Ảnh hưởng của môi trường khoáng và chất kháng vi sinh vật trong nhân giống in vitro Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata Thunb.)

3161(5) 5.2019
Khoa học Nông nghiệp
Đặt vấn đề 
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata Thunb.) thuộc 
họ Thạch sam (Huperziaceae), là cây thân thảo mọc ở đất 
[1]. Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. 
Bào tử là mầm sinh sản nhưng chúng thường không hoạt 
động hoặc hoạt động rất phức tạp, phải mất nhiều năm để 
có thể nảy mầm và phát triển. Theo nghiên cứu của Ma và 
cộng sự (2008) thì sự sinh sản của loài này rất chậm, phải 
mất 15 năm để một bào tử nảy mầm và phát triển thành cây 
trưởng thành có thể thu hoạch được [2], Wang và cộng sự 
(2011) cũng đã nghiên cứu quần thể của loài này trong tự 
nhiên tại khu Bảo tồn thiên nhiên của tỉnh Nam Hải, miền 
Nam Trung Quốc cho thấy, hầu hết các cây giống có nguồn 
gốc từ mầm [3]. Trên thế giới, Thạch tùng răng cưa được 
tìm thấy chủ yếu ở các khu rừng ẩm cận nhiệt đới và ôn 
đới với độ cao 900 đến 3.500 m ở Trung Quốc, Ấn Độ, 
Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt 
Nam, Úc và Cuba [4]. Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa 
chỉ gặp trong những khu rừng quanh năm ẩm ướt, có tầng 
mùn dày ở vùng núi cao từ 1.000 m trở lên như Lào Cai, 
Cao Bằng, Hà Giang, Quảng Trị, Quảng Nam, Ðà Nẵng, 
Khánh Hoà, Lâm Ðồng. Thạch tùng răng cưa là loài dược 
liệu quý hiếm, được đưa vào danh sách những loài dược liệu 
cần được bảo tồn và phát triển [5]. Trong y học cổ truyền, 
Thạch tùng răng cưa được sử dụng trong các bài thuốc chữa 
lợi tiểu, chống co thắt, giảm đau, cầm máu [1]. Năm 1986, 
các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được huperzine 
A từ cây Thạch tùng răng cưa, đây là hoạt chất có tác dụng 
ức chế acetylcholinesterase thế hệ thứ hai để điều trị bệnh 
Alzheimer [6]. Nghiên cứu của Vũ Bích Ngọc và cộng sự 
(2016) cũng cho thấy, hàm lượng huperzine A có trong cây 
Thạch tùng răng cưa thu được ở Đà Lạt, Lâm Đồng vào mùa 
thu là 0,0925 mg/g mẫu khô, tương đương với mẫu Thạch 
tùng răng cưa của Trung Quốc [7]. Do điều kiện sống khắt 
khe, khả năng tái sinh trong tự nhiên kém cùng với sự khai 
thác quá mức vì mục đích thương mại dẫn đến nguy cơ tuyệt 
chủng của loài cây này [5]. Nghiên cứu nhân giống bằng 
phương pháp nuôi cấy in vitro là giải pháp được nhiều tác 
giả lựa chọn như Liang (2010) [8]; Wojciech, el al. (2013) 
[9]; Kannichiro, et al. (2013) [10]; Ying-Zi, et al. (2015) 
[11]. Ở Việt Nam, Lê Thị Lan Anh và cộng sự (2018) đã 
nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng 
phương pháp giâm hom sau 4 tháng có tỷ lệ sống là 87,24% 
và tỷ lệ ra rễ là 30,32% [12]. Nhưng những kết quả nghiên 
cứu nhân giống in vitro Thạch tùng răng cưa phục vụ sản 
Ảnh hưởng của môi trường khoáng 
và chất kháng vi sinh vật trong nhân giống in vitro
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata Thunb.)
Phan Xuân Bình Minh*, Đỗ Thị Kim Trang, Nguyễn Thị Hiền
Nguyễn Phương Lan, Trần Bảo Trâm
Tóm tắt:
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata Thunb.) là loại dược liệu quý có chứa alcaloid huperzine - hoạt chất chính 
trong điều trị bệnh mất trí nhớ ở người cao tuổi. Nghiên cứu được thực hiện nhằm nhân giống in vitro cây dược liệu 
này. Nguyên liệu nuôi cấy là chồi ngọn chưa phân nhánh được khử trùng bề mặt mẫu bằng cách ngâm trong dung 
dịch NaOCl 3% trong 30 phút, sau đó tiếp tục xử lý với dung dịch H2O2 30% trong 7 phút. Kết quả cho thấy, khi sử 
dụng môi trường khoáng MS2 (gồm MS + 0,3 mg/l BAP + 0,01 mg/l IBA) có bổ sung hỗn hợp các chất kháng vi sinh 
vật gồm: 0,5 mg/l malachite xanh và 100 ml/l kháng sinh AAS (gồm 30 mg/l penicillin, 50 mg/l streptomycin và 125 
μg/l amphotericin B) cho tỷ lệ mẫu đạt yêu cầu cao nhất 56,67% sau 30 ngày nuôi cấy, chồi bắt đầu phân nhánh. Từ 
các mẫu ban đầu tiếp tục cấy chuyển sang môi trường MS1, sau 60 ngày nuôi cấy tỷ lệ mẫu phân nhánh đạt 34,11%, 
tỷ lệ mẫu ra rễ đạt 19,67% và sau 6 tháng nuôi cấy có hệ số nhân chồi là 3,48 và tỷ lệ cây ra rễ là 53,12%.
Từ khóa: chất kháng vi sinh vật, môi trường khoáng, nuôi cấy mô tế bào, Thạch tùng răng cưa.
Chỉ số phân loại: 4.1
*Tác giả liên hệ: Email: pxbminh@gmail.com.
Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ 
Ngày nhận bài 9/11/2018; ngày chuyển phản biện 12/11/2018; ngày nhận phản biện 6/12/2018; ngày chấp nhận đăng 10/12/2018
3261(5) 5.2019
Khoa học Nông nghiệp
xuất dược liệu còn hạn chế, vì vậy việc nhân giống in vitro 
được cây Thạch tùng răng cưa sẽ tạo hướng phát triển cho 
vùng trồng loài dược liệu này.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 
Vật liệu
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata Thunb.) trưởng 
thành cao từ 10 đến 15 cm thu hái ngoài tự nhiên tại Sa Pa 
(Lào Cai) được đưa về trồng tại vườn ươm của Trung tâm 
Sinh học Thực nghiệm. Nguyên liệu sử dụng là các chồi 
ngọn chưa phân nhánh dài khoảng 3-4 cm.
Bố trí thí nghiệm
Điều kiện khử trùng: sử dụng 9 công thức như trong 
bảng 1.
Bảng 1. Các công thức khử trùng.
Công thức Điều kiện khử trùng Môi trường nuôi cấy
CT1
Dung dịch NaOCl 3% 
trong 40 phút 
MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT2 1/2 MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT3 Mr + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT4
Dung dịch H
2
O
2
 30% 
trong 10 phút
MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT5 1/2 MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT6 Mr + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT7 Dung dịch NaOCl 3% 
trong 30 phút và Dung 
dịch H
2
O
2
 30% trong 
7 phút
MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT8 1/2 MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
CT9 Mr + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP 
Ghi chú: MS (Murashige and Skoog); Mr (Moore); BAP (6-Benzylaminopurine).
Môi trường nuôi cấy: sử dụng 6 công thức như trong 
bảng 2.
Bảng 2. Các môi trường nuôi cấy.
Công thức Môi trường nuôi cấy
MS1 MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP + 0,01 mg IBA/L 
MS2 MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP + 0,01 mg IBA + 100 ml 
hỗn hợp chất kháng vi sinh vật/L
1/2 MS1 1/2 MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP + 0,01 mg IBA/L 
1/2 MS2 1/2 MS + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP + 0,01 mg IBA + 100 ml 
hỗn hợp chất kháng vi sinh vật/L
Mr1 Mr + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP + 0,01 mg IBA/L 
Mr2 Mr + 8 g agar + 30 g đường + 0,3 mg BAP + 0,01 mg IBA + 100 ml hỗn 
hợp chất kháng vi sinh vật/L
Ghi chú: IBA (Indolbutylie acid).
Trong đó, hỗn hợp chất kháng vi sinh vật (/L) gồm: 0,5 
mg malachite xanh (chất kháng nấm) và kháng sinh AAS 
(gồm 30 mg penicillin, 50 mg streptomycin và 125 μg 
amphotericin B) [11]. 
Thời gian nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất 
kháng vi sinh vật: sử dụng 3 công thức như trong bảng 3.
Effect of mineral medium 
and antimicrobial mixture
on the in vitro propagation 
of Huperzia serrata Thunb.
Xuan Binh Minh Phan*, Thi Kim Trang Do, 
Thi Hien Nguyen, Phuong Lan Nguyen, Bao Tram Tran
Center for Experimental Biology, 
National Center for Technological Progress
Received 9 November 2018; accepted 10 December 2018 
Abstract:
Huperzia serrata Thunb. is a valuable medicinal 
plant containing alcaloid huperzine - a major active 
compound in the treatment of Alzheimer’s disease in the 
elderly. The aim of this study is to propagate H. serrata 
using the in vitro methods. The samples (crown buds 
without branching) were sterilised by immersing in the 
solution of NaOCl 3% in 30 minutes, then treating with 
30% H2O2 solution for 7 minutes. The results showed 
that using the MS2 medium (including MS + 0.3 mg/l 
BAP + 0.01 mg/l IBA) supplemented with a mixture 
of antimicrobial substances that consisted of 0.5 mg/l 
malachite green and 100 ml/l antibiotic AAS (including 
30 mg/l penicillin, 50 mg/l streptomycin and 125 μg/l 
amphotericin B) gave the highest rate of the successful 
samples at 56.67% after 30 days of cultivation and 
shoots began to branch. The initial successful samples 
continued being transplanted into the MS1 medium, 
and then the branching rate and the rate of rooting 
reached 34.11% and 19.67%, respectively after 60 days 
of cultivation. After 6 months, shoots grew by 3.48 times 
and the rate of rooting was up to 53.12%.
Keywords: antimicrobial mixture, Huperzia serrata 
Thunb., in vitro propagation, mineral medium.
Classification number: 4.1
3361(5) 5.2019
Khoa học Nông nghiệp
Bảng 3. Thời gian (TG) nuôi cấy.
Công thức
Thời gian nuôi cấy trong môi trường 
có bổ sung chất kháng vi sinh vật (ngày)
Đối chứng (Đ/C) 0
TG1 30
TG2 60
Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu không nhiễm, tỷ lệ mẫu 
sống, tỷ lệ mẫu phân nhánh, tỷ lệ mẫu ra rễ sau 30 ngày và 
60 ngày nuôi cấy.
 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng: sử dụng 9 công 
thức như bảng 4. 
Bảng 4. Các công thức sử dụng chất điều hòa sinh trưởng.
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l)
ST1
0,1
0
ST2 0,01
ST3 0,02
ST4
0,3
0
ST5 0,01
ST6 0,02
ST7
0,5
0
ST8 0,01
ST9 0,02
Môi trường nuôi cấy là: MS + 8 g agar + 30 g đường, 
các chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi, chiều cao cây, tỷ lệ 
cây ra rễ sau 60 ngày và 120 ngày nuôi cấy. 
Mẫu thí nghiệm được nuôi cấy trong môi trường có pH 
5,5, trong điều kiện nhiệt độ 25±20C; cường độ chiếu sáng 
2000 lux, thời gian chiếu sáng 12 h/ngày. Các thí nghiệm 
được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí 
nghiệm được lặp lại 3 lần. Các số liệu thu được là giá trị 
trung bình của 3 lần lặp lại. 
Xử lý số liệu: số liệu được xử lý trên phần mềm IRISTAT 
5.0.
Kết quả và thảo luận 
Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng và môi trường 
khoáng đến vật liệu nuôi cấy in vitro Thạch tùng răng cưa 
Thạch tùng răng cưa là cây thân thảo mọc trên đất ẩm, 
hơn nữa thân lại có vẩy và lá mọc dày nên khả năng nhiễm 
vi sinh vật rất cao. Chính vì vậy việc làm sạch bề mặt mẫu 
là khâu hết sức quan trọng trước khi đưa mẫu vào nuôi cấy. 
Kết quả nghiên cứu về điều kiện khử trùng và môi trường 
khoáng được thể hiện ở bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của chất khử trùng và môi trường khoáng 
đến quá trình tạo vật liệu khởi đầu trong nhân giống in vitro 
Thạch tùng răng cưa.
Công thức 
Sau 30 ngày nuôi cấy Sau 60 ngày nuôi cấy
Tỷ lệ mẫu 
không nhiễm 
(%)
Tỷ lệ mẫu 
sống (%)
Tỷ lệ mẫu 
không nhiễm 
(%)
Tỷ lệ mẫu 
sống (%)
CT1 12,43b 8,15d 3,17d 2,33d
CT2 11,67bc 6,37f 2,67e 1,63e
CT3 11,14c 4,72g 2,31e 0f
CT4 13,21b 10,72c 4,81c 2,57d
CT5 12,09b 7,69e 3,23d 1,91e
CT6 11,93bc 4,06g 2,14 0f
CT7 18,87a 18,83a 14,67a 13,33a
CT8 18,89a 17,27b 14,33a 11,22b
CT9 17,33ab 10,21c 12,67b 8,23c
LSD
0,05
1,71 1,53 1,63 1,57
Ghi chú: LSD
0,05 
là sai số nhỏ nhất có ý nghĩa ở mức cho phép là 5%. Những 
chữ cái khác nhau (a, b, c) trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa 
ở mức LSD.
Kết quả cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy ở hầu hết các 
công thức thí nghiệm đều có tỷ lệ nhiễm nấm rất cao (80-
90%), sau 60 ngày nuôi cấy mẫu vẫn tiếp tục bị nhiễm. Đối 
với các mẫu sử dụng một dung dịch khử trùng, tỷ lệ nhiễm 
nấm lên đến hơn 90% dẫn đến tỷ lệ mẫu sống cũng rất thấp 
hoặc chết toàn bộ (mẫu chỉ khử trùng bằng NaOCl hoặc 
H
2
O
2
 trong môi trường khoáng Mr). Chỉ có mẫu được khử 
trùng bằng dung dịch NaOCl 3% trong 30 phút và dung dịch 
H
2
O
2
 30% trong 7 phút cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ mẫu 
không nhiễm >10% và tỷ lệ mẫu sống cũng không thấp hơn 
nhiều (1-4%). Do Thạch tùng có thời gian tạo vật liệu khởi 
đầu kéo dài (30-60 ngày) nên khả năng nhiễm nấm nội sinh 
trong mẫu gây ra trong quá trình nuôi cấy rất cao. Chính 
vì vậy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành bổ sung một số chất 
kháng vi sinh vật với nồng độ thấp nhằm kiểm soát hiệu 
quả hiện tượng nhiễm bệnh trong môi trường mà không 
gây bất lợi cho sự sinh trưởng của tế bào thực vật nuôi cấy. 
Khử trùng mẫu bằng dung dịch NaOCl 3% trong 30 phút 
và dung dịch H
2
O
2
 30% trong 7 phút là lựa chọn của nghiên 
cứu này để tiếp tục thử nghiệm trong các môi trường nuôi 
cấy khác nhau. Kết quả được thống kê trong bảng 6.
3461(5) 5.2019
Khoa học Nông nghiệp
Bảng 6. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng kháng 
vi sinh vật trong nhân giống in vitro Thạch tùng răng cưa.
Công thức 
Sau 30 ngày nuôi cấy Sau 60 ngày nuôi cấy
Tỷ lệ mẫu 
không 
nhiễm (%)
Tỷ lệ mẫu 
sống (%)
Tỷ lệ mẫu 
không nhiễm 
(%)
Tỷ lệ 
mẫu sống 
(%)
MS1 18,31d 17,63d 14,74d 13,07d
MS2 65,56a 62,43a 64,89a 56,67a
1/2 MS1 18,27d 15,25e 13,41de 11,65e
1/2 MS2 63,84b 52,67b 48,22b 37,78b
Mr1 17,21de 9,73f 12,78e 7,83f
Mr2 62,33c 47,23c 42,56c 32,73c
LSD
0.05
1,54 1, 84 1,49 1,72
Ghi chú: LSD
0,05 
sai số nhỏ nhất có ý nghĩa ở mức cho phép là 5%. Những 
chữ cái khác nhau (a, b, c) trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa 
ở mức LSD.
Kết quả cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy ở các công thức 
không bổ sung chất kháng vi sinh vật (MS1, 1/2 MS1, Mr1) 
tỷ lệ mẫu không nhiễm đều rất thấp (<20%) và sau 60 ngày 
nuôi cấy các mẫu này vẫn tiếp tục bị nhiễm (tỷ lệ mẫu không 
nhiễm còn dưới <15%), dẫn đến tỷ lệ mẫu sống cũng rất 
thấp, có mẫu dưới 10% (công thức Mr1). Trong khi đó, cả 3 
thí nghiệm có bổ sung chất kháng vi sinh vật sau 30 ngày tỷ 
lệ mẫu không nhiễm đạt >60%, sau 60 ngày tỷ lệ mẫu không 
nhiễm vẫn đạt >40%. Bên cạnh đó, tỷ lệ mẫu sống sau 30 
ngày nuôi cấy đều >40% và sau 60 ngày nuôi cấy đạt >30%. 
Kết quả này cho thấy, việc bổ sung chất kháng vi sinh vật 
vào môi trường nuôi cấy là phương pháp khá hiệu quả trong 
việc ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật, và nồng độ các 
chất kháng vi sinh vật được bổ sung vào môi trường cũng 
vừa đủ để hạn chế ảnh hưởng đến các tế bào thực vật. Kết 
quả này cũng hoàn toàn tương tự như nghiên cứu của nhóm 
tác giả Ying-Zi (2015) trong nhân giống in vitro Thạch tùng 
răng cưa của Trung Quốc [11]. 
Việc sử dụng môi trường khoáng thích hợp có tác dụng 
bổ sung nguồn khoáng kịp thời, giúp các tế bào đủ dinh 
dưỡng để hồi phục và phát triển sau những tổn thương do 
khử trùng và những hạn chế do sử dụng chất kháng vi sinh 
vật. Kết quả bảng 5 và bảng 6 đều cho thấy, môi trường MS 
là môi trường thích hợp cho sự hồi phục và tái sinh của chồi 
ngọn Thạch tùng răng cưa, trong đó môi trường MS2 cho 
kết quả cao nhất với tỷ lệ mẫu không nhiễm là 64,89 và tỷ 
lệ mẫu sống là 56,67%. So sánh với các nghiên cứu khác 
cho thấy: Liang (2010) khi nhân Thạch tùng răng cưa nuôi 
cấy trong môi trường 1/2 MS bổ sung IBA và BA ở nồng 
độ thích hợp không những gia tăng về sinh khối mà còn gia 
tăng sự tổng hợp huperzine [8]; nghiên cứu của nhóm tác 
giả Wojciech J. Szypuła (2013) đã xác định môi trường Mr 
bổ sung 0,015 mg/l IBA và 0,3 mg/l kinetin là môi trường 
thích hợp cho sự gia tăng sinh khối của Huperzia selago 
khi nhân nuôi bằng bào tử [9], hay như nghiên cứu nhân 
giống Huperzia serrata của Ying-Zi và cộng sự (2015) lại 
cho rằng, môi trường MS thích hợp cho sự phân nhánh của 
chồi ngọn [11]. 
Ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất kháng vi sinh 
vật đến sinh trưởng và phát triển của chồi Thạch tùng 
răng cưa nuôi cấy in vitro
Việc bổ sung chất kháng vi sinh vật trong thời gian bao 
lâu để vừa có tác dụng kháng vi sinh vật, vừa không ảnh 
hưởng nhiều đến sự sinh trường và phát triển của chồi là yếu 
tố cần được xem xét tiếp theo. Môi trường MS2 được lựa 
chọn trong nghiên cứu này để đánh giá ảnh hưởng của thời 
gian bổ sung chất kháng vi sinh vật vào môi trường nuôi 
cấy. Kết quả được thể hiện trong bảng 7. 
Bảng 7. Ảnh hưởng của của thời gian bổ sung chất kháng vi sinh 
vật đến sinh trưởng và phát triển của chồi.
Công 
thức 
Sau 30 ngày nuôi cấy Sau 60 ngày nuôi cấy
Tỷ lệ 
chồi đạt 
(%)
Tỷ lệ chồi 
phân 
nhánh 
(%)
Tỷ lệ 
chồi ra 
rễ (%)
Tỷ lệ 
chồi 
đạt 
(%)
Tỷ lệ chồi 
phân 
nhánh 
(%)
Tỷ lệ 
chồi ra 
rễ (%)
Đ/C 17,63b 2,31a 0 13,07c 4,47c 2,09c
TG1 62,34a 1,78ab 0 51,33b 34,11a 19,67a
TG2 62,27a 2,00a 0 56,67a 23,33b 8,81b
LSD
0,05
2,14 1,07 0 2.31 2,84 2,63
Ghi chú: LSD
0,05 
là sai số nhỏ nhất có ý nghĩa ở mức cho phép là 5%. Những 
chữ cái khác nhau (a, b, c) trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa 
ở mức LSD.
Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ mẫu đạt ở công thức thí 
nghiệm sau 60 ngày nuôi cấy >50% không thấp hơn nhiều 
so với tỷ lệ mẫu đạt sau 30 ngày nuôi cấy tỷ lệ mẫu đạt 
là >60%, và sau 60 ngày nuôi cấy ở công thức không bổ 
sung chất kháng vi sinh vật tỷ lệ mẫu đạt cũng không thấp 
hơn nhiều so với công thức bổ sung chất kháng vi sinh vật 
(5,34%). Điều đó cho thấy, việc bổ sung chất kháng vi sinh 
vật trong vòng 30 ngày đầu đã ức chế được nấm nội sinh. 
Nhưng nếu tiếp tục bổ sung chất kháng vi sinh vật trong 30 
ngày tiếp theo sẽ ức chế sự phát triển của tế bào, điển hình 
là tỷ lệ mẫu phân nhánh ở công thức TG1 cao hơn TG2 là 
10,78% và tỷ lệ mẫu ra rễ cũng cao hơn là 10,86%. Vậy việc 
bổ sung chất kháng vi sinh vật là cần thiết, nhưng chỉ nên 
bổ sung trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu (30 ngày đầu 
nuôi cấy). 
3561(5) 5.2019
Khoa học Nông nghiệp
Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sinh 
trưởng và phát triển của Thạch tùng răng cưa nuôi cấy 
in vitro
Vật liệu sau 60 ngày nuôi cấy được cấy chuyển sang môi 
trường có bổ sung nồng độ BAP và IBA khác nhau để đánh 
giá sự sinh trưởng và phát triển của chồi .Kết quả được thể 
hiện ở bảng 8.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, BAP ảnh hưởng đến hệ 
số nhân và chiều cao của chồi, ở các công thức bổ sung 
0,3 mg BAP/l môi trường thì hệ số nhân và chiều cao của 
chồi Thạch tùng răng cưa phát triển tốt hơn nhiều so với ở 
các công thức có nồng độ 0,1 mg BAP/l môi trường nhưng 
ở các công thức có nồng độ 0,5 mg BAP/l môi trường thì 
hệ số nhân chồi và chiều cao chồi lại không tăng do mẫu 
hình thành nhiều các mô sẹo. Kết quả này tương tự như kết 
quả nghiên cứu của Wojciech và công sự trên đối tượng H. 
selago. Còn IBA ảnh hưởng đến quả trình ra rễ và sự phát 
triển của lá, ở các công thức bổ sung 0,01 mg IBA/l môi 
trường cây phát triển đồng đều và có tỷ lệ ra rễ tốt nhất, ở 
các công thức không bổ sung 0,01 mg IBA cây ra rễ chậm 
hơn và sự phát triển của cây cũng kém hơn, còn ở các công 
thức có bổ sung 0,02 mg IBA/l môi trường không làm tăng 
tỷ lệ ra rễ cho cây mà làm tăng lượng rễ trên cây ở mức 
không cần thiết. Vậy môi trường thích hợp cho nhân giống 
in vitro Thạch tùng răng cưa là MS + 0,3 mg BAP + 0,01 
mg IBA (trong 1l môi trường).
Bảng 8. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến 
sự sinh trưởng và phát triển của Thạch tùng răng cưa nuôi cấy in 
vitro.
Công 
thức 
Sau 60 ngày nuôi cấy Sau 120 ngày nuôi cấy
Hệ số 
nhân 
chồi
Chiều 
cao 
Trung 
bình của 
chồi (mm)
Tỷ lệ 
chồi ra 
rễ (%)
Hệ số 
nhân 
chồi
Chiều cao 
Trung 
bình của 
chồi (mm)
Tỷ lệ 
chồi ra 
rễ (%)
ST1 1,27f 7,2f 17,32f 1,43g 13,4f 32,18g
ST2 1,83d 9,7d 21,16de 2,07e 16,5d 38,2f
ST3 1,46e 8,3e 23,47c 1,92f 14,8e 42,21e
ST4 2,08c 13,1a 20,21e 2,51cd 21,3a 47,62bc
ST5 2,45a 12,9a 27,31a 3,48a 21,1a 53,12a
ST6 2,21b 11,3bc 24,63bc 2,95b 19,7bc 48,31b
ST7 2,36ab 12, 4ab 22,72cd 2,86bc 20,3b 44,72d
ST8 2,14bc 11,6b 25,37b 2,62c 19,1c 46,26c
ST9 1,96cd 10,7c 21,87d 2,31d 18,6cd 43,56de
LSD
0.05
0,21 0,9 1,62 0,23 1,2 2,34
Ghi chú: LSD
0,05 
là sai số nhỏ nhất có ý nghĩa ở mức cho phép là 5% . Những 
chữ cái khác nhau (a, b, c) trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa 
ở mức LSD.
Hình 1. Thạch tùng răng cưa. A) Nguyên liệu ban đầu; B) Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS2 sau 30 ngày; C) Mẫu nuôi cấy trong môi 
trường MS2 sau 30 ngày và cấy chuyển sang môi trường MS1 30 ngày; D) Mẫu nuôi cấy trong môi trường MS1 sau 60 ngày; E) Mẫu nuôi cấy 
trong môi trường MS1 sau 120 ngày; F) Cây con nuôi cấy in vitro.
(A) (B) (C)
(F)(E)(D)
3661(5) 5.2019
Khoa học Nông nghiệp
Kết luận 
Điều kiện khử trùng thích hợp cho mẫu Thạch tùng răng 
cưa là bằng dung dịch NaOCl 3% trong 30 phút và dung 
dịch H
2
O
2
 30% trong 7 phút, nhưng để việc khử trùng đạt 
hiệu quả cao cần bổ sung chất kháng vi sinh vật vào môi 
trường nuôi cấy in vitro nhằm hạn chế sự phát triển của các 
vi sinh vật nội sinh. Môi trường thích hợp cho nhân giống in 
vitro Thạch tùng răng cưa là MS + 0,3 mg BAP + 0,01 mg 
IBA (trong 1l môi trường) có bổ sung hỗn hợp chất kháng 
vi sinh vật trong 30 ngày đầu nuôi cấy.
LỜI CẢM ƠN
Các tác giả trân trọng cảm ơn Trung tâm Sinh học Thực 
nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ đã hỗ trợ kinh phí cho 
nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, 
tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
[2] X. Ma, C. Tan (2008), “In vitro production of Huperzine A, 
apromising drug candidate for Alzheimer’s disease”, Phytochemistry, 
69(10), pp.2022-1028.
[3] Y. Wang, Q.G. Zeng (2011), “Isolation and characterization 
of endophytic huperzine A- produing fungi from Huperzia serrate”, 
Plant Science, 168, pp.1443- 1452.
[4] J.G. Ai, Y.Q. Zhang (2005), “Study on community property of 
Huperzia serrata habitat in Tianmushan nature reserves”, J. Zhejiang 
Sci. Technol., 25, pp.14-17.
[5] Nông Văn Duy (2015), Tình hình nghiên cứu Thạch tùng răng 
cưa tại Việt Nam, Nhà xuất bản Tây Nguyên.
[6] J.S. Liu, C.M. Yu, Y.Z. Zhou, Y.Y. Han, B.R. Qi, Y.L. Zhu 
(1986), “Study on the chemistry of Huperzine A and B”. Acta Chimica 
Sinica, 44, pp.1035-1040.
[7] Vũ Bích Ngọc, Phạm Thị Hạnh, Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Tiến 
Đạt, Lê Thị Bích Thủy (2016), “Định tính và định lượng Huperzine A 
trong cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrate) ở Đà Lạt, tỉnh Lâm 
Đồng”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 14(3), tr.473-478.
[8] H. Liang (2010), “Establishment of the tissue culture system 
of Huperzia serrata and effects of phytohormones on multiple shoot 
growth and Huperzine A accumulation”, Thesis Master, Hefei Univ. 
Tech., Hefei.
[9] Wojciech J. Szypuła, Paulina Mistrzak, Olga Olszowska 
(2013), “A new and fast method to obtain in vitro cultures of Huperzia 
selago (Huperziaceae) porophytes, a club moss which is a source of 
huperzine A”, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 82(4), pp.313-
320.
[10] Kanichiro Ishiuchi, Jeong-Jin Park, Robert M. Long, David 
R. Gang (2013), “Production of huperzine A and other Lycopodium 
alkaloids in Huperzia species grown under controlled conditions and 
in vitro”, Phytochemistry, 9, pp.208-219.
[11] Ying-Zi MA, LIU Jiang-Hai, XU Huan, LIU Fen (2015), “In 
Vitro Culture of Huperzia serrata”, Plant Physiology Journal, 51(4), 
pp.465- 470.
[12] Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Bùi Tuấn Anh, 
Hồ Thị Hương, Ngô Thị Thùy Linh, Lê Thị Bích Thủy, Nguyễn Đức 
Thành (2018), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài Thạch tùng răng 
cưa Huperzia serrate bằng phương pháp giâm cành”, Kỷ yếu Hội thảo 
khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, tr.1411-1416.