Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Phần 6)

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG 
(SH3014) 
1 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI 
(10 TIẾT) 
 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 
 Các phương pháp lai phân tử 
 Phương pháp PCR, ứng dụng 
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA 
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 
8/26/2014 2 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Khái niệm thư viện DNA 
•Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được 
sử dụng để thu thập và lưu trữ thông tin 
•Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phân 
tử DNA 
Thư viện DNA là tập hợp ngẫu nhiên các đoạn 
DNA (có tính đại diện đặc thù cho hệ gen của một 
sinh vật) được chèn vào các vector nhân dòng 
Có hai loại thư viện mẫu chính đó là: 
 1. Thư viện genome (Genomic library): chứa 
toàn bộ các đoạn DNA có trong nhân của một 
tổ chức hay cơ thể. Genomic library có thể 
được nhân dòng bằng plasmid hoặc genome 
của thực khuẩn thể. 
 2. Thư viện cDNA (cDNA library): chứa các 
đoạn cDNA có tính đại diện đặc thù cho toàn 
bộ mARN của một mô. Thư viện cDNA được 
tạo ra bằng cách tổng hợp nên cDNA từ mRNA. 
Các bước trong tạo thư viện mẫu đã 
nhân dòng 
1. Tạo các đoạn DNA ngẫu nhiên từ hệ gen hay 
cDNA 
2. Chèn các đoạn DNA vào vector nhân dòng thích 
hợp. 
3. Nhân các đoạn DNA tạo ra trong hệ thống tế bào 
chủ (chứa vector nhân dòng tương ứng) 
4. Chọn lọc các dòng có chứa vector mang đoạn 
DNA mục tiêu. 
Thiết kế thư 
viện mẫu cho 
đọc trình tự. 
• Mỗi một đoạn DNA cài trong một vector biến nạp trong 1 tế 
bào vi khuẩn Sách (Book) 
• Tập hợp tất các các dòng vi khuẩn Thư viện 
Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng 
Kích thước của đoạn DNA tùy thuộc vào mục đích 
sử dụng thư viện 
• Để lập bản đồ, xác định các gen hay tách 
dòng gen từ hệ gen có kích thước lớn cần các 
đoạn DNA lớn và sử dụng các vectơ như phage, 
cosmid, BAC hay YAC 
• Để xác định trình tự, lập bản đồ chi tiết 
cần các đoạn DNA có kích thước nhỏ, sử dụng 
vectơ nhân dòng là plasmid 
• Các đoạn DNA phải có tính ngẫu nhiên để 
đảm bảo tính đại diện cho hệ gen. 
Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng 
• Làm gãy nhiễm sắc thể 
• Cắt bằng RE 
• Ở genom người dựng RE có vùng nhận biết gồm 8 
Nu (NotI, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài 
lớn 
• Thông thường dùng RE có vùng nhận biết gồm 4 
Nu (AluI, HaeIII) 
• Cắt không hoàn toàn (partial digest) bằng cách sử 
dụng phối hợp nhiều RE 
Stt Vector 
Khả năng chứa đoạn 
DNA(kb) 
 1. 
Plasmit 
<10kb 
 2. 
Bacteriophage 
9-20kb 
 3. 
Cosmit 
33-47kb 
 4. 
BAC 
100-300kb 
 5. 
YAC 
100-1000kb 
Bảng. Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số vector nhân 
dòng 
Trong một thư viện sẽ chứa bao nhiêu dòng ? 
• Theo lý thuyết: 
 Số dòng tối thiểu cần thiết để tạo thư viện(n) = độ lớn của hệ gen (b) 
 độ lớn TB của đoạn ADN (a) 
Ví dụ: thiết kế thư viện hệ gen của người, dùng các 
vector khác nhau: 
Kích thước genome : 3 x 109 bp 
• Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases)---> 
Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover 
one human genome (haploid human) 
• Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb ---> Average insert of 17,000 bases 
= 1.8 x 105 clones required to cover one human genome 
• Cosmid = Take inserts of 35-50 kb ---> Average insert of 50,000 bases = 
60,000 clones required to cover one human genome 
• BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb ---> 
Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human 
genome 
• YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb 
= 1 x 106 bases) or greater --> Average insert of 1 Mb = 3,000 clones 
required to cover one human genome 
• Một số dòng sẽ có mặt hơn một lần trong thư viện do hiện 
tượng lặp đoạn 
• Một số trình tự nào đó sẽ bị mất nếu chỉ sử dụng số dòng 
tối thiểu. 
• Clarke and Carbon (1976) đề nghị công thức tính mới 
nhằm tính xác suất để một đoạn DNA được nhân dòng 
trong một thư viện mẫu. 
 N = ln(1-P) 
 ln(1-a/b) 
• Trong đó: P: xác xuất nhân dòng một đoạn DNA bất kỳ; a: 
kích thước đoạn DNA cần nhân (bp), b : độ lớn hệ gen 
(bp) 
Trên thực tế, số dòng sẽ lớn hơn bởi quá trình cắt và 
ghép vào vector là ngẫu nhiên. 
Câu hỏi 
• Cần bao nhiêu dòng để 99 % một đoạn 
trình tự có mặt trong thư viện gen của 
người sử dụng cosmid vector? 
Học thuyết trung tâm 
DNA 
mRNA 
Protein 
Double-stranded 
Precursor 
RNA 
exon 
intron 
AAAAAAAAAAn 
AAAAAAAAAAn Single-stranded 
AAAAAAAAAAn 
double-stranded 
Reverse transcription 
cDNA 
cDNA 
Một cDNA (complementary DNA) là một bản DNA copy 
của một RNA, thường là mRNA. 
cDNA mRNA 
Mạch kép Mạch đơn 
Ổn định Không ổn định 
Dễ dàng thao tác Khó thao tác hơn 
Cần được phiên mã 
thành RNA để tổng 
hợp protein 
Có thể được sử dụng trực 
tiếp để tổng hợp protein 
KỸ THUẬT TẠO THƯ VIỆN 
cDNA 
Tại sao phải lập ngân hàng cDNA 
• Gene chỉ chiếm một 
phần nhỏ trong 
genome 
• Ở các mô khác nhau 
và giai đoạn sinh 
trưởng khác nhau chỉ 
có một số gene nhất 
định hoạt động 
• DNA ở sinh vật nhân 
chuẩn có chứa intron 
 Quá trình phiên mã và dịch mã ở sinh vật 
nhân chuẩn (Eukaryote) 
Khái niệm 
• cDNA (complementary DNA, copy DNA) là 
phân tử DNA được tổng hợp theo nguyên tắc bổ 
sung từ sợi RNA (chủ yếu là mRNA) khuôn, nhờ 
enzyme sao chép ngược reverse transcriptase. 
 Thư viện cDNA 
 Tập hợp tất cả các mRNA thu được từ một loại tế bào, ở các giai 
đoạn phát triển khác nhau tạo nên tập hợp cDNA được tách dòng 
gọi là ngân hàng cDNA của tế bào 
 Tổng hợp các ngân hàng cDNA của từng loại tế bào và mô 
của một sơ quan ngân hàng cDNA của cơ quan đó 
 Vì không phải tất cả các gene của một cơ thể đều hoạt 
động trong một tế bào tại thời điểm chiết xuất mRNA, do 
vậy, thư viện cDNA luôn luôn nhỏ hơn thư viện genome. 
Nếu biết loại tế bào nào sinh ra protein nghiên cứu thì 
việc tách gene đó thông qua khảo sát thư việc cDNA sẽ 
dễ dàng hơn nhiều so với việc khảo sát thư viện genome. 
Nguyên lý tạo cDNA 
 Như theo định nghĩa, là 
phân tử DNA được tổng 
hợp theo nguyên tắc bổ 
sung từ sợi RNA (chủ yếu 
là mRNA) khuôn, nhờ 
enzyme sao chép ngược 
reverse transcriptase. 
Như vậy, muốn tổng hợp 
được cDNA cần phải tách 
được mRNA khỏi RNA 
tổng số và cần có sự 
tham gia của enzyme sao 
chép ngược reverse 
transcriptase. 
NHÂN TẾ BÀO 
ỐNG NGHIỆM 
Phiên mã 
Loại bỏ 
intron 
Tách mRNA từ tế 
bào và bổ sung 
reverse 
transcriptase; tổng 
hợp mạch DNA 
Phân hủy 
mRNA 
Tổng hợp mạch 
DNA thứ 2 
cDNA của gene 
(không có intron) 
Mạch cDNA 
mRNA 
mRNA 
sơ cấp 
Đoạn DNA 
của gene 
TB nhân 
chuẩn 
Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA 
• Bước 1: Chuẩn bị mRNA 
• Bước 2: Tổng hợp cDNA 
• Bước 3: Tạo thư viện 
cDNA 
Các bước cơ bản ngân hàng cDNA 
(tiếp) 
• Bước 1: Chuẩn bị mRNA: 
– Tách chiết RNA tổng số 
– Tách mRNA ra khỏi hỗn hợp RNA tổng số dựa 
vào đặc điểm của mRNA trưởng thành ở sinh 
vật nhân chuẩn là có đuôi polyA ở đầu 3’.Có 
nhiều phương pháp để tách mRNA ra khỏi 
RNA tổng số. VD: sử dụng sắc mang 
cellulose-oligo(dT), sử dụng hạt Mg-
oligo(dT)(hình) 
Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA tổng số 
sử dụng sắc ký cột mang cellulose-oligo(dT) 
Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA 
tổng số sử dụng hạt Mg-oligo(dT) 
Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA 
(tiếp) 
• Bước 2: Tổng hợp cDNA với sự tham gia của 
enzyme sao chép ngược reverse transciptase 
và các nguyên liệu và hóa chất cần thiết khác. 
Bước này gồm 2 giai đoạn: (1) tổng hợp cDNA 
mạch đơn, (2) tổng hợp cDNA mạch kép. 
• Bước 3: Nhân dòng các cDNA 
 Các cDNA được nhân dòng và tập hợp thành 
các thư viện cDNA (xem lại bài nhân dòng gene) 
Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA 
(tiếp) 
Một số phương pháp tạo cDNA 
Phương pháp tạo cấu trúc kẹp tóc 
• Dùng các mRNA làm khuôn 
với sự có mặt của enzym 
sao chép ngược (inverse 
transcriptase) cùng với các 
nguyên liệu (dNTP) để tổng 
hợp nên DNA bổ sung hay 
cDNA sợi đơn có cấu trúc 
kẹp tóc. 
• Dùng enzyme RNase H 
(hoặc alkali) phân huỷ hoàn 
toàn sợi khuôn mRNA 
• Bổ sung DNA polymerase và 
các nucleotid tự do để tổng 
hơp sợ cDNA thứ 2 (phần 
móc cong trở thành primer 
cho DNA polymerase) 
• Xử lý với S1 nuclease để cắt 
bỏ đoạn có cấu trúc kẹp 
tóc thu được phân tử 
cDNA có cấu trúc xoắn kép 
• RACE (rapid amplification of cDNA ends): 
 kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA 
• Quá trình sao chép ngược được thực hiện 
nhờ PCR (RT-PCR) nhân nhanh trình 
tự RNA thành dạng cDNA. 
• Gồm 2 quy trình: 
– Nhân nhanh đầu 5’ (5’ RACE) 
– Nhân nhanh đầu 3’ (3’ RACE) 
Phương pháp RACE 
3’ RACE 
• mRNA được phiên mã 
ngược sử dụng mồi 
(dT17) c ó gắn neo ở đầu 
5’ của nó. Neo này mang 
trình tự cắt giới hạn để 
phục vụ cho nhân dòng. 
• Quá trình nhân nhanh 
được thực hiện nhờ 
(dT17) c ó gắn neo và 
mồi đặc hiệu cho cDNA 
mục tiêu. 
5’ RACE 
• mRNA được phiên mã ngược 
sử dụng mồi đặc hiệu. 
• Sản phẩm cDNA sau đó được 
kéo dài nhờ terminal 
transferase để tạo đuôi 
poly(dA) ở đầu 3’ của cDNA. 
• Quá trình nhân nhanh được 
thực hiện nhờ mồi dT17 có gắn 
neo (oligo (dT17)/anchor 
system) tương tự như trong 
quy trình đối với 3’RACE và 
mồi đặc hiệu 
So sánh thư viện genome và thư viện cDNA 
Các dòng đoạn DNA 
trong thư viện genome 
Các dòng cDNA trong 
thư viện cDNA 
DNA nhiễm sắc thể 
Phiên mã 
mRNA 
sơ cấp 
mRNA 
Tạo 
mRNA 
trưởng 
thành 
Phiên mã ngược và 
nhân dòng cDNA 
Cắt bằng enzyme giới hạn 
Các đoạn 
DNA 
Nhân dòng DNA 
1. Thư viện cDNA chỉ chứa trình 
tự được phiên mã ở mRNA 
chứ không phải toàn bộ bộ 
gene 
2. Thư viện cDNA có thể không 
chứa toàn bộ gene của cơ thể. 
Thư viện genome cần chứa tất 
cả các gene của cơ thể. 
3. Nếu gen được biểu hiện mạnh 
ở một mô, thư viện cDNA có 
thể chứa nhiều bản sao của 
gen đó. Các gen không biểu 
hiện hoặc biểu hiện ở mức 
thấp có thể không có mặt trong 
thư viện cDNA. Thư viện 
genom thường chứa tất cả các 
dòng của gen nếu như gen đó 
xuất hiện nhiều trong hệ gen 
sinh vật. 
Ứng dụng của thư viện cDNA 
• Cung cấp các trình tự cho phân tích, 
khuếch đại, nhân dòng và thể hiện gen 
• Thiết kế các mẫu dò, mồi khi đã biết trình 
tự để cung cấp cho các nghiên cứu, chuẩn 
đoán tiếp theo (lai, blot, PCR, trị liệu gen..) 
• Tổng hợp hoạt chất thông qua điều khiển 
sự thể hiện của một gen nào đó trong tế 
bào chủ đặc thù. 
Ứng dụng của thư viện cDNA 
• Xác định trình tự các base và phân tích 
gene 
• Thiết kế các mẫu dò cho các gene mục 
tiêu trên nhiễm sắc thể 
• Nghiên cứu sự biểu hiện của gene 
• Tổng hợp protein nhân tạo