Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Phần 4)

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG 
(SH3014) 
1 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI 
(10 TIẾT) 
1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 
2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 
3. Các phương pháp lai phân tử 
4. Phương pháp PCR, ứng dụng 
5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 
6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 
2 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
PCR 
Polymerase Chain Reaction 
3 
Sự phát minh ra kỹ thuật PCR 
• Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi 
trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh 
vào năm 1983. 
• Hai năm sau (1985), phát minh này được chính 
thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế. 
• Với công trình này, Kary Mullis được tặng giải 
thưởng Nobel hóa học năm 1993. 
 “Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng 
được coi là một bước ngoặt hay một kỹ thuật 
mang tính cách mạng thúc đẩy sự phát triển 
của Công nghệ sinh học hiện đại” (J. Watson) 
4 
 Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép 
nhân nhanh số lượng lớn một đoạn DNA 
5 
Khái niệm 
Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã 
trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần 
lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và DNA 
thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi 
trường, y tế, dược phẩm, pháp y  
• Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của 
enzyme DNA polymerase để nhân bản 
một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi 
oligonucleotide (primer) tương hợp với hai 
đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn DNA. 
 Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện 
ra Taq polymerase, là một DNA polymerase từ vi 
khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước 
nóng 
6 
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 
7 
Sự tái bản DNA trong cơ thể sống 
• DNA khuôn: mang trình tự cần nhân 
lên 
• 2 mồi tổng hợp oligonucleotide 
 (mồi xuôi và mồi ngược) 
• dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP 
• Polymerase chịu nhiệt 
• Mg2+: cofactor của enzyme 
• Dung dịch đệm: ổn định pH và lực ion 
của dung dịch phản ứng cho phù hợp 
với hoạt động của enzyme 
8 
Thành phần của PCR 
 Có 3 giai đoạn chính trong một phản ứng PCR và 
chúng được lặp lại từ 20-40 lần. Việc này được tự 
động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng 
tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời 
gian ngắn. 
1. Biến tính (denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép 
được duỗi xoắn và tách nhau rnhờ nhiệt cao (94-95oC). 
2. Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được 
giảm xuống (55-50oC) để các mồi gắn vào các sợi DNA 
tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các base. 
3. Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA 
được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase (65-
75oC) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ 
sung với sợi khuôn từ đầu 3’ – 5. 
9 
Các giai đoạn trong phản ứng PCR 
 Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lặp đi lặp 
lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu 
được hàng triệu bản copy của một đoạn DNA nào đó, 
đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau 
10 
Chu kỳ phản ứng PCR 
Hçn hîp 
ph¶n øng 
PCR 
G§
1 
G§
2 
G§
3 
B¾t ®Çu chu kú míi 
(2) 
Nh¾c ®i nh¾c l¹i n chu 
kú 
Thêi gian (phót) 
N
h
iÖ
t 
®
é
(o
C
) 
Chu kỳ nhiệt: 
Bước 1: 94o C, 30 giây 
Bước 2: 94o C, 15 giây 
Bước 3: 55o C, 30 giây 
Bước 4: 72o C, 1.5 phút 
Bước 5: lặp lại từ bước 2-4 
trong 35 lần 
Bước 6: 72o C, 10 min 
Bước 7: 4o C f- bảo quản 
Bước 8: Kết thúc 
Thực hiện phản ứng 
THERMOCYCLER ống phản ứng PCR 
Biến t ính 
Gắn mồi 
K éo dài 
DNA copies vs Cycle number
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Cycle number
D
N
A
 c
o
p
ie
s
Số bản copy DNA và số chu kỳ nhiệt 
Số chu kỳ 
S
ố
 b
ả
n
 c
o
p
y
 D
N
A
(2n - 2n)x 
n = số chu kỳ 
x = số bản sao của DNA khuôn 
1 0 
2 0 
3 2 
4 4 
5 8 
6 16 
7 32 
8 64 
9 128 
10 256 
11 512 
12 1024 
13 2048 
14 4096 
15 8192 
16 16.384 
17 32.768 
18 65.536 
19 131.072 
20 265.144 
21 524.288 
22 1.048.576 
23 2.097.152 
24 4.194.304 
25 8.388.608 
26 16.777.216 
27 33.544.432 
Gắn mồi vào 
chuỗi DNA 
(30-65oC) 
30 giây 
Tách thành sợi 
đơn DNA 
(94oC, 30 giây) 
Tổng hợp 
chuỗi mới 
(65-75oC, 2-5 
phút) 
Khuôn DNA được biến đổi 
thành 2 sợi đơn 
(94oC, 5 phút 
Chu trình PCR 
16 
PCR animation 
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 
 Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
• DNA khuôn 
• Mồi 
• Enzyme 
• dNTPs 
• Mg2+ 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của DNA khuôn 
Độ tinh sạch của DNA khuôn 
Không cần tinh sạch lắm 
Cần tránh các chất gây ức chế phản ứng 
Hàm lượng sử dụng: 0.1 – 1 mg cho 100 mL phản 
ứng 
Hàm lượng ít: không đủ cho phản ứng khuếch đại 
Hàm lượng cao: sản phẩm không đặc hiệu 
Độ dài của trình tự mục tiêu: quá dài có thể dẫn đến 
sai sót, hoặc không thực hiện được phản ứng 
Hàm lượng GC của DNA khuôn: liên quan đến sự 
hình thành cấu trúc thứ cấp 
https://www.soils.org/publications/cs/articles/46/3/1064 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của mồi 
• Đặc điểm của mồi 
• Nồng độ mồi 
• Độ tinh sạch 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của mồi 
 Đặc trưng của mồi 
 Tính đặc hiệu: Dặc hiệu 
cho trình tự mục tiêu cần 
nhân (tránh lai không đặc 
hiệu) 
 Tính ổn định: Hình thành 
dạng sợi đôi bền vững với 
DNA khuôn trong PCR 
 Tính tương thích:Mồi 
được dùng như một cặp 
nên cần hoạt động được 
trong cùng điều kiện PCR 
 Đặc điểm của mồi thiết kế 
 Độ dài mồi 
 Hàm lượng GC 
 Nhiệt độ tách chuỗi (Tm) 
 Nhiệt độ gắn mồi 
 Chuỗi GC đầu 3’ 
 Cấu trúc thứ cấp 
 Cấu trúc kẹp tóc 
 Tự mồi 
 Tự mồi chéo 
 Các chuỗi lặp 
 Độ ổn định đầu 3’ 
 Vùng thiết kế mồi của khuôn 
Công thức tính Tm của mồi: 
 *Các mồi có kích thước ít khác nhau, có Tm gần giống 
nhau tăng hiệu quả của PCR 
Đối với mồi 20bazơ thì nhiệt độ gắn mồi 
Tm = [2 x (tổng số A + T) + 4 x (tổng số G + C)]0C 
VD: CAGCAAATATCTGTCCTTAC ==> Tm = 2x12+4 x 8 
= 560C 
Đối với mồi 20 - 35bazơ thì nhiệt độ gắn mồi 
 Tm = 22 + 1,46 [2 (tổng số G+C) + (tổng số A + T)]0C 
Đối với mồi 35 – 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi 
 Tm = 81,5 + 16,6lgC+ + 0,41 (%tổng số G+C) - 600/L 
 C: nồng độ cation hoá trị một (Na+) tính theo M, L: chiều 
dài mồi. 
 Cần xác định Tm lý thuyết rồi thử nghiệm tìm Tm tối ưu. 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của mồi 
Độ dài mồi: 
Mồi thường có kích thước 18-25 nts. 
Kích thước quá ngắn không đặc hiệu 
Kích thước quá dài giảm hiệu quả lai 
Nhiệt độ gắn mồi (Tm) 
Tm quá cao mồi khó gắn vào khuôn 
Tm quá thấp mồi bám không đặc hiệu 
Tm của mồi xuôi và mồi ngược nên tương đương 
Cần xác định Ta lý thuyết, sau đó chạy PCR với 
gradient nhiệt độ để tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu 
Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi đến kết quả PCR 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của mồi 
 Hàm lượng GC: 
 Nên nằm trong khoảng 40-60% 
 Không nên chứa polyG hoặc polyC sự bắt cặp không đặc 
hiệu của mồi. 
 Chuỗi GC đầu 3’: 
 Đầu tận cùng 3’ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG. tăng 
khả năng bắt cặp chính xác (liên kết H của G và C lớn hơn) 
 Đầu tận cùng 3’ không nên có nhiều hơn 2 gốc liên tục G/C 
 Độ ổn định đầu 3’ (khoảng 5nts đầu 3’) 
 Không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì giá trị DG cao 
 bắt cặp không đặc hiệu. 
 Nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A khó bắt cặp 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của mồi 
• Cấu trúc thứ cấp: mồi có cấu trúc thứ cấp PCR 
giảm hiệu quả, thậm chí không có sản phẩm 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của mồi 
• Các chuỗi lặp 
– Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép 
(VD: TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (VD: 
TTTT) tránh hiện tượng bắt cặp nhầm. 
– Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. 
• Vùng thiết kế mồi của khuôn 
– Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa 
nhiều cấu trúc thứ cấp. Cấu trúc này mà ổn 
định ở nhiệt độ gắn mồi mồi không bắt cặp 
được 
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của mồi 
 Nồng độ mồi 
 Nồng độ mồi quá thấp khả năng gắn mồi 
vào khuôn không hiệu quả ít hoặc không 
có sản phẩm. 
 Nồng độ mồi quá cao mồi bắt cặp không 
đặc hiệu sản phẩm không đặc hiệu. 
 Nồng độ mồi thường sử dụng 0.2 – 1 mM 
 Độ tinh sạch 
 Dung dịch mồi cần tránh có chứa các chất ức 
chế PCR và các DNA tạp nhiễm khác. 
A8 B8 C8 D8 T-
0,2 µM primers0,2 µM primers 1 µM primers1 µM primers0,6 µM primers0,6 µM primers
 Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của enzyme DNA polymearase 
• Loại enzyme: có nhiều loại enzyme DNA 
polymerase, tùy thuộc vào mục đích và điều 
kiện nghiên cứu mà lựa chọn các loại 
enzyme phù hợp 
• Nồng độ enzyme: 
– Nồng độ quá thấp lượng sản phẩm ít 
– Nống độ quá cao sản phẩm không đặc hiệu 
– Thường sử dụng 1-2 đơn vị enzyme cho thể tích 
phản ứng 25 mL 
 Ảnh hưởng của thành phần phản ứng 
 Ảnh hưởng của dNTPs, Mg2+ 
 dNTPs 
 Nồng độ của mỗi loại dNTP trong hỗn hợp phản ứng 
thường dùng là 200 mM. 
 Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP có thể 
làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. 
 Mg2+ 
 Lượng Mg2+ quá ít sản phẩm ít hoặc không có sản 
phẩm. 
 Lượng Mg2+ quá nhiều sản phẩm không đặc hiệu, 
tăng lỗi sao chép của DNA polymerase. 
 Nồng độ thường sử dụng: 2mM (có thể thay đổi trong 
khoảng 1-4 mM) 
Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ đến kết quả PCR 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Số lượng chu kỳ phản ứng 
 Giai đoạn biến tính 
 Nhiệt độ biến tính 
 Thời gian biến tính 
 Giai đoạn gắn mồi 
 Nhiệt độ gắn mồi 
 Thời gian gắn mồi 
 Giai đoạn kéo dài 
 Nhiệt độ phản ứng kéo dài mạch 
 Thời gian phản ứng kéo dài mạch 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Ảnh hưởng của số lượng chu kỳ phản ứng 
 Số lượng chu kỳ phản ứng phụ thuộc vào: 
 Lượng DNA khuôn mẫu 
 Lượng sản phẩm mong muốn 
 Trong thực tế thường không vượt quá 40 chu kỳ 
cho một phản ứng PCR vì: 
 Trong giai đoạn đầu, số lượng bản sao sẽ tăng theo 
cấp số nhân. 
 Giai đoạn sau, hiệu quả khuếch đại giảm do: 
 Sự phân hủy và cạn kiệt thành phần phản ứng 
 Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng 
 Các bản sao không bắt cặp với mồi mà bắt cặp với nhau 
  
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Giai đoạn biến tính 
• Nhiệt độ biến tính: 
– Nhiệt độ quá thấp phân tử DNA không biến tính 
hoàn toàn hiệu quả khuếch đại thấp. 
– Nhiệt độ quá cao phân tử DNA bị phân hủy, DNA 
polymerase bị mất hoạt tính phản ứng không đặc 
hiệu hoặc không xảy ra. 
– Nhiệt độ biến tính thường sử dụng: 94 – 95oC 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Giai đoạn biến tính 
• Thời gian biến tính: 
– Thời gian quá ngắn phân tử DNA không được 
biến tính hoàn toàn hiệu quả khuếch đại thấp. 
– Thời gian quá dài phân tử DNA bị phân hủy, DNA 
polymerase bị mất hoạt tính phản ứng không đặc 
hiệu hoặc không xảy ra. 
– Thời gian biến tính thường sử dụng: 
• Giai đoạn biến tính ban đầu: 3-5 phút 
• Giai đoạn biến tính trong từng chu kỳ: 30-45 giây 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Giai đoạn gắn mồi 
• Nhiệt độ gắn mồi 
– Nhiệt độ quá thấp mồi bám không đặc hiệu sản 
phẩm không đặc hiệu. 
– Nhiệt độ quá cao mồi khó bắt cặp với DNA khuôn 
 sản phẩm ít, hoặc không có sản phẩm. 
– Nhiệt độ gắn mồi sử dụng thường thấp hơn Tm của 
mồi. 
– Để tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, thường thiết lập 
phản ứng PCR theo thang nhiệt độ (các phản ứng 
chỉ khác nhau ở nhiệt độ gắn mồi). 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Giai đoạn gắn mồi 
• Thời gian gắn mồi 
– Thời gian quá ngắn mồi không đủ thời gian gắn 
vào khuôn 
– Thời gian quá dài tăng bắt cặp không chính xác 
– Thời gian gắn mồi thường sử dụng là 30 giây. 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Giai đoạn kéo dài 
• Nhiệt độ phản ứng kéo dài 
– Phụ thuộc vào loại enzyme và kích thước sản phẩm. 
VD: khi sử dụng Taq DNA polymerase 
• Đối với sản phẩm có kích thước <2kb thường dùng 
70-75oC (thường dùng 72oC) 
• Đối với sản phẩm có kích thước >6 kb thường dùng 
68oC để tránh enzyme bị biến tính. 
 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng 
 Giai đoạn kéo dài 
• Thời gian kéo dài 
– Thời gian quá ngắn trình tự mục tiêu nhân lên 
không hoàn chỉnh 
– Thời gian kéo dài mạch quá dài tạo thành sản 
phẩm không đặc hiệu 
– Tùy vào kích thước sản phẩm mong muốn và 
loại enzyme sử dụng mà thiết lập thời gian 
kéo dài mạch phù hợp. VD: đối với enzyme 
Taq DNA polymerase thời gian kéo dài 
thường sử dụng là 1 phút/1kb 
1 0 
2 0 
3 2 
4 4 
5 8 
6 16 
7 32 
8 64 
9 128 
10 256 
11 512 
12 1024 
13 2048 
14 4096 
15 8192 
16 16.384 
17 32.768 
18 65.536 
19 131.072 
20 265.144 
21 524.288 
22 1.048.576 
23 2.097.152 
24 4.194.304 
25 8.388.608 
26 16.777.216 
27 33.544.432 
Gắn mồi 
vào chuỗi 
DNA 
(30-65oC) 
30 giây 
Tách thành 
sợi đơn DNA 
(94oC, 30 giây) 
Tổng hợp 
chuỗi mới 
(65-75oC, 2-5 
phút) 
Khuôn DNA được biến 
tính thành 2 sợi đơn 
(94oC, 5 phút) 
Chu trình 
PCR 
 Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR 
• Thiết bị tiến hành PCR cần đáp ứng được yêu 
cầu thay đổi nhiệt độ nhanh và chính xác. 
• Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên mọi thí 
nghiệm trong cùng một nghiên cứu cần tiến hành 
trên cùng một loại thiết bị. 
• Mọi dụng cụ, hóa chất sử dụng cho PCR cần phải 
sạch, tránh tạp nhiễm. 
Bài tập 
• Nêu nguyên nhân và biện pháp khắc phục 
cho các trường hợp sau: 
1 2 
Trường hợp không thấy tín 
hiệu vạch hoặc tín hiệu thấp 
1: không có vạch 
2: vạch mờ 
Trường hợp sản phẩm 
không đặc hiệu 
Trường hợp tạo ra các vệt tín hiệu 
a: Xuất hiện vết chất có khối lượng phân tử nhỏ 
b: Xuất hiện vệt chất có khối lượng phân tử lớn 
a b 
47 
Các ứng dụng chủ yếu của PCR 
• Sử dụng PCR để tách dòng các đoạn DNA 
• Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền và nhiễm trùng (ung thư, 
virus, vi khuẩn, nấm) 
• Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai 
sớm qua phát hiện các đoạn gene đặc trưng của nhiễm sắc thể giới 
tính. 
• Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 
quan trọng: xác định trình tự gene, xác định tính đa hình DNA, làm 
cơ sở cho việc phân tích các chỉ thị phân tử phục vụ công tác giống 
(cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật), phát hiện các kiểu đột biến. 
• Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, xác định nhanh với 
độ chính xác cao các thủ phạm hình sự từ những dấu vết rất nhỏ: 
máu, nước dãi, sợi tóc 
• Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục 
triệu năm. 
Bệnh di truyền 
644 bp 
 440 bp 
204 bp 
Phân tích phân tử một gia đình có bệnh di truyền do gen lặn