Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Phần 3)

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) 
 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng 
gen 
 Các phương pháp lai phân tử 
 Phương pháp PCR, ứng dụng 
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA 
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 
8/26/2014 1 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
 Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế 
bổ sung (Complementarity) 
 Các dạng phức hợp lai bổ sung: 
– DNA - DNA 
– DNA - RNA 
– Protein – Protein (thường ở dạng phức hợp 
kháng nguyên – kháng thể) 
CƠ SỞ KHOA HỌC 
Lai giữa các nucleic acid 
8/26/2014 2 
Lai phân tử là quá trình kết hợp lại 
của hai mạch đơn DNA hoặc DNA-
RNA. 
Cơ sở của việc lai phân tử là các 
mối liên kết hydro giữa các base 
trên hai mạch. Giữa một base A và 
một base T (hoặc U) hình thành 
hai liên kết hydro còn giữa G và C 
hình thành ba liên kết. 
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID 
 (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) 
Lai giữa các nucleic acid 
T A 
C G 
U A 
8/26/2014 3 
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID 
 (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) 
8/26/2014 4 
• LAI SOUTHERN (DNA – DNA) 
• LAI NORTHERN (DNA – RNA) 
• LAI WESTERN (PROTEIN – PROTEIN) 
MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ 
8/26/2014 5 
So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai 
Southern, Northern và Western 
8/26/2014 6 
• Lịch sử 
– Do Edwin Southern đề xuất 
năm 1975 và sau đó được tiếp 
tục hoàn thiện. 
– Với sự phát triển của kỹ thuật 
này, Southern đã nhận được 
giải thưởng Lancaster trong 
lĩnh vực Y học vào năm 2005. 
LAI SOUTHERN 
Edwin Southern 
8/26/2014 7 
LAI SOUTHERN 
• Nguyên lý 
– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa 2 phân tử DNA mạch đơn 
(DNA-DNA) 
– Cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự 
nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong một hỗn hợp các 
đoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò đã được 
đánh dấu với đoạn DNA chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó. 
• Kỹ thuật lai Southern cho biết 
– Sự có mặt của đoạn DNA (gen) 
– Số lượng đoạn DNA có mặt (tương ứng với số gen) 
– Độ lớn của đoạn DNA 
– Trình tự tương tự giữa đoạn DNA mục tiêu và mẫu dò 
 8/26/2014 8 
Các bước tiến hành 
Bước1: Chuẩn bị DNA mẫu. 
Bước 2: Chuyển ssDNA lên màng lai 
 (giai đoạn này gồm nhiều bước) 
Bước 3: Lai ssDNA với mẫu dò 
Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 
8/26/2014 9 
1 2 3 
Mẫu nghiên cứu 
3 
Marker 
1 
Đối chứng 
2 
Bước 1: Chuẩn bị DNA mẫu 
8/26/2014 10 
Membrane 
DNA 
Gel 
Buffer 
Gel Membrane 
Giấy thấm 
Bước 2: Chuyển DNA mạch đơn lên màng lai 
8/26/2014 11 
Màng lai có mang 
các DNA mạch 
đơn 
Bổ sung chất 
“khóa” màng lai 
Phần màng lai 
không mang DNA 
được phủ bằng 
chất “khóa” màng 
lai 
Mẫu dò được phủ 
trên toàn bộ 
màng lai nhưng 
chỉ liên kết với 
các DNA bổ sung 
Bổ sung mẫu dò 
Màng lai sau khi 
rửa 
Mẫu dò chỉ còn có 
mặt ở trạng thái liên 
kết bổ sung với DNA 
Bước 3: Lai phân tử 
8/26/2014 12 
Các đoạn bổ sung 
với mẫu dò xuất 
hiện như các vạch 
băng 
Màng mang phân 
tử lai giữa mẫu dò 
và DNA Phim X-quang được 
đặt trên màng lai 
cho đến khi sự phát 
xạ từ mẫu dò được 
ghi lên phim 
Bước 4: Thu kết quả 
8/26/2014 13 
Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi 
Bước 4: Thu kết quả 
8/26/2014 14 
 8/26/2014 15 
LAI NORTHERN 
• Lịch sử 
− Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine 
và George Stark tại Stanford University. 
− Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng 
dụng cho phân tích RNA 
8/26/2014 16 
LAI NORTHERN 
• Nguyên lý 
– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA 
– Phương pháp lai Northern Blot là phương 
pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA. 
Các bước tiến hành cũng tương tự như 
phương pháp Southern blot. 
• Phương pháp này cho biết 
– Sự có mặt của mRNA trong mô 
– Mức độ thể hiện của gen 
– Độ lớn của mRNA 
– Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò 
 8/26/2014 17 
 (E) 
Vị trí xảy ra lai 
RNA-DNA 
Phân tách RNA theo kích 
thước nhờ chạy điện di 
Mẫu RNA 
Khay chứa 
dung dịch đệm 
Giá đỡ 
Tập giấy 
thấm 
Khoảng trống 
Màng lai 
Vật nặng Giấy 
 thấm 
Đặt màng lai lên trên gel, đặt giấy 
thấm, vật nặng lên trên. RNA di 
chuyển lên màng lai nhờ mao dẫn 
Bổ sung mẫu 
dò phóng xạ 
mạch đơn 
Túi lai 
Ghi nhận kết quả 
bằng phóng xạ tự ghi 
Vị trí không lai 
Bước1: chuẩn bị RNA mẫu. 
Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai 
 - Chạy điện di 
 - Chuyển RNA lên màng lai 
Bước 3: Lai RNA với mẫu dò 
Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 
Các bước tiến hành 
8/26/2014 18 
LAI WESTERN 
• Lịch sử 
− Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng 
thí nghiệm của George Stark ở Stanford. Kỹ thuật 
này đã được W. Neal Burnette đặt tên là Western 
blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot. 
8/26/2014 19 
LAI WESTERN 
• Nguyên lý 
– Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein 
với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch 
giữa kháng nguyên và kháng thể 
• Phương pháp này cho biết 
– Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của 
protein trong mô 
– Mức độ thể hiện của gen 
– Độ lớn của protein 
8/26/2014 20 
 1. Chuẩn bị mẫu protein 
2. Chạy điện di SDS-PAGE 
3. Chuyển protein lên màng 
4. Cố định màng 
5. Ủ với kháng thể và phát hiện 
Các bước tiến hành 
8/26/2014 21 
Chuẩn bị mẫu 
1. Chuẩn bị mẫu protein 
2. Chạy điện di SDS-PAGE 
3. Chuyển protein lên màng 
4. Cố định màng 
5. Ủ với kháng thể và phát hiện 
8/26/2014 22 
 Chuẩn bị mẫu 
Tách chiết protein 
Hòa tan và biến tính protein 
Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không 
tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl 
sulfate) để bọc protein với điện tích âm 
8/26/2014 23 
Chạy điện di SDS-PAGE 
1. Chuẩn bị mẫu protein 
2. Chạy điện di SDS-PAGE 
3. Chuyển protein lên màng 
4. Cố định màng 
5. Ủ với kháng thể và phát hiện 
Cực âm 
Cực dương 
8/26/2014 24 
Chuyển protein lên màng 
1. Chuẩn bị mẫu protein 
2. Chạy điện di SDS-PAGE 
3. Chuyển protein lên màng 
4. Cố định màng 
5. Ủ với kháng thể và phát hiện 
Gel 
Bọt biển 
Giấy thấm 
Màng 
Giấy thấm 
Bọt biển 
Cực âm 
Cực dương 
8/26/2014 25 
Cố định màng 
1. Chuẩn bị mẫu protein 
2. Chạy điện di SDS-PAGE 
3. Chuyển protein lên màng 
4. Cố định màng 
5. Ủ với kháng thể và phát hiện 
Sau khi sử dụng hệ thống chuyển 
protein lên màng, màng sẽ chứa 
các protein ở vị trí giống như vị trí 
của chúng ở trên gel. 
Màng được ủ với các protein “khóa” (thường sử dụng 
BSA hoặc sữa bột) để “khóa” những khoảng trống trên 
màng 
 tránh kháng thể bám vào khoảng trống của màng. 
8/26/2014 26 
Ủ với kháng thể và phát hiện 
1. Chuẩn bị mẫu protein 
2. Chạy điện di SDS-PAGE 
3. Chuyển protein lên màng 
4. Cố định màng 
5. Ủ với kháng thể và phát hiện 
8/26/2014 27 
 Ủ với kháng thể 1: trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc 
qua đêm ở 4oC. 
Kháng thể 1 gắn với kháng nguyên 
đặc hiệu. Các kháng thể không liên 
kết với kháng nguyên thì được rửa đi. 
Màng được ủ với kháng thể thứ 2, 
kháng thể này nhận biết và chỉ bám 
vào kháng thể 1. Kháng thể này liên 
kết với một phân tử cho phép chúng 
ta phát hiện được vị trí liên kết đặc 
hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể 
trên màng. 
Ủ với kháng thể và phát hiện 
 Ủ với kháng thể 2: trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng. 
8/26/2014 28 
Một số phương pháp phát hiện khác 
• Phát hiện nhờ tạo màu 
• Phát hiện nhờ quang hóa học 
• Phát hiện nhờ phóng xạ 
• Phát hiện nhờ phát huỳnh quang 
8/26/2014 29 
HRP 
Cơ chất 
VD: Hydrogen peroxide + luminol 
3-aminophtalate (nhạy với ánh sáng) 
Kháng nguyên nằm trên màng 
Kháng thể 1 
Kháng thể 2 
Ủ với kháng thể và phát hiện 
Sự phát hiện nhờ phát quang hóa học 
8/26/2014 30 
Tóm tắt quy trình thực hiện 
Western blot 
Chuẩn bị 
mẫu protein Chạy điện di SDS-PAGE 
phân tách các phân tử 
protein theo kích thước 
Chuyển protein 
lên màng lai 
Màng lai mang các 
phân tử protein có vị trí 
giống như trên bản gel 
Xử lý BSA hoặc sữa 
bột để “khóa” chỗ 
trống trên màng lai 
Màng lai được xử lý với 
kháng thể 1, kháng thể 
này bám đặc hiệu vào 
kháng nguyên (protein) 
mục tiêu 
Màng lai được xử lý 
với kháng thể thứ 2 
mang phân tử giúp 
nhận biết sự liên kết 
đặc hiệu giữa kháng 
nguyên và kháng thể. 
Kháng thể này liên 
kết với kháng thể 1. 
Bổ sung cơ chất (hoặc 
không cần), phát hiện 
vị trí lai giữa kháng 
nguyên – kháng thể 
8/26/2014 31 
 So sánh 3 phương pháp lai 
Kỹ thuật Gel Phân tử Phát hiện 
Southern agarose DNA nucleic acid 
Northern agarose RNA nucleic acid 
Western polyacrylamide Protein Kháng thể 
8/26/2014 32