1); B. thuringiensi ... mẫu phân tích. Thông 
thường người tiêu dùng đều sử dụng dưa cải 
trong khoảng 48 hoặc 72 giờ lên men. Như 
vậy, khả năng người tiêu dùng bị ngộ độc 
hoặc mắc bệnh rất cao nếu ăn liên tục dưa cải 
Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 17 
trong thời gian đó, do đó khuyến cáo mọi 
người nên bắt đầu sử dụng dưa cải vào thời 
điểm sau 96 giờ hoặc 120 giờ lên men. Nhưng 
điều này lại không có khả thi vì dưa cải sau 
khi lên men 48 giờ đến 72 giờ đã đạt được độ 
chua, giòn, màu sắc đặc trưng của sản phẩm 
muối chua. Sau 96 giờ đến 120 giờ lên men 
mà hàm lượng nitrat nằm ở mức an toàn thì 
chất lượng cảm quan của sản phẩm lại không 
tốt, dưa quá chua hoặc không còn mùi thơm 
đặc trưng. Vì vậy, phân lập chủng vi khuẩn 
chuyển hóa nitrat để bổ sung vào dưa cải 
muối chua làm giảm hàm lượng nitrat trong 
dưa cải là một điều cần thiết. 
3.2. Kết quả phân lập, tuyển chọn và 
kiểm tra chủng vi khuẩn có khả năng 
chuyển hóa nitrat trong dưa cải muối chua 
Từ 10 mẫu dưa cải thu thập được ở các 
địa điểm tại chợ Thủ Đức tiến hành phân lập 
và đếm các chủng vi khuẩn chuyển hóa 
nitrat trên môi trường Giltay với cơ chất 
KNO3 và ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dựa 
vào đặc điểm khuẩn lạc đã phân lập được 6 
chủng vi khuẩn khử nitrat trên môi trường 
Giltay từ 10 mẫu dưa cải. Các chủng phân 
lập được ký hiệu thứ tự M1, M2, M3, M4, 
M5, M6. Đặc điểm các khuẩn lạc phân lập 
trên môi trường Giltay. 
Bảng 1 
Đặc tính các khuẩn lạc phân lập trên môi trường Giltay 
Chủng phân lập Đặc điểm khuẩn lạc 
M1 Màu trắng đục, tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm 
M2 Màu trắng sữa, tròn, bề mặt lồi, bóng, ướt 
M3 Màu trắng đục, tròn nhỏ, lồi 
M4 Màu trắng sữa, nhỏ, lồi 
M5 Màu trắng đục, tròn dẹp, có vòng đậm màu trên bề mặt, khô 
M6 Màu trắng sữa, lồi, rìa khuẩn lạc không đều 
Hầu hết các khuẩn lạc phân lập trên môi 
trường Giltay đều có màu trắng sữa hoặc 
trắng đục, tròn lồi hoặc dẹp, thể hiện sự 
phong phú của các chủng vi khuẩn chuyển 
hóa nitrat (Nguyễn Thị Tuyền và cộng sự, 
2009). 
Bảng 2 
Đặc điểm nhuộm Gram của các mẫu được phân lập 
Chủng Gram Hình thái Kích thước 
M1 + Que 1,5 – 2 
M2 + Que 1 – 1,5 
M3 - Que 1 – 1,5 
M4 + Que 1 – 1,5 
M5 - Cầu 0,5 – 1 
M6 - Que 0,5 – 1 
18 Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 
Kết quả nhuộm Gram 6 chủng vi khuẩn 
khử nitrat trên môi trường Giltay cho thấy các 
chủng vi khuẩn M3, M6 có đặc điểm là trực 
khuẩn Gram (-), ba chủng M1, M2 và M4 là 
trực khuẩn Gram (+) và M5 là cầu khuẩn 
Gram (-). 
 b 
(a) (b) (c)
Hình 2. Kết quả nhuộm Gram. (a) trực khuẩn Gram +; (b) cầu khuẩn Gram -; 
(c) trực khuẩn Gram – (độ phóng đại 100x) 
Nhằm tìm ra chủng có khả năng khử 
nitrat cao nhất để bổ sung vào dưa cải, tiến 
hành sàng lọc bằng phản ứng khử nitrat với bộ 
test NO3. Sau khi nuôi cấy trên môi trường 
dịch thể nitrat trong 24 giờ, thử khả năng khử 
nitrat của 6 chủng bằng bộ test NO3 Sera dựa 
trên nguyên tắc so màu. Khi cho thuốc thử 
vào canh khuẩn nhận thấy hai chủng M1 và 
M2 có màu nhạt nhất trong 6 chủng, điều này 
chứng tỏ khả năng khử nitrat 2 chủng này cao 
hơn so với các chủng còn lại. 
Hai chủng M1 và M2 được chọn để tiếp 
tục thực hiện các thử nghiệm sinh hóa. Kết 
quả được thể hiện trong Bảng 3 như sau: 
Bảng 3 
Một số phản ứng sinh hóa dùng để định danh chủng M1 và M2 
Thử nghiệm 
Kết quả 
M1 M2 
Gram, hình thái dương, hình que dương, hình que 
Khử nitrate + + 
Di động + + 
Oxidase + - 
Hoạt tính catalase + + 
Urease + + 
O/F + + 
Lên men glucose + + 
Lên men lactose - - 
Sử dụng citrate + + 
Sinh indole - - 
MR + + 
VP + - 
Tan chảy Gelatinenase + + 
Chú thích: + (dương tính); - (âm tính) 
Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 19 
Theo Franklin và David (2004) thì nhóm 
vi khuẩn khử nitrat thường là các vi khuẩn 
khử: Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas, 
Paracoccus, Spirillum, và Thiobacillus, 
Achromobacterium, Denitrobacillus, Micrococcus, 
Xanthomonas đều có khả năng khử nitrat và 
phản ứng catalase (+). Chủng M1, M2 dương 
tính với hai phản ứng này, do đó dựa vào đặc 
điểm hình thái khuẩn lạc có màu trắng đục, 
tròn, rìa răng cưa không đều, là trực khuẩn 
Gram (+) thì chủng M1, M2 có thể là Bacillus 
spp. Dựa theo phương pháp nhận diện các 
chủng vi sinh vật thì chủng M1, M2 có kết quả 
sinh hóa: Gram (+), trực khuẩn, khả năng di 
động (+), Catalase (+), thử nghiệm O/F (+/-), 
lên men lactose (-) điều này đúng với nghiên 
cứu của Ray và cộng sự, (2012), Dunca và 
cộng sự, (2005). 
3.3. Bổ sung vi khuẩn vào quy trình 
muối chua dưa cải và xác định hàm lượng 
nitrat trong mẫu dưa cải bằng phương pháp 
so màu với natrisalicylate 
Các mẫu dưa cải từ các nghiệm thức sau 
khi được ly trích tiến hành xác định hàm lượng 
nitrat bằng phương pháp so màu với Natri 
salicylate. Kết quả được thể hiện ở Bảng 4: 
Bảng 4 
Hàm lượng nitrat trong thời gian lên men 
Nghiệm Nồng độ nitrat (mg/kg) 
thức Đối chứng Bổ sung M1 Bổ sung M2 Bổ sung M1, M2 
24 giờ 2402,70a 2071,00ab 2312,30a 1850,2b 
48 giờ 1641,60a 1382,30b 1254,10b 717,40c 
72 giờ 818,38a 554,90b 684,13ab 512,85b 
96 giờ 554,92a 442,40b 406,47b 280,90c 
120 giờ 267,850a 249,41a 221,03b 227,25b 
Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp. Trong cùng một hàng, các giá trị trung bình có 
ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05) 
Kết quả thí nghiệm khảo sát hàm lượng 
nitrat trong dưa cải được trình bày trong Bảng 
4, có ba nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn sau 
24 giờ lên men vẫn ở nồng độ cao trên 1500 
mg/kg, bắt đầu giảm mạnh sau 48 và 72giờ 
lên men, tiếp tục giảm từ từ vào những thời 
điểm lên men sau 96 và 120 giờ tiếp theo. Khi 
chuyển vi khuẩn chuyển hóa nitrate từ môi 
trường dịch thể nitrate vào quy trình muối 
chua mới theo truyền thống thì vi khuẩn sẽ 
phát triển chậm để thích nghi trong khoảng 
thời gian ngắn (pha lag). Cùng thời gian ấy, vi 
khuẩn lactic hoạt động mạnh tạo acid lactic 
cho quá trình lên men đã làm giảm pH, điều 
này làm giảm mức độ khử nitrat của hai chủng 
bổ sung vào. Điều này đúng với nghiên cứu 
của Cavigelli và Robertson (2000), Stensel 
and Horne (2000). Hàm lượng nitrat của các 
nghiệm thức bổ sung M1, bổ sung M2, bổ 
sung kết hợp M1 và M2 giảm nhanh và đạt 
ngưỡng cho phép ngay tại thời điểm dưa bắt 
đầu sử dụng được tức sau 48 giờ lên men thì ở 
mẫu đối chứng hàm lượng nitrat có giảm 
nhưng vẫn ở mức cao so với ngưỡng cho 
phép. Điều này chứng tỏ các mẫu có bổ sung 
vi khuẩn cho kết quả tốt hơn những mẫu 
không bổ sung vi khuẩn. Đồng thời ở thời 
điểm này, dưa đã đạt chất lượng cảm quan, có 
màu vàng, chua dịu và hương thơm đặc trưng 
lại phù hợp với thời gian các tiểu thương đem 
bán ra thị trường. Ba nghiệm thức có bổ sung 
vi khuẩn: M1; M2; M1 và M2 cũng có sự 
khác biệt về hàm lượng nitrat theo thời gian 
24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. 
20 Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 
Nghiệm thức kết hợp cả hai chủng M1, M2 
cho hiệu quả cao nhất so với các nghiệm thức 
bổ sung riêng lẻ từng chủng M1 và M2. Vì 
vậy, chọn nghiệm thức này để áp dụng cho 
quy trình muối chua dưa cải có bổ sung vi 
khuẩn khử nitrat. 
3.4. Kết quả định danh bằng kỹ thuật 
sinh học phân tử 
Quy trình tách chiết DNA tổng số của vi 
khuẩn mẫu M1, M2 từ dưa cải muối chua 
được ly trích bằng phương pháp đun sôi 
(Costa và ctv., 2010), cho kết quả tách chiết 
ổn định, lượng DNA tinh sạch với tỉ lệ 
260/280 = 1,9 (tỉ lệ 260/280 = 1,8 – 2 là thích 
hợp). Sau đó, tiến hành thực hiện phản ứng 
PCR và điện di sản phẩm PCR mẫu DNA của 
M1, M2. Kết quả cho thấy rằng có sự hiện 
diện gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn 
chuyển hóa nitrate lần lượt là M1, M2. Chủng 
vi khuẩn chuyển hóa nitrat M1 được định 
danh bằng phương pháp giải trình tự cho tiểu 
phần ribosome 16S. Trình tự được tra cứu trên 
ngân hàng gen của NCBI thông qua chương 
trình BLAST và dựa vào sự tương đồng trong 
trình tự của đoạn gen để định danh đến loài. 
Kết quả cho thấy, trình tự DNA 16S của 
chủng M1 khi đối chiếu với trình tự gen của 
chủng Bacillus aryabhattai IHB B 7238 16S 
ribosomal RNA ở ngân hàng gen có độ tương 
đồng đạt đến 99%. Vì vậy, chủng M1 tương 
đồng với loài Bacillus aryabhattai. Tương tự 
như vậy, trình tự DNA 16S của chủng M2 khi 
đối chiếu với trình tự gen của chủng Bacillus 
megaterium Jz11 16S ribosomal RNA ở ngân 
hàng gen có độ tương đồng đạt đến 100%. Vì 
vậy, chủng M2 tương đồng với loài Bacillus 
megaterium. Bên cạnh đó, kết quả phân tích 
phả hệ phân tử trên cây phát sinh loài 
Neighbor-joining với giá trị bootstrap 1000 
lần cho thấy M1 và M2 thuộc giống Bacillus, 
loài Bacillus aryabhattai (Hình 3). 
Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium, 
Bacillus aryabhattai được ứng dụng rộng rãi 
trong công nghệ sinh học, thực phẩm, dược 
phẩm và các ngành công nghiệp khác như: 
Bacillus megaterium một loại vi khuẩn sản xuất 
các enzyme thủy phân amylase, protease, 
chitanase, phytase v.v... (Alippi và Reynaldi, 
2006; Padgham và Sikora, 2007; Vary và cộng 
sự, 2007). Trong công nghệ sinh học, Bacillus 
megaterium dùng làm phân bón vi sinh. Bacillus 
aryabhattai tổng hợp peptide, quản lý chất thải 
từ các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm 
khác nhau (Sharma và cộng sự, 2014). 
 subtilis(KP699121.1)
 tequilensis(HF562894.1)
 Pseudomonas putida(EU833948.1)
 vallismortis(KT216619.1)
 amyloliquefaciens(KR010178.1)
 methylotrophicus(KT216570.1)
 licheniformis(KT274776.1)
 sonorensis(KP296232.1)
 cereus(KR709243.1)
 pumilus(KT273321.1)
 safensis(KP940383.1)
 drentensis(KM041133.1)
 infantis(KT719573.1)
 firmus(HQ397586.1)
 thuringiensis(KJ000207.1)
 megaterium(KF419123.1)
 aryabhattai(KP706808.1)
 Mu M1
 Mu M277
44
100
61
79
100
46
100
98
100
99
98
87
69
66
88
Hình 3. Cây thư mục di truyền phát sinh loài dựa trên trình tự 16S rRNA được xây dựng bằng 
phần mềm MEGA 6.06, theo phương pháp Neighbor-joining với độ lặp lại là 1000 lần. 
Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 21 
4. Kết luận 
Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy 
các mẫu dưa cải được thu thập có hàm lượng 
nitrat không đạt tiêu chuẩn theo quy định 
của Tổ chức Y tế thế giới. Bên cạnh đó 
chúng tôi đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn 
chuyển hóa nitrat và tuyển chọn được 2 
chủng M1 và M2 có khả năng xử lý nitrat 
cao nhất trên môi trường Giltay. Kết quả 
khảo sát hàm lượng nitrat trong dưa cải ở 
các mẫu bổ sung vi khuẩn M1, M2 cho thấy 
hàm lượng nitrat thấp hơn so với những mẫu 
không bổ sung vi khuẩn. Ngoài ra, kết quả 
định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử 
bằng bộ kit Promega với 2 chủng M1 và M2 
có kích thước tương ứng là 1153 bp 509bp, 
kết hợp phân tích kết quả truy vấn tự động 
trên NCBI (Blast) và phân tích phả hệ phân 
tử trên cây phát sinh loài Neighbor-joining 
định danh hai sản phẩm M1 và M2 là 
Bacillus aryabhattai. Do đó, việc mở rộng 
nghiên cứu ra nhiều khu vực hoặc các tỉnh 
khác để làm phong phú nguồn vi khuẩn 
chuyển hóa nitrat phục vụ cho quá trình 
nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực công 
nghiệp thực phẩm là cần thiết 
Tài liệu tham khảo 
Chan T. Y. K., (2011). Vegetable-borne nitrate and nitrite and the risk of methaemoglobinaemia. 
Toxicology Letters, 200(1-2), 107-108. 
Chao Shiou-Huei, Ruei-Jie Wu., Koichi Watanabe, & Ying-Chieh Tsai (2013). Diversity of 
lactic acid bacteria insuan-tsaiandfu-tsai, traditional fermented mustard of Taiwan. 
International Journal of Food Microbiology, 135, 203–210. 
 Costa K., Navarro J., Shock E.L., Zhang C., Soukup D., & Hedlund B. (2009). Microbiology 
and geochemistry of great boiling and mud hot springs in the United States Great Basin. 
Extremophiles, 13, 447- 
Greer F. R., & Shannon M. D., (2005). American Academy of Pediatrics Committee on Nutrition 
& American Academy of Pediatrics Committee on Environmental Health. Infant 
methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics, 116(3), 
784-786. 
Huỳnh Văn Tiền, Cao Ngọc Điệp, Trương Trọng Ngôn (2015). Tối ưu hóa khả năng tổng hợp 
chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S và thử nghiệm xử lý 
nước thải sau Biogas từ trại chăn nuôi heo. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 
Phần B: Nông Nghiệp, Thủy sản và Công nghệ sinh học, 37(1), 32-41. 
Lê Thị Kim Tiến và Nguyễn Văn Ly (2012). Phân tích và đánh giá hàm lượng nitrat, nitrit trong 
một số thực phẩm chế biến lưu hành ở thành phố Huế. Tạp chí khoa học Đại học Huế, tập 
74B, 5, 185-191. 
Leszczynska T., Filipiak-Florkiewicz A., Ciéslik E., & Sikora E., (2009). Effects of some 
processing methods on nitrate and nitrite changes in cruciferous vegetables. Journal of Food 
Composition and Analysis, 22(4), 315-321. 
Nguyễn Hoài Hương (2009). Giáo trình thực hành vi sinh ứng dụng. Trường ĐH Kỹ Thuật Công 
Nghệ TP. Hồ Chí Minh. 
22 Võ T. X. Hương và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 62(5), 12-22 
Park K. Y., & Cheigh H. S. (1992). Kimchi and nitrosamines. Korean Journal of Food Nutrition, 
21, 109-116. 
Phạm Thị Tuyết Ngân, (2011). Ứng dụng các dòng Bacillus sp. có ích trong nuôi trồng thủy sản. 
Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. <URL:  
NewsDetail.aspx?newsId=1097>. 
Rezaee A., Godini H., Dehestani S.,& Kaviani S. (2010). Isolation And Characterization Of A 
Novel Denitrifying Bacterium With High Nitrate Removal: Pseudomonas Stutzeri. Iran. J. 
Environ. Health. Sci. Eng., 7(4), 313-318. 
Santamaria P. (2006). Nitrate in vegetables: toxicity, content, intake and EC regulation (review). 
Journal of the Science of Food and Agriculture, 86(1), 10-17. 
Semanti Ray, & Al. (2012). Bioscience discovery, 3(1), 138-145. 
Spoelstra S. F. (1985). Nitrate in silage. Grass and Forage Science, 40(1), 1-11. 
Tamura K., & S. Kumar (2002). Evolutionary distance extimationunder heterogenous 
substitution patterns among lineages. Molecular Biology and Environment, 19, 1727-1736. 
Trần Linh Thước (2002). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. 
Nhà xuất bản giáo dục, TP.HCM, 232 trang. 
World Health Organization (WHO) (2012). Agents classified by the International Agency for 
Research on Cancer (IARC) Monographs, list of Classifications by cancer sites with 
sufficient or limited evidence in humans, Vols 1. 
Yordanov N. D., Novakova E., & Lubenova S. (2001). Consecutive estimation of nitrate and 
nitrite ions in vegetables and fruits by electron paramagnetic resonance spectrometry. 
Analytica Chimica Acta, 437(1), 131-138.