Xây dựng quy trình định lượng testosteron trong lộc nhung (Cornu cervi parvum) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 86
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TESTOSTERON TRONG 
LỘC NHUNG (Cornu cervi parvum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP 
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 
 Nguyễn Đức Học*; Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương* 
 Lê Minh Hoàng**; Trịnh Thanh Hùng***; Võ Quang Hợp* 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi 
parvum) bằng HPLC. Đối tượng và phương pháp: mẫu Lộc nhung do Công ty Dược liệu Sơn 
Lâm cung cấp, thu mua tại Hương Sơn, Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV. Xây 
dựng và thẩm định phương pháp định lượng theo hướng dẫn của ICH, Bộ Y tế Việt Nam. Kết 
quả: xác định được điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV 
đo ở 254 nm, dung môi pha động là ACN:H2O chạy theo chương trình gradient, tốc độ dòng 0,8 
ml/phút, nhiệt độ cột 300C. Phương pháp đã được thẩm định, bảo đảm các yêu cầu của 
phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn 
định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD). Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được 
phương pháp định lượng testosteron trong Lộc nhung bằng phương pháp HPLC, áp dụng quy 
trình trên để định lượng một số mẫu Lộc nhung trên thị trường. 
* Từ khóa: Lộc nhung (Cornu cervi parvum); Testosteron; HPLC. 
Determination of Testosterone from Deer Velvet (Cornu cervi parvum) 
using HPLC 
Summary 
Objectives: Establishment and validation of testosterone from deer velvet (Cornu cervi parvum) 
using HPLC. Materials and methods: Deer velvet was supported by Sonlam company that was 
harvested from Hatinh province, passed requirement of Vietnamese Pharmacopoeia, Ed. 4th. 
The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline. 
Results: The quantification method of testosterone from deer velvet was established and 
validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ. Conclusions: 
The quantification method of testosterone from deer velvet was validated fully in accordance 
with ICH and Vietnam Ministry of Health. 
* Key words: Cornu cervi parvum; Testosterone; HPLC. 
* Học viện Quân y 
** Đại học Y Dược Cần Thơ 
*** Bộ Khoa học và Công nghệ 
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương ([email protected]) 
Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/08/2016 
 Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 87 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Lộc nhung (Cornu cervi parvum) là vị 
thuốc quý, được lấy từ sừng non của hươu 
hoặc nai đực. Lộc nhung có tác dụng 
tăng cường sinh lực, giảm mệt mỏi, giúp 
vết thương mau lành, lợi tiểu, tăng nhu 
động ruột và dạ dày, giúp chuyển hóa tốt 
protid và gluxit [2]. Đặc biệt, Lộc nhung 
còn có tác dụng tốt cho nam giới, giúp 
sinh tinh, bổ huyết, chữa liệt dương, hoạt 
tinh, mạnh gân cốt, dùng cho mọi trường 
hợp hư tổn cơ thể [2, 3]. Trong Lộc nhung 
chứa nhiều thành phần tốt cho sức khoẻ 
như: các khoáng chất và yếu tố vi lượng, 
các axit amin và nội tiết tố (testosteron, 
estron, cortison) [2, 3]. Trong đó, testosteron 
có tác dụng tăng cường khả năng sinh 
tinh, chữa liệt dương... [2, 3]. Tuy nhiên, 
hoạt chất này trong Lộc nhung vẫn chưa 
được quan tâm và nghiên cứu nhiều về 
phương pháp định lượng. Dược điển Việt 
Nam IV đã có chuyên luận riêng, nhưng 
các chỉ tiêu chất lượng chỉ dừng lại ở 
mức định tính [1]. Vì vậy, chúng tôi thực 
hiện nghiên cứu này nhằm: Cung cấp cơ 
sở khoa học để đánh giá chất lượng Lộc 
nhung thông qua việc định lượng testosteron 
bằng HPLC. 
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ 
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
1. Nguyên liệu và thiết bị. 
- Lộc nhung thu mua tại Hương Sơn, 
Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt 
Nam IV (do Công ty Dược liệu Sơn Lâm, 
Hà Nội cung cấp); một số mẫu Lộc nhung 
khác thu mua trong khu vực Hà Nội. 
- Chất chuẩn testosteron (99,5%, Lot. 
3580002, SERVA Electrophoresis, Đức). 
- Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt 
tiêu chuẩn phân tích. 
2. Phương pháp nghiên cứu. 
Định lượng testosteron trong Lộc nhung 
bằng phương pháp HPLC. Thẩm định 
phương pháp thực hiện theo chỉ dẫn của 
ICH và Bộ Y tế Việt Nam gồm: tính đặc 
hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính 
xác, giới hạn định lượng và giới hạn phát 
hiện [1, 4]. 
- Mẫu chuẩn: chuẩn làm việc có nồng 
độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml. 
- Mẫu thử: khảo sát các phương pháp 
xử lý mẫu khác nhau: 
+ Phương pháp 1 (không qua cột chiết 
pha rắn): cân chính xác 10,0 g bột Lộc 
nhung đã được nghiền nhỏ và rây qua rây 
355/180 (bột nửa mịn) vào bình nón có 
nút mài, chiết siêu âm bằng EtOH 90% 
trong 2 giờ ở 600C (40 ml x 2 lần). Ly tâm 
(5.000 vòng/phút × 5 phút) lấy dịch chiết. 
Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức 
100 ml, bổ sung vừa đủ thể tích. Hút 
chính xác 20 ml dịch chiết cho vào bình 
cô quay chân không đến cắn. Hòa tan 
cắn bằng 1,0 ml MeOH. Lấy 100 µl dịch ở 
trên, tủa protein bằng 10 µl axít percloric 
50%. Sau đó, trung hòa axít bằng 10 µl 
NaOH 0,3 M. Ly tâm dịch ở tốc độ 12.000 
vòng/phút x 10 phút, thu được dịch trong 
dùng để phân tích HPLC. 
+ Phương pháp 2 (sử dụng cột chiết 
pha rắn SPE-C18): tiến hành tương tự 
như phương pháp 1 đến bước cô quay 
chân không. Hòa tan cắn bằng 2 ml 
MeOH 25%, chuyển vào cột chiết pha rắn 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 88
SPE đã được hoạt hóa trước (5 ml MeOH 
25% × 2 lần, 5 ml nước cất). Rửa loại tạp 
chất bằng 5 ml nước cất x 2 lần. Rửa giải 
bằng 2 ml MeOH. Tất cả các bước loại 
tạp và rửa giải trên được thực hiện với 
tốc độ 30 - 45 giọt/phút. Đem dịch rửa giải 
cô dưới áp suất giảm ở 600C tới cắn, hòa 
tan cắn trong 200 µl MeOH. Ly tâm ở tốc 
độ 12.000 vòng/phút thu được dịch trong 
dùng để phân tích HPLC. 
- Mẫu trắng: mẫu MeOH được thực 
hiện đầy đủ theo các bước như phương 
pháp 1. 
- Điều kiện sắc ký: cột Sunfire C18 
(250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV đo ở 
254 nm, dung môi pha động là ACN:H2O 
chạy theo chương trình gradient hoặc 
đẳng dòng, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt 
độ cột 300C. Thể tích bơm mẫu 10 µl. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
1. Lựa chọn điều kiện sắc ký. 
Khảo sát với hai điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), 
detector UV đo ở bước sóng 254 nm, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 300C. 
Trong đó dung môi pha động sử dụng ACN (A):H2O (B) với 2 điều kiện khác nhau. 
Điều kiện (1) chạy đẳng dòng với tỷ lệ 47:53; điều kiện (2) chạy theo chương trình 
gradient 0 → 20 phút, 30% A → 60% A; 20 → 30 phút, 60% A. 
Hình 1: Sắc ký đồ testosteron chuẩn ở điều kiện 1 (a), 
điều kiện 2 (b) và mẫu Lộc nhung ở điều kiện 2 (c). 
Từ hình ảnh sắc ký đồ của testosteron ở 2 điều kiện trên cho thấy: ở điều kiện 1, 
thời gian lưu của testosteron khoảng 10,77 phút, nhưng píc gioãng, không cân đối. 
Ở điều kiện 2, thời gian lưu của testosteron khoảng 18,3 phút với píc cân đối và khả 
năng phân tách tốt. 
10
.
77
0
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
Minutes
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00
18
.
21
4
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
Minutes
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00
18
.
32
3
AU
0.00
0.02
0.04
Minutes
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00
(a) 
(c) 
(b) 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 89 
Để kiểm tra điều kiện sắc ký có phù 
hợp với phân tích mẫu thử, tiến hành 
chạy sắc ký với mẫu thử Lộc nhung (có 
sử dụng cột chiết SPE) theo điều kiện 2. 
Kết quả phân tích cho thấy: píc của 
testosteron trong mẫu thử cân đối, sắc 
nét, thời gian lưu tương ứng với thời gian 
lưu của píc testosteron chuẩn và tách 
khỏi píc tạp. 
Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn 
được điều kiện sắc ký HPLC cho phân 
tích định lượng testosteron trong Lộc nhung 
như sau: 
- Cột sắc ký: Sunfire RP-C18 (250 x 
4,6 mm; 5 µm, 100A0). 
- Detetor UV đo ở bước sóng 254 nm. 
- Pha động: ACN:nước cất chạy theo 
chương trình gradient. 
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. 
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. 
- Nhiệt độ cột: 300C. 
2. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu. 
Tiến hành xử lý mẫu theo 2 phương 
pháp: sử dụng và không sử dụng cột chiết 
pha rắn như nêu ở phương pháp nghiên 
cứu. Phân tích sắc ký theo điều kiện đã 
lựa chọn được trình bày ở mục 1. Sắc ký 
đồ của mẫu thử được xử lý theo 2 phương 
pháp được trình bày trong hình 2. 
Hình 2: Sắc ký đồ của mẫu thử được xử lý theo phương pháp 1 (a) và 
phương pháp 2 (b). 
Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy: khi không sử dụng cột chiết pha rắn, mẫu còn 
nhiều tạp chất, píc testosteron tách không hoàn toàn ra khỏi píc tạp. Trong khi đó, 
ở mẫu sử dụng cột chiết pha rắn, tạp chất giảm nhiều, píc của testosteron tách rõ 
ràng ra khỏi píc tạp, ít làm bẩn cột phân tích, góp phần kéo dài tuổi thọ cột. Từ kết 
quả này, chúng tôi lựa chọn phương pháp xử lý mẫu có sử dụng cột chiết pha rắn 
SPE-C18. 
18
.
47
8
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
Minutes
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
18
.
48
9
AU
0.000
0.010
0.020
0.030
0.040
0.050
Minutes
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
(a) 
(b) 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 90
3. Thẩm định phương pháp phân tích. 
* Tính tương thích hệ thống, chọn lọc - đặc hiệu: 
Tiến hành phân tích 5 lần liên tiếp mẫu chuẩn có nồng độ 5,77 µg/ml theo điều kiện 
sắc ký đã lựa chọn. Kết quả cho thấy: thời gian lưu và diện tích píc thu được lần lượt 
là 18,32 ± 0,03 phút ( ± SD, RSD = 0,16%) và 326.883 ± 5.289 µAU x s ( ± SD, 
RSD = 1,62%). Cả thời gian lưu và diện tích píc đều có giá trị RSD < 2%. Đồng thời, 
số đĩa lý thuyết là 7.429 và hệ số bất đối xứng là 1,06. Kết quả phân tích sắc ký đồ của 
mẫu trắng, mẫu testosteron chuẩn và mẫu Lộc nhung được ghi ở hình 3, cho thấy 
phương pháp phân tích tương thích với hệ thống sắc ký. 
Hình 3: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), testosteron chuẩn (b) và mẫu thử Lộc nhung (c). 
Kết quả phân tích mẫu trắng, mẫu 
testosteron chuẩn và mẫu thử Lộc nhung 
trong cùng điều kiện cho thấy: tại thời 
điểm xuất hiện píc testosteron trên sắc ký 
đồ của dung dịch chuẩn, không thấy xuất 
hiện píc trên dung dịch mẫu trắng. Đồng 
thời, tại thời điểm này xuất hiện đáp ứng 
píc tương ứng trên dung dịch mẫu thử 
dịch chiết Lộc nhung. Píc cân đối, sắc nét 
và tách hoàn toàn ra khỏi các píc tạp, hệ 
số bất đối xứng gần bằng 1. Như vậy, 
phương pháp này đảm bảo tính chọn lọc - 
đặc hiệu. 
* Khoảng tuyến tính: 
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn testosteron 
có nồng độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml trong 
MeOH 70%. Phân tích sắc ký theo điều 
kiện đã lựa chọn. Đánh giá mối tương quan 
giữa diện tích píc và nồng độ testosteron. 
Kết quả cho thấy (bảng 1, hình 4): đường 
hồi quy thu được là đường thẳng với hệ 
số tương quan R2 xấp xỉ bằng 1 (0,9999). 
Hệ số ∆i ở tất cả các nồng độ trong 
đường chuẩn đều < 15%. Như vậy, có mối 
tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện 
tích píc và nồng độ testosteron trong khoảng 
nồng độ khảo sát. 
AU
-0.004
-0.002
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
0.020
Minutes
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
18
.
26
0
AU
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
0.020
Minutes
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
18
.
32
3
AU
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
0.018
0.020
Minutes
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00
(a) 
(b) 
(c) 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 91 
Bảng 1: Kết quả xây dựng đường chuẩn của testosteron. 
Thứ tự Nồng độ testosteron (µg/ml) Diện tích píc (µAU x s) Hệ số ∆i (%) 
1 0,72 39.700 5,71 
2 1,44 80.821 2,94 
3 2,88 158.658 2,43 
4 5,77 326.494 1,20 
5 11,54 683.920 2,75 
6 23,08 1.316.783 1,40 
7 57,71 3.350.496 0,13 
Y = aX + b Y = 58.060 X - 4.491,9; R2 = 0,9999 
y = 58.060 x - 4.491,9
R² = 0,9999
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
0 10 20 30 40 50 60 70
Nồng độ (µg/ml)
D
iệ
n
tíc
h 
pí
c 
(µV
x 
s)
Hình 4: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ testosteron. 
* Độ lặp lại và độ đúng: 
Chiết 6 mẫu thử Lộc nhung có khối lượng như nhau và phân tích sắc ký theo điều 
kiện đã lựa chọn. Diện tích píc thu được là 54.815,60 ± 1.032,18 ( ± SD, n = 6) với 
giá trị RSD = 1,88% < 2%. Điều này chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại cao. 
Bảng 2: Kết quả xác định lặp lại của phương pháp. 
Mẫu Khối lượng mẫu (g) Diện tích píc (µV × s) 
1 10,0250 53.587 
2 10,0014 54.675 
3 10,0217 55.465 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 92
4 10,0034 54.673 
5 10,0462 55.678 
6 10,0053 56.586 
54.815,60 
SD 1.032,18 
RSD (%) 1,88 
Độ đúng được thực hiện bằng phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức 0,1440 µg, 
0,2885 µg và 0,5770 µg/mẫu. Thêm các lượng chuẩn này vào mẫu thử Lộc nhung đã 
biết hàm lượng testosteron và chiết mẫu theo quy trình đã lựa chọn. Từ diện tích píc 
thu được, ngoại suy lượng testosteron thêm vào ban đầu. 
Bảng 3. Tỷ lệ thu hồi testosteron trong mẫu thử. 
Lượng thêm vào (µg) Lượng tìm thấy (µg) Tỷ lệ thu hồi (%) ± SD 
0,1440 µg 
0,1267 87,93 
88,31 ± 2,41% 0,1240 86,11 
0,1309 90,90 
0,2885 µg 
0,2684 93,10 
92,71 ± 1,23% 0,2635 91,33 
0,2703 93,69 
0,5770 µg 
0,5581 96,74 
95,92 ± 0,77% 0,5493 95,20 
0,5529 95,82 
Với 3 mức thêm chuẩn, độ thu hồi đều đạt từ 88,31 - 95,92%. Như vậy, phương pháp 
phân tích này đáp ứng yêu cầu độ đúng để phân tích testosteron trong Lộc nhung. 
* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn 
định lượng (LOQ): 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác 
định LOD và LOQ của phương pháp định 
lượng dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu 
trắng và độ dốc đường tuyến tính có giá 
trị bằng k x SD/σ. Trong đó, k = 3,3 với 
LOD và = 10 đối với LOQ; SD là độ lệch 
chuẩn mẫu trắng và σ là độ dốc đường 
tuyến tính. 
Phân tích 3 mẫu trắng liên tiếp để xác 
định độ nhiễu đường nền của mẫu trắng 
tại thời điểm xuất hiện píc tương ứng 
trên mẫu testosteron chuẩn theo điều 
kiện sắc ký đã lựa chọn. Xác định SD 
của mẫu trắng. Chúng tôi tính toán được 
giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 
testosteron trong Lộc nhung theo phương 
pháp này lần lượt là 4,68 x 10-3 µg/ml và 
14,19 x 10-3 µg/ml. 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 93 
4. Áp dụng để xác định hàm lượng 
testosteron ở một số mẫu Lộc nhung 
trên thị trường. 
Chúng tôi sử dụng phương pháp đã xây 
dựng để xác định hàm lượng testosteron 
trong Lộc nhung thu mua trên thị trường. 
Kết quả cho thấy hàm lượng testosteron 
dao động từ 0,0990 - 0,1084 µg/g trong 
các mẫu thử. 
KẾT LUẬN 
Đã xây dựng được quy trình định lượng 
testosterone trong Lộc nhung bằng phương 
pháp HPLC với điều kiện sắc ký gồm: 
cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), 
detector UV đo ở 254 nm, dung môi pha 
động là ACN:H2O chạy theo chương trình 
gradient (0 → 20 phút, 30% ACN → 60% 
ACN; 20 → 30 phút, 60% ACN), tốc độ 
dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 300C. 
Phương pháp đã được thẩm định, bảo 
đảm các yêu cầu của một phương pháp 
phân tích định lượng theo hướng dẫn của 
ICH và quy định của Bộ Y tế Việt Nam. 
Phương pháp đảm bảo tính tương thích 
hệ thống, chọn lọc - đặc hiệu, có mối tương 
quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích 
píc và nồng độ testosteron trong khoảng 
0,72 - 57,71 µg/ml, độ đúng cao (88,31 - 
95,92%) và lặp lại (RSD < 2%); giới hạn 
phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng 
(LOQ) lần lượt là 4,68 x 10-3 µg/ml và 
14,19 x 10-3 µg/ml. Phương pháp trên đã 
được sử dụng để phân tích một số mẫu 
Lộc nhung trên thị trường. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. Nhà xuất 
bản Hà Nội. Hà Nội. 2009. 
2. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc 
Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2004, 
tr.937-940. 
3. Phạm Thanh Kỳ. Dược liệu học, tập II. 
Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2007, tr.285-288. 
4. ICH. Validation of analytical procedures: 
text and methodology. Q2R1. 2005.