Lên men ethanol từ dịch ép mía sử dụng nấm men chịu nhiệt

 ISSN: 1859-2171 
e-ISSN: 2615-9562 
TNU Journal of Science and Technology 202(09): 185 - 192 
 Email: jst@tnu.edu.vn 185 
LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH ÉP MÍA SỬ DỤNG NẤM MEN CHỊU NHIỆT 
Huỳnh Xuân Phong*, Hà Phú Quý, Nguyễn Ngọc Thạnh, 
Bùi Hoàng Đăng Long, Ngô Thị Phương Dung 
Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ 
TÓM TẮT 
Việc sử dụng nấm men chịu nhiệt trong sản xuất ethanol là một hướng đi có tiềm năng lớn với các 
nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới như Việt Nam. Trong nghiên cứu này, 23 dòng nấm men được 
thử khả năng lên men ethanol từ dịch ép mía ở 37 °C và 40 °C. Tối ưu hóa điều kiện lên men được 
thực hiện với mật số giống chủng (105, 106 và 107 tế bào/mL), hàm lượng đường ban đầu (150, 200 
và 250 g/L) và thời gian lên men (5, 6 và 7 ngày). Kết quả thử nghiệm lên men ở 37 °C đã tuyển 
chọn được 10 chủng nấm men với hàm lượng ethanol sinh ra trong khoảng 10,03-10,57% (v/v), 
trong đó chủng Y8 có hiệu suất lên men cao nhất, đạt 92,62%. Kết quả thử nghiệm lên men ở 40 
°C với chủng Y8 cho thấy hàm lượng ethanol sinh ra và hiệu suất lên men cao nhất lần lượt là 
5,74% (v/v) và 71,47%. Kết quả định danh xác định chủng Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35 và Y42 
là Saccharomyces cerevisiae, chủng Y39 là Candida tropicalis, chủng YVN7 là C. glabrata và 
chủng YVN12 là Torulaspora globosa. Trong đó, chủng S. cerevisiae Y8 thích hợp nhất để sản 
xuất ethanol với điều kiện lên men từ dịch ép mía ở 37 °C, nồng độ giống 107 tế bào/mL, hàm 
lượng đường ban đầu 248,2 g/L và thời gian lên men 6 ngày, hàm lượng ethanol đạt 10,58% (v/v). 
Từ khóa: Lên men ethanol, nấm men chịu nhiệt, dịch ép mía, Saccharomyces cerevisiae, tối ưu hóa. 
Ngày nhận bài: 27/6/2019; Ngày hoàn thiện: 21/7/2019; Ngày đăng: 27/7/2019 
ETHANOL PRODUCTION FROM SUGAR-CANE JUICE BY USING 
THERMOTOLERANT YEASTS 
Huynh Xuan Phong
*
, Ha Phu Quy, Nguyen Ngoc Thanh, 
Bui Hoang Dang Long, Ngo Thi Phuong Dung 
Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University 
ABSTRACT 
Using thermotolerant yeasts for ethanol fermentation is a potential orientation in tropical countries 
as Vietnam. In this study, 23 yeast strains were tested for ethanol fermentation ability at 37 °C and 
40 °C in sugarcane juice. The fermentation conditions were set up in a factorial design (three 
factors) at three levels: yeast inoculum (10
5
, 10
6
 and 10
7
 cells/mL), initial sugar concentration 
(150, 200 and 250 g/L) and fermentation time (5, 6 and 7 days). The results showed that 10 yeast 
isolates were able to produce ethanol with high concentrations (10.03-10.57% v/v) at 37 °C. Of 
which, strain Y8 got the highest efficiency (92.62%). At 40 °C, strain Y8 got the highest produced 
ethanol concentration and efficiency, 5.74% (v/v) and 71.47%, respectively. Yeast strains were 
identified as follows: 7 strains (Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35, Y42) as Saccharomyces cerevisiae, 
Y39 as Candida tropicalis, YVN7 as C. glabrata, and YVN12 as Torulaspora globosa. The 
optimized conditions for ethanol production from sugarcane juice at 37 °C by using S. cerevisiae 
Y8 were determined: inoculum level of 10
7
 cells/mL, initial sugar concentration of 248.2 g/L, and 
6 days of fermentation, the ethanol concentration was obtained at 10.58% (v/v). 
Keywords: Ethanol fermentation, thermotolerant yeast, sugarcane juice, S. cerevisiae, 
optimization 
Received: 27/6/2019; Revised: 21/7/2019; Published: 27/7/2019 
* Corresponding author. Email: hxphong@ctu.edu.vn 
Huỳnh Xuân Phong và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 185 - 192 
 Email: jst@tnu.edu.vn 186 
1. Giới thiệu 
Ethanol không chỉ sử dụng chủ yếu cho sản 
xuất hay sử dụng trong y tế, mà còn cho sản 
xuất chất màu sơn và các ngành công nghiệp 
hóa chất khác. Trong thế kỷ 19, ngành thương 
mại này đã trở thành một ngành công nghiệp 
với sản lượng rất lớn, do những lợi ích kinh tế 
trong cải tiến của quá trình chưng cất. Ngày 
nay, ethanol là một hóa chất công nghiệp 
quan trọng có tiềm năng như một nguồn nhiên 
liệu sinh học để thay thế cho nguyên liệu hóa 
thạch [1, 2]. Hầu hết các nước phát triển và 
một số nước đang phát triển đã sử dụng 
ethanol sinh học để thay thế một phần cho 
xăng. Lý do của tình trạng này là do sự suy 
giảm dự trữ dầu, chi phí cho nguyên liệu hóa 
thạch tăng cao cùng những vấn đề về môi 
trường [3]. 
Sản xuất ethanol thường được lên men bằng 
nấm men từ các nguồn nguyên liệu nông 
nghiệp. Khả năng chịu đựng của nấm men 
trong điều kiện nhiệt độ và độ ethanol cao 
trong quá trình lên men đang trở thành một 
đặc điểm ngày càng quan trọng thu hút nhiều 
nhà nghiên cứu với nhiều lợi ích có thể được 
khai thác thông qua việc sử dụng các chủng 
nấm men chịu nhiệt để sản xuất ethanol [4-6]. 
Chi phí làm mát trong quá trình sản xuất 
ethanol rất tốn kém, do đó bằng cách sử dụng 
nấm men chịu nhiệt, chi phí cho quá trình làm 
mát sẽ được giảm xuống [5, 7]. Bên cạnh đó, 
quá trình biến đổi khí hậu, nóng lên toàn cầu 
thúc đẩy việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật 
có khả năng chịu nhiệt để ứng phó với sự thay 
đổi này [6, 8]. Nhiệt độ thích hợp cho quá 
trình lên men ethanol sử dụng nấm men trong 
khoảng 25-30 oC [4, 5]. Tuy nhiên, với xu 
hướng gia tăng nhiệt độ toàn cầu hiện nay 
cũng như nhiệt độ ở Việt Nam vào mùa hè 
thường gia tăng đến khoảng 35-37 oC, thậm 
chí là 40 
oC. Do đó, việc tuyển chọn và ứng 
dụng các chủng nấm men chịu nhiệt sẽ giúp 
duy trì ổn định quá trình lên men trong những 
khoảng thời gian nhiệt độ gia tăng, đặc biệt là 
vào mùa hè, mà không cần tốn nhiều chi phí 
để làm mát. 
Ethanol có nguồn gốc đường thường được sản 
xuất từ mía, củ cải đường, lúa miến ngọt, 
Theo Goldemberg [9], mía là một trong 
những nguyên liệu được sử dụng nhiều nhất 
trong sản xuất ethanol chủ yếu ở Brazil. Ở 
một số nước có ngành công nghiệp mía 
đường như Brazil, Ấn Độ và Thái Lan, sản 
lượng mía thô có thể đạt trên 77 tấn/ha và sản 
lượng mía thành phẩm (đã loại bỏ lá) đạt trên 
58 tấn/ha. Cũng tại các quốc gia này, mỗi 
hecta mía đượng có thể sản xuất 4.000 lít 
ethanol mỗi năm [10]. Tại Việt Nam, diện 
tích mía cả nước là 298.200 ha với năng suất 
mía bình quân đạt 63,9 tấn/ha. Phần lớn 
nguồn nguyên liệu mía ở nước ta sử dụng để 
sản xuất đường, tuy nhu cầu tiêu thụ là rất lớn 
nhưng trong những năm gần đây nguồn mía 
cho sản xuất đường đang có dấu hiệu bão hòa, 
giá mía trong nước tụt giảm khiến cho hàng 
ngàn tấn mía ứ đọng mỗi năm. Do đó, nếu có 
thể tận dụng được nguồn nguyên liệu này cho 
việc sản xuất ethanol sinh học thì sẽ tạo ra 
một lợi thế rất lớn trong việc sản xuất nguyên 
liệu thay thế. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm 
tuyển chọn các chủng nấm men chịu nhiệt 
triển vọng có khả năng ứng dụng lên men sản 
xuất ethanol từ dịch ép mía ở nhiệt độ cao. 
2. Vật liệu và phương pháp 
2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 
Dịch ép nước mía được mua tại chợ P. Trà 
An, Q. Bình Thủy, TP. Cần Thơ. Hai mươi ba 
chủng nấm men đã được phân lập và sơ tuyển 
dựa vào đặc tính chịu nhiệt và lên men 
ethanol được lưu trữ ở phòng thí nghiệm 
Công nghệ Sinh học Thực phẩm, trường Đại 
học Cần Thơ [11] và chủng Kluyveromyces 
marxianus DMKU 3-1042 [4]. Hóa chất sử 
dụng như yeast extract, malt extract, peptone, 
D-glucose, agar từ HiMedia Laboratories (Ấn 
Độ); ethanol và NaOH (Merck, Đức). Môi 
trường YPD bao gồm yeast extract 0,5%; 
peptone 0,5%; D-glucose 2,0%; môi trường 
YPD agar (môi trường YPD bổ sung 1,5 g/L 
agar) [4]. 
2.2. Thử nghiệm khả năng lên men của nấm 
men ở 37 ºC từ dịch ép mía 
Thử nghiệm được thực hiện với mục đích 
đánh giá khả năng lên men của các chủng 
nấm men chịu nhiệt nhằm lựa chọn chủng 
nấm men có khả năng lên men tốt ở 37 oC. 
Nấm men được lấy khoảng nửa vòng kim cấy 
từ mẫu trữ chủng vào bình tam giác 250 mL 
có chứa 100 mL môi trường tăng sinh YPD 
đã được khử trùng ở 121 °C trong 15 phút. Ủ 
lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28-30 
o
C) trong 24 giờ (mật số đạt 108 tế bào/mL). 
Dịch ép mía được thanh trùng bằng NaHSO3 
Huỳnh Xuân Phong và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 185 - 192 
 Email: jst@tnu.edu.vn 187 
(140 mg/L trong 2 giờ). Điều chỉnh dịch ép 
mía ở 200 g/L và pH 5,5. Một mL (mật số 108 
tế bào/mL) các chủng nấm men và chủng K. 
marxianus dịch tăng sinh vào bình tam giác 
250 mL có chứa 99 mL dịch ép nước mía, đậy 
bằng water-lock và ủ ở 37 oC trong 5 ngày. 
Các chỉ tiêu như pH, hàm lượng đường và 
hàm lượng ethanol được phân tích sau khi kết 
thúc quá trình lên men. 
2.3. Thử nghiệm khả năng lên men của nấm 
men ở 40 ºC từ dịch ép mía 
Các chủng nấm men được tuyển chọn từ thử 
nghiệm lên men ở 37 °C được tiếp tục đánh 
giá khả năng lên men ở 40 °C với mục tiêu 
tuyển chọn chủng nấm men có thể duy trì khả 
năng lên men tốt nhất. Môi trường được 
chuẩn bị, các bước thực hiện và chỉ tiêu theo 
dõi tương tự như thử nghiệm ở 37 °C với 3 
lần lặp lại. 
2.4. Định danh các chủng nấm men chịu 
nhiệt được tuyển chọn 
Các chủng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn 
được tăng sinh trong 10 mL môi trường YPD 
ở 37 °C trong 24 giờ. Nấm men được trích 
DNA và để khuếch đại trình tự vùng D1/D2 
trên 26S rDNA với cặp mồi NL-1 (5’-
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) 
và NL-4 (5’-GGTCCGTG 
TTTCAAGACGG-3’) bằng phản ứng PCR 
[12]. Sản phẩm PCR được giải trình tự sử 
dụng hệ thống giải trình tự ABI PRISM 3100 
(Applied Biosystems, California, USA) tại 
Trường Đại học Yamaguchi (Nhật Bản). Dựa 
trên trình tự 26S rDNA để phân tích và so 
sánh với trình tự các chủng nấm men trên 
ngân hàng dữ liệu NCBI. Xây dựng cây phả 
hệ dựa trên trình tự đoạn gene 26S rDNA theo 
phương pháp neigbor-joining trong chương 
trình MEGA 6 với chỉ số bootstrap 1.000 lần 
lặp lại [13]. 
2.5. Tối ưu hóa điều kiện lên men ethanol 
bằng nấm men chịu nhiệt 
Chủng nấm men có khả năng lên men mạnh 
nhất từ các thí nghiệm trên được tuyển chọn 
sử dụng trong thử nghiệm này. Nuôi nấm men 
trong môi trường tăng sinh YDP, ly tâm dịch 
tăng sinh, và mật số nấm men sau khi chủng 
vào bình tam giác lần lượt là 107, 106 và 105 
tế bào/mL). Thí nghiệm được thực hiện với 
100 mL dịch ép mía lên men ở 37 oC với 3 
nhân tố: nồng độ giống (105, 106 và 107 
tb/mL), hàm lượng đường (150, 200 và 250 
g/Lvà thời gian lên men (5, 6 và 7 ngày). 
2.6. Phân tích và xử lý kết quả 
Giá trị pH được xác định bằng pH kế 
(Sartorius, PB-20, Đức), Brix được xác định 
bằng khúc xạ kế (Hand Refractometer, 
FG103/113, Euromex-Hà Lan), hàm lượng 
đường được xác định bằng phương pháp DNS 
[14] và hàm lượng ethanol được xác định 
bằng phương pháp chưng cất [15]. Hiệu suất 
lên men được tính dựa trên tỷ lệ hàm lượng 
ethanol thực tế thu được so với ethanol lý thuyết 
được tính theo lượng đường tiêu thụ [4]. Kết 
quả được xử lý và vẽ biểu đồ bằng phần mềm 
Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, 
USA). Số liệu được xử lý thống kê bằng 
chương trình Statgraphics Centurion XV ver 
15.1.02 (Statpoint Technologies, Inc., USA). 
3. Kết quả và thảo luận 
3.1. Khả năng lên men ở 37 °C của nấm 
men từ dịch ép mía 
Kết quả sau lên men cho thấy sự giảm thấp 
của pH về mức 3,11-3,73 so với pH ban đầu 
là 5,5 (Bảng 1). Nguyên nhân chính khiến độ 
pH giảm là do sự hình thành của các sản 
phẩm phụ trong quá trình lên men như CO2 và 
các acid hữu cơ. Hàm lượng ethanol đạt được 
sau 5 ngày lên men trong khoảng 2,20-
10,57% (v/v) và hiệu suất lên men đạt 59,61-
92,62%. Hàm lượng đường tiêu thụ trong 
khoảng 55,72-192,45 g. Tuy nhiên, phần lớn 
chủng nấm men tuyển chọn cho thấy sự tương 
thích cao với môi trường dịch ép mía với 10 
chủng Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35, Y39, 
Y42, YVN7 và YVN12 cho độ cồn trên 10% 
(v/v), trong khoảng 10,03-10,57 g/L với hiệu 
suất lên men đạt 83,06 - 92,62%. Trong đó, 3 
chủng Y8, Y31 và YVN12 có lượng ethanol 
cao nhất lần lượt là 10,37, 10,57 và 10,36% 
(v/v), với hiệu suất lần lượt là 92,62, 85,53 và 
83,06%. 
Dựa theo kết quả thống kê về độ rượu về hiệu 
suất lên men chọn được 10 chủng nấm men 
Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35, Y39, Y42, 
YVN7 và YVN12 cho khả năng lên men 
ethanol tốt nhất từ 10,03-10,57% (v/v) để thử 
nghiệm lên men dịch nước ép mía ở 40 oC. 
3.2. Khả năng lên men ở 40 oC của nấm men 
từ dịch ép mía 
Mười chủng nấm men có khả năng lên men 
sinh ethanol cao ở 37 oC (Y8, Y31, Y32, Y33, 
Huỳnh Xuân Phong và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 185 - 192 
 Email: jst@tnu.edu.vn 188 
Y34, Y35, Y39, Y42, YVN7 và YVN12) 
được tuyển chọn sử dụng cho lên men ethanol 
từ dịch ép mía ở 40 oC. Kết quả sau 5 ngày 
lên men được thể hiện trong Bảng 2. Kết quả 
cho thấy tất cả 10 chủng nấm men tuyển chọn 
đều có khả năng sinh ethanol ở 40 oC từ dịch 
ép mía. Hàm lượng ethanol đạt được trong 
khoảng 2,21-5,74% (v/v) với hiệu suất lên 
men đạt 54,18-71,47 tương ứng với lượng 
đường tiêu thụ trong khoảng 56,41-123,78 g. 
Trong đó, chủng Y8 có nồng độ ethanol cao 
nhất đạt 5,74% (v/v) và có hiệu suất lên men 
cao nhất, đạt 71,47%, khác biệt có ý nghĩa so 
với các chủng còn lại. 
Bảng 1. Kết quả lên men của nấm men từ dịch ép mía ở 37 oC 
STT Chủng pH sau lên men Đường sử dụng (g/L) Ethanol (% v/v) Hiệu suất lên men (%) 
1 Y8 3,42
c 1
 172,69
e
 10,37
a
 92,62
a
2 Y29 3,39
c
 96,35
gh
 4,77
ef
 76,49
fg
3 Y31 3,66
ab
 190,55
ab
 10,57
a
 85,53
abcde
4 Y32 3,65
ab
 186,23
abc
 10,29
ab
 85,24
abcde
5 Y33 3,67
ab
 179,59
cde
 10,12
ab
 86,96
abcd
6 Y34 3,65
ab
 178,73
cde
 10,29
ab
 88,81
abc
7 Y35 3,71
ab
 180,80
bcde
 10,10
ab
 86,17
abcde
8 Y37 3,16
def
 66,77
j
 2,28
hi
 65,11
i
9 Y38 3,11
f
 82,55
i
 3,60
gh
 67,33
hi
10 Y39 3,68
ab
 177,95
cde
 10,22
ab
 88,72
abc
11 Y42 3,73
a
 183,65
abcd
 10,03
ab
 84,25
bcdef
12 Y47 3,14
f
 73,84
ij
 2,85
hi
 59,61
i
13 Y53 3,14
f
 66,18
j
 2,77
hi
 61,85
i
14 Y54 3,26
d
 122,83
f
 6,32
c
 79,41
defg
15 Y80 3,15
ef
 98,59
gh
 5,01
de
 78,247
efg
 16 Y81 3,19
def
 103,34
g
 5,42
de
 80,86
cdefg
17 Y88 3,25
de
 92,64
h
 4,93
e
 81,34
cdefg
18 Y104 3,15
ef
 55,72
k
 2,20
i
 60,80
i
19 YVN3 3,66
ab
 175,71
de
 9,47
b
 83,18
cdefg
20 YVN7 3,66
ab
 187,70
abc
 10,34
ab
 84,94
abcde
21 YVN8 3,25
d
 97,73
gh
 5,84
cd
 92,55
ab
22 YVN12 3,67
ab
 192,45
a
 10,36
a
 83,06
cdefg
23 YVN30 3,61
b
 179,25
cde
 9,81
ab
 84,35
abcdef
24 K. mar 
2
 3,19
def
 81,34
i
 3,98
fg
 75,39
gh
CV% 7,12 17,27 14,19 13,26 
1
 Giá trị trung bình của 3 lần lặp lại, trong cùng một cột các chữ số mũ giống nhau thì khác biệt không có 
ý nghĩa thống kê 5% (P<0,05). 2 Kluyveromyces marxianus 
Bảng 2. Kết quả lên men ở 40 oC của nấm men từ dịch ép mía 
STT Chủng pH sau lên men Đường sử dụng (g/L) Ethanol (% v/v) Hiệu suất lên men (%) 
1 Y8 3,94
ab 1
 123,78
a
 5,74
a
 71,47
a
2 Y31 3,93
abc
 56,41
d
 2,21
g
 60,66
cd
3 Y32 3,90
bcd
 77,63
c
 3,15
cd
 62,53
bc
4 Y33 3,98
a
 57,88
d
 2,39
f ... ail: jst@tnu.edu.vn 189 
Kết quả khả năng lên men ở 37 oC và 40 oC 
cho thấy hàm lượng ethanol của 10 chủng 
nấm men thử nghiệm đều giảm khi tăng nhiệt 
độ từ 37 oC lên 40 oC. Trong đó, chủng Y8 
giảm ít nhất, từ 10,37% xuống 5,74% (giảm 
4,63% v/v), chủng Y31 giảm mạnh nhất, từ 
10,57% xuống 2,21% (giảm 8,36% v/v). 
Chủng nấm men chịu nhiệt K. marxianus có 
sự thay đổi không đáng kể về hàm lượng 
ethanol, từ 3,98% ở 37 oC giảm xuống 3,43% 
ở 40 oC (giảm 0,55% v/v). Thử nghiệm ở 40 
oC cho thấy hàm lượng ethanol của chủng K. 
marxianus cao hơn độ cồn của 8/10 chủng 
được thử nghiệm, trong khi trước đó lượng 
ethanol của K. marxianus thấp hơn lượng 
ethanol của 18/23 chủng được thử nghiệm ở 
40 
oC. Nguyên nhân của sự khác biệt này là 
do các chủng nấm men Kluyveromyces có khả 
năng chịu nhiệt cao hơn so với các chủng nấm 
men khác như Saccharomyces hay Candida, 
nhưng lại kém hơn trong khả năng sinh cũng 
như chịu ethanol [16]. 
Hiệu suất lên men của 10 chủng được tuyển 
chọn thử nghiệm lên men trong môi trường 
dịch ép mía ở 40 oC cũng giảm mạnh so với 
thử nghiệm ở 37 oC. Chủng Y8 và YVN12 đạt 
hiệu suất lên men ở 40 oC cao nhất lần lượt 
đạt 71,34% và 69,31% khác biệt có ý nghĩa so 
với hiệu suất lên men của các chủng còn lại. 
Chủng YVN12 có độ giảm hiệu suất lên men 
ít nhất từ 83,06% ở 37 oC xuống 69,31% ở 40 
oC (giảm 13,75%), chủng Y34 có độ giảm 
hiệu suất lên men mạnh nhất từ 88,81% ở 37 
oC xuống 54,18% ở 40 oC (giảm 34,63%). 
Dựa vào các kết quả thử nghiệm lên men 
ethanol từ dịch ép mía ở 37 oC và 40 oC, 
chủng Y8 được tuyển chọn để tiến hành thử 
nghiệm các điều kiện lên men của nấm men 
chịu nhiệt. 
3.3. Định danh nấm men tuyển chọn 
Kết quả định danh và độ tương đồng so với 
chủng nấm men trên ngân hàng gen NCBI 
được thể hiện ở Bảng 3. Trong đó, 7 chủng 
nấm men (Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35 và 
Y42) thuộc loài S. cerevisiae. Một số chủng 
nấm men Saccharomyces spp. có khả năng 
phát triển và sinh ethanol ở mức nhiệt độ từ 
35-42 
oC [17]. Các chủng nấm men 
Saccharomyces spp. cho khả năng sinh 
ethanol cao hơn các chủng khác nhưng mức 
nhiệt độ tối ưu thường thấp và bị ức chế ở 
nhiệt độ cao. 
Hai chủng nấm men Y39 và YVN7 thuộc chi 
Candida. Trong đó, chủng Y39 được định 
danh là C. tropicalis và chủng YVN7 được 
định danh là Candida glabrata. Chủng nấm 
men YVN12 được định danh là T. globosa. 
Nấm men T. globosa có khả năng sinh trưởng 
và lên men trong điều kiện nhiệt độ từ 30-40 
oC [16]. Chủng nấm men Y8, Y31, Y32, Y33, 
Y34, Y35 và Y42 được định danh là S. 
cerevisiae, đây là chủng được ứng dụng phổ 
biến nhất trong lên men ethanol, gần đây cũng 
có nhiều nghiên cứu khả năng lên men của 
chủng này ở nhiệt độ 40 °C [18-20]. 
Quan hệ di truyền của 7 chủng nấm men được 
định danh được thể hiện ở Hình 1. Dựa vào sự 
phân nhánh trên cây phát sinh loài loài cho 
thấy các chủng nấm men được tuyển chọn có 
mối quan hệ gần với chỉ số bootstrap từ 85-
100%. Nhóm các chủng S. cerevisiae Y8, Y33, 
Y35 và Y42 có mối quan hệ mật thiết với 
nhau, chỉ số bootstrap của các chủng trong 
nhóm là 99%. Nhóm này cũng có mối quan hệ 
gần với chủng T. globosa YVN12 với chỉ số 
bootstrap là 53%, kết này tương tự so với 
nghiên cứu của Kurtzman và Robnett [12]. 
Bảng 3. Kết quả định danh của các chủng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn 
Chủng Tên loài Mức độ tương đồng Mã số 
Y8 Saccharomyces cerevisiae 100% KT222662.1 
Y31 Saccharomyces cerevisiae 96% KC544490.1 
Y32 Saccharomyces cerevisiae 96% KC544490.1 
Y33 Saccharomyces cerevisiae 100% KT222662.1 
Y34 Saccharomyces cerevisiae 97% KP998094.1 
Y35 Saccharomyces cerevisiae 100% KT222662.1 
Y39 Candida tropicalis 100% KR632573.1 
Y42 Saccharomyces cerevisiae 100% KT222662.1 
YVN7 Candida glabrata 100% KJ624034.1 
YVN12 Torulaspora globosa 99% AB499015.1 
Huỳnh Xuân Phong và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 185 - 192 
 Email: jst@tnu.edu.vn 190 
Bảng 4. Kết quả thử nghiệm tối ưu hóa các điều kiện lên men 
Nghiệm thức 
pH sau 
lên men 
Hàm lượng 
ethanol (% v/v) 
Hiệu suất 
lên men (%) 
Thời gian 
(ngày) 
Mật số 
(tb/mL) 
Hàm lượng 
đường (g/L) 
5 10
5
 150 3,3
ghijk 1
 5,82
o
 71,69
j
5 10
6
 150 3,4
ef
 7,70
jk
 86,95
cdefg
5 10
7
 150 3,58
ab
 9,73
bcde
 96,80
abc
5 10
5
 200 3,34
fghi
 6,52
mno
 88,69
abcdef
5 10
6
 200 3,47
cde
 9,60
cdef
 90,99
abcde
5 10
7
 200 3,66
a
 10,45
ab
 94,70
abcd
5 10
5
 250 3,35
fgh
 6,52
mno
 72,57
ij
5 10
6
 250 3,47
cde
 9,25
defgh
 92,49
abcd
5 10
7
 250 3,63
a
 10,05
abc
 92,97
abcd
6 10
5
 150 3,19
m
 6,83
lmn
 77,97
ghij
6 10
6
 150 3,31
ghij
 8,78
hi
 93,09
abcd
6 10
7
 150 3,49
cd
 8,94
fghi
 88,98
abcdef
6 10
5
 200 3,22
klm
 7,32
kl
 93,47
abcd
6 10
6
 200 3,35
fgh
 10,14
abc
 98,30
a
6 10
7
 200 3,54
bc
 9,27
defgh
 79,50
fghij
6 10
5
 250 3,23
jklm
 6,96
klmn
 77,15
ghij
6 10
6
 250 3,35
fgh
 10,58
a
 97,55
ab
6 10
7
 250 3,53
bc
 9,94
abcd
 88,14
bcdef
7 10
5
 150 3,26
ijklm
 7,18
klm
 80,36
ghij
7 10
6
 150 3,37
fg
 8,33
ij
 86,21
defgh
7 10
7
 150 3,59
ab
 9,47
cdefg
 92,17
abcde
7 10
5
 200 3,21
lm
 5,82
o
 80,14
fghij
7 10
6
 200 3,41
ef
 9,51
cdefg
 90,69
abcde
7 10
7
 200 3,61
ab
 9,14
efgh
 79,81
fghij
7 10
5
 250 3,28
hijkl
 6,52
no
 76,79
hij
7 10
6
 250 3,41
def
 8,78
ghi
 82,30
efghi
7 10
7
 250 3,6
ab
 9,48
cdefg
 86,11
defgh
CV% 4,20 17,83 9,70 
1 Giá trị trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại, trong cùng một cột các chữ số mũ giống nhau thì khác biệt không 
có ý nghĩa thống kê 5% (P<0,05). 
Hình 1. Cây phát sinh loài của các chủng nấm 
men được tuyển chọn 
3.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men của nấm 
men chịu nhiệt 
Từ kết quả về khả năng lên men ethanol ở 37 
o
C và 40 
o
C, chủng S. cerevisiae Y8 được chọn 
sử dụng trong thử nghiệm điều kiện tối ưu lên 
men ethanol từ dịch ép mía. Kết quả ở Bảng 4 
cho thấy hàm lượng ethanol sinh ra và hiệu 
suất lên men thể hiện sự khác biệt ở các 
nghiệm thức khác nhau. Ở nghiệm thức thời 
gian lên men 6 ngày, nồng độ giống 106 tb/mL 
và hàm lượng đường 250 g/L, nồng độ ethanol 
thu được là 10,58% (v/v) với hiệu suất lên men 
97,55%. Ở nghiệm thức lên men 6 ngày, nồng 
độ giống 106 tb/mL và hàm lượng đường 200 
g/L, nồng độ ethanol thu được là 10,14% (v/v) 
và hiệu suất lên men là 98,3%. 
Sự thay đổi của pH của các nhân tố không 
đáng kể. Ở nhân tố nồng độ giống, mật số cao 
thì thời gian lên men cũng như thời gian đạt 
lượng ethanol cao nhất sẽ ngắn lại, ở nồng độ 
giống là 107 tb/mL, nồng độ ethanol giảm lên 
tục theo thời gian lên men từ ngày 5 đến ngày 
7, điều đó cho thấy quá trình lên men dừng lại 
từ rất sớm. Ở các ngày tiếp theo ethanol sẽ 
tiếp tục phản ứng với các acid hữu cơ làm 
Huỳnh Xuân Phong và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 185 - 192 
 Email: jst@tnu.edu.vn 191 
giảm năng suất cũng như tăng độ pH. Ngược 
lại, ở nồng độ giống là 105 tb/mL quá trình 
diễn ra chậm, lượng ethanol thấp nhưng liên 
tục tăng từ 5 đến 7 ngày, sự xuất hiện của bọt 
khí diễn ra trong toàn bộ thử nghiệm chứng tỏ 
lượng khí CO2 được sinh ra trong suốt thời 
gian này làm giảm thấp độ pH. 
Trong sản xuất ethanol sinh học thì hàm 
lượng ethanol thu được sau lên men là chỉ tiêu 
quan trọng nhất. Trong thử nghiệm này, từ 
các kết quả và so sánh ở Bảng 4 cho thấy ở 
các nghiệm thức với thời gian lên men là 6 
ngày cho khả năng sinh ethanol và hiệu suất 
lên men cao nhất. Như vậy, thời gian lên men 
là 6 ngày là nghiệm thức tốt nhất cho quá 
trình lên men ethanol ở dịch ép mía. Phần 
mềm thống kê Statgraphics Centurion được 
sử dụng xử lý số liệu thực nghiệm để thiết lập 
phương trình hồi quy qua đó xác định nghiệm 
thức tối ưu cho quá trình sản xuất ethanol 
bằng nấm men chịu nhiệt từ dịch ép mía. Biểu 
đồ mặt đáp ứng và biểu đồ đường mức thể 
hiện sự tương quan giữa nồng độ đường và 
thời gian lên men được thể hiện ở Hình 2. 
Phương trình hồi quy đa biến: Nồng độ 
ethanol (% /v/v) = -92,2046 + 0,167413*X + 
19,2369*Z + 11,1349*Y - 
0,0000971661*X*X - 0,0162604*X*Z - 
0,0223532*X*Y - 0,425556*Y*Y - 
0,88518*Y*Z - 1,07472*Z*Z + 
0,00307967*X*Y*Z. Trong đó: X là hàm 
lượng đường ban đầu (155,01-268,82 g/L), Y 
là thời gian lên men (5-7 ngày) và Z là Log của 
nồng độ giống (5-7 log tb/mL). Từ phương 
trình hồi quy, cố định thời gian lên men tại tại 
6 ngày (Y = 6). Giải phương trình hồi quy 
bằng cách lấy đạo hàm lần lượt theo X và Z 
được kết quả X = 248,2 và Z = 6,7 (~7,0). 
Kết quả phân tích cho thấy điều kiện tối ưu 
lên men dịch ép mía ở 37 °C sử dụng chủng 
nấm men Y8 là hàm lượng đường ban đầu 
248,2 g/L, thời gian lên men 6 ngày, nồng độ 
giống 107 tế bào/mL, hàm lượng ethanol đạt 
10,58% (v/v). Limtong và cộng sự [4] lên 
men dịch ép mía với chủng K. marxianus 
DMKU-3042 ở 37 °C thu được 8,7% (w/v) 
ethanol với hiệu suất lên men đạt 77,5%. Kết 
quả lên men dịch ép mía với chủng S. 
cerevisiae HAU-21 dược ghi nhận với 
10,02% (v/v) ở 30 °C [21]. 
Hình 2. Biểu đồ mặt đáp ứng (A) và đường mức (B) thể hiện sự tương quan giữa hàm lượng đường và 
nồng độ giống chủng lên hàm lượng ethanol 
4. Kết luận 
Tuyển chọn được 10 chủng nấm men Y8, 
Y31, Y32, Y33, Y34, Y35, Y39, Y42, YVN7 
và YVN12 có khả năng lên men mạnh với 
hiệu suất cao trong môi trường dịch ép mía ở 
37 °C. Trong đó, 3 chủng Y8, Y31 và YVN12 
sinh ra lượng ethanol cao nhất, trong khoảng 
10,36-10,57% (v/v). Chủng Y8 có khả năng 
lên men tốt nhất ở 40 oC với hàm lượng 
ethanol đạt được ở mức 5,74% (v/v) và hiệu 
suất 71,34% nên được tuyển chọn để xác định 
điều kiện lên men tối ưu. Các chủng nấm men 
tuyển chọn được định danh là S. cerevisiae, 
C. tropicalis, C. glabrata và T. globosa. Xác 
định được điều kiện lên men thích hợp của 
chủng S. cererevisiae Y8 trong môi trường 
dịch ép mía ở 37 °C với hàm lượng đường 
ban đầu là 248,2 g/L, lên men 6 ngày và nồng 
độ giống 107 tế bào/mL, hàm lượng ethanol 
đạt 10,58% (v/v). 
Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin cảm ơn sự hỗ 
trợ kinh phí đề tài nghiên cứu khoa học trong 
Chương trình Công nghệ Sinh học Tiên tiến 
(Trường Đại học Cần Thơ) và Chương trình 
CCP (Core-to-Core Program, 2014-2019). 
Huỳnh Xuân Phong và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 185 - 192 
 Email: jst@tnu.edu.vn 192 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1]. S. Alfenore, C. Molina-Jouve, S. E. 
Guillounet, J. L. Uribelarrea, G. Goma, L. 
Benbadis, “Improving ethanol production and 
viability of Saccharomyces cerevisiae by a 
vitamin feeding strategy during fed-batch 
process”, Applied Microbiology and 
Biotechnology, 60, pp. 67-72, 2002. 
[2]. C. A. Cardona, J. A. Quintero, I. C. Paz, 
“Production of bioethanol from sugarcane 
bagasse: status and perspectives”, Bioresources 
Technology, 101(13), pp. 4754-4766, 2010. 
[3]. H. B. Aditiya, T. M. I. Mahlia, W. T. Chong, 
H. Nur, A. H. Sebayang, “Second generation 
bioethanol production: A critical review”, 
Renewable and Sustainable Energy Reviews, 66, 
pp. 631-653, 2016. 
[4]. S. Limtong, C. Sringiew, W. Yongmanitchai, 
“Production of fuel ethanol at high temperature 
from sugar cane juice by a newly isolated 
Kluyveromyces marxianus”, Bioresources 
Technology, 98, pp. 3367-3374, 2007. 
[5]. B. M. Abdel-Banat, H. Hoshida, A. Ano, S. 
Nonklang, R. Akada, “High-temperature 
fermentation: How can processes for ethanol 
production at high temperatures become superior 
to the traditional process using mesophilic yeast?”, 
Applied Microbiology and Biotechnology, 85(4), 
pp. 861-867, 2010. 
[6]. M. Koutinas, M. Patsalou, S. Stavrinou, I. 
Vyrides “High temperature alcoholic fermentation 
of orange peel by the newly isolated thermotolerant 
Pichia kudriavzevii KVMP10, Letters in Applied 
Microbiology, 62, pp. 75-83, 2015. 
[7]. M. Roehr, The Biotechnology of Ethanol: 
Classical and Future Applications. Chichester: 
Wiley-VCH, 2001. 
[8]. J. Choudhary, S. Singh, L. Nain, 
“Thermotolerant fermenting yeasts for 
simultaneous saccharification fermentation of 
lignocellulosic biomass”, Electronic Journal of 
Biotechnology, 21, pp. 82-92, 2016. 
[9]. J. Goldemberg, “Ethanol for a sustainable 
energy future”, Science, 315, pp. 808-810, 2007. 
[10] A.V. Rosa, Fundamentals of Renewable 
Energy Processes, 1
st
 ed, Academic Press, 
Elsevier Inc., 2009. 
[11]. N. T. P. Dung, H. X. Phong, P. Thanonkeo, 
P. Klanrit, T. Yakushi, K. Matsushita, M. 
Yamada, “The diversified collection of 
thermotolerant microorganisms isolated in 
Vietnam for fermentation of ethanol, acetic acid 
and lactic acid”, International Symposium on 
Microbial Research and Biotechnology for 
Biomass Utilization, p. 27, 2015. 
[12]. C. P. Kurtzman and C. J. Robnett, 
“Identification of clinically important 
ascomycetous yeasts based on nucleotide 
divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) 
ribosomal DNA gene”, Journal of Clinical 
Microbiology, 35(5), pp. 1216-1223, 1997. 
[13]. K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. 
Filipski, S. Kumar “MEGA6: Molecular 
evolutionary genetics analysis version 6.0”, 
Molecular Biology and Evolution, 30(12), pp. 
2725-2729, 2013. 
[14]. R. S. S. Teixeira, A. S. da Silva, V. S. 
Ferreira-Leitão, E. P. S. Bon, “Amino acids 
interference on the quantification of reducing 
sugars by the 3,5-dinitrosalicylic acid assay 
mislead carbohydrase activity measurements”, 
Carbohydrate Research, 363, pp. 33-37, 2012. 
[15]. Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh 
Hằng, Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, 
Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2005. 
[16]. A. Edgardoa, P. Carolinaa, R. Manuela, F. 
Juanitaa, B. Jaimea, “Selection of thermotolerant 
yeast strains Saccharomyces cerevisiae for 
bioethanol production”, Enzyme and Microbial 
Technology, 43, pp. 120-123, 2008. 
[17]. R. Jutakanoke, S. Tanasupawat, A. 
Akarachananya, “Characterization and ethanol 
fermentation of Pichia and Torulaspora strains”, 
Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4, pp. 
52-56, 2014. 
[18]. S. Nuanpeng, S. Thanonkeo, M. Yamada, P. 
Thanonkeo, “Ethanol production from sweet 
sorghum juice at high temperatures using a newly 
isolated thermotolerant yeast Saccharomyces 
cerevisiae DBKKU Y-53”, Energies, 9(4), pp. 
253, 2016. 
[19]. A. Techaparin, P. Thanonkeo, P. Klanrit, 
“High-temperature etanol production using 
thermotolerant yeast newly isolated from Greater 
Mekong Subregion”, Brazilian Journal of 
Microbiology, 48(3), pp. 461-475, 2017. 
[20]. H. X. Phong, P. Klanrit, N. T. P. Dung, M. 
Yamada, P. Thanonkeo, “Isolation and 
characterization of thermotolerant yeasts for the 
production of second-generation bioethanol”, 
Annals of Microbiology, 69(7), pp. 765-776, 2019. 
[21]. R. Giri, B. S. Kundu, P. Diwan, K. Raj, L. 
Wati, “Ethanol production from direct sugarcane 
and juice by yeast”, Agricultural Science Digest, 
33(3), pp. 188-192, 2013.