Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tử của ốc cối conus spp. ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  99
THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC
XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOẠI PHÂN TỬ CỦA ỐC CỐI 
CONUS SPP. Ở VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ VIỆT NAM
MOLECULAR PHYLOGENY OF VENOMOUS CONE SNAILS CONUS SPP. IN THE 
COASTAL REGIONS OF SOUTHERN CENTRAL OF VIETNAM
Phạm Thu Thủy, Đặng Thúy Bình, Trương Thị Thu Thủy, Ngô Đăng Nghĩa
Viện Nghiên cứu CNSH & MT - Trường Đại học Nha Trang
TÓM TẮT
Giống ốc Conus thuộc họ ốc cối Conidae, lớp chân bụng Gastropoda, bộ Sorbeoconcha, phân bố chủ 
yếu ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm và được xem là nguồn dược liệu quý. Mục tiêu của nghiên cứu 
này là nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại của các loài ốc Conus spp. phân bố ở vùng ven biển Nam Trung 
bộ, Việt Nam dựa vào chỉ thị di truyền phân tử 16S rDNA ty thể. Tổng số 18 loài ốc cối đã được lấy mẫu. Sau 
khi giải trình tự gen, trình tự các đoạn gen 16S rDNA của 18 loài này được kết hợp với 3 trình tự từ Genbank để 
xây dựng cây chủng loại phát sinh bằng cách sử dụng 3 thuật toán maximum parsimony, maximum likelihood 
và Bayesian inference. Kết quả cho thấy sử dụng chỉ thị 16S rDNA đã phân chia các loài ốc cối thuộc các kiểu 
dinh dưỡng khác nhau (ăn giun biển, ăn cá, ăn nhuyễn thể) thành 4 nhánh chính. Trong đó, các loài ốc thuộc 
nhóm ăn giun biển được phân tách rõ ràng hơn trên cây tiến hóa với hai nhóm dinh dưỡng còn lại. Đây là lần 
đầu tiên một nghiên cứu quan hệ phát sinh loài ở mức độ phân tử được tiến hành trên các các loài ốc cối Việt 
Nam, góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn và lưu giữ nguồn gen ốc cối.
Từ khóa: Conus, 16S rDNA, phát sinh chủng loại phân tử
ABSTRACT
The genus Conus belonging to the family Conoidea, class Gastropoda, order Sorbeoconcha, distributes
mostly in warm tropical seas and are considered as precious pharmaceuticals. The aim of this study is to
construct a phylogenetic tree of Conus species collected from coastal regions in the Southern Central of
Vietnam based on the mitochondrial genetic molecular marker, 16S rDNA. Total 18 Conus species were
collected. After sequencing, the partial 16S rRNA gene sequences were combined with 3 sequences from
Genbank to construct a phylogenetic tree using three analysis methods of maximum parsimony, maximum 
likelihood and Bayesian inference. The results indicate that using the 16S rDNA marker the phylogentic tree of 
Conus species with different feeding modes (vermivorous, molluscivorous and piscivorous species) was divided 
into four main clusters. Among them, vermivorous species were separated more clearly than molluscivorous 
and piscivorous species. It is the fi rst time a molecular phylogentic analysis of Conus species in Vietnam was 
reported, contributing to the conservation of Conus genetic sources. 
Keywords: Conus, 16S rDNA, molecular phylogeny
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
100  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Họ ốc cối Conidae thuộc lớp chân bụng 
Gastropoda, bộ Sorbeoconcha, cùng với họ
Terebridae và Turidae làm thành tổng họ
Conoidea. Trong đó chiếm đa số là giống ốc cối 
Conus (Linnaeus, 1758) với khoảng 700 loài 
(Nam và cs, 2009). Chúng phân bố chủ yếu ở 
các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm như 
Philippines, Indonesia, Australia, Mexico, Florida 
và Hawaii. Tuy nhiên, một số loài có thể thích 
ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trường 
như ở vùng biển nóng mũi Hảo Vọng, Nam Phi 
hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ. 
Hầu hết các loài ốc Conus nhiệt đới sống trong 
hoặc gần các rạn san hô, trong khi các loài cận 
nhiệt đới được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới 
triều ở độ sâu từ 10 - 30m và dưới các tảng đá ở 
vùng triều nông. Ốc cối có hình chóp thuôn dài, 
có màu sắc sặc sỡ và hoa văn rất đa dạng, kích 
thước rất khác nhau tùy theo loài (loài lớn nhất 
có thể dài đến 23cm).
Ốc cối là động vật ăn thịt, chúng ăn mồi 
sống. Thức ăn chính của chúng là giun biển, 
nhuyễn thể, các loài cá nhỏ và thậm chí các loài 
ốc cối khác. Một số công trình nghiên cứu đã 
cho thấy mối tương quan rõ rệt giữa cấu trúc và 
hình dáng dải răng kitin của ốc cối với phương 
thức dinh dưỡng chuyên biệt (James, 1980; 
Franklin và cs, 2007). Do di chuyển chậm nên 
khi bắt một số con mồi di chuyển nhanh như cá 
chúng sử dụng độc tố để tấn công làm tê liệt con 
mồi. Độc tố ốc cối (conotoxin) là những chuỗi 
peptide tương đối nhỏ, giàu liên kết disulfi de, dài 
khoảng 10 - 40 amino acid (Olivera và cs, 2000). 
Tuyến độc của mỗi loài ốc cối chứa khoảng từ 
100 - 200 polypeptide khác nhau. Vì vậy, người 
ta dự đoán có khoảng 70.000 peptide độc tố ốc 
cối khác nhau. 
Từ các nghiên cứu độc tố của các loài ốc 
ăn cá cho thấy những loài có quan hệ gần gũi 
thường chứa các peptide độc tố tương đồng về 
mặt chức năng hơn so với các loài có quan hệ 
xa (Regina, 2006; Duda và cs, 2009). Vì vậy,
nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc 
cối đóng một vai trò quan trọng trong việc phát 
hiện và xác định đặc tính của các conotoxin mới. 
Việc phân tích quan hệ phát sinh chủng loại 
của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái giải 
phẫu (chủ yếu là kích thước, màu sắc và hoa 
văn vỏ, cấu tạo của hệ thống tiêu hóa) thường 
mang lại kết quả không ổn định nhất là đối với 
các loài có quan hệ gần gũi và vì vậy có nhiều 
đặc điểm hình thái giải phẫu giống nhau (Röckel 
và cs, 1995). 
Đối với lớp chân bụng Gastropoda, DNA ty 
thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu 
trong phân tích đa dạng loài (McArthur và cs, 
2003; Grande và cs, 2008; Nam và cs, 2009). 
Các marker chuẩn của DNA ty thể thường được 
sử dụng là các gen mã hóa cytochrome b, 12S 
rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val và một số vùng 
không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, 
atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP. 
Việc sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể cũng 
nâng cao độ phân giải và độ tin cậy thống kê 
so với sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ (Mueller, 
2006; Grande và cs, 2008).
Tuy nhiên, cho tới nay, mối quan hệ phát 
sinh chủng loại của các loài thuộc giống ốc cối 
vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để do 
các marker phân tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin 
cậy khi được áp dụng để xác định vị trí phân 
loại của các loài mới tách ra (Espiritu và cs, 
2002; Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005). 
Chính vì vậy, trong các nghiên cứu tiến hóa 
gần đây, các chỉ thị DNA ty thể thường được 
sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân có tốc độ 
tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp 
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  101
cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Duda 
và Palumbi, 1999; Cunha và cs, 2005; Duda và 
Kohn, 2005; Bandyopadhyay và cs, 2008; Nam 
và cs, 2009). Các chỉ thị nhân đã được khảo 
sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 
28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin, và 
vùng không mã hóa như đoạn chèn ITS1 và 
ITS2 (Nam và cs, 2009). 
Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở 
các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung 
bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các 
hải đảo (như Trường Sa, Hoàng Sa, Côn Đảo) 
với khoảng 76 loài (Hylleberg và Kilburn, 2003). 
Tuy nhiên, các nghiên cứu về ốc cối Việt Nam 
cho tới nay mới chỉ được thực hiện ở mức độ 
khảo sát, thu thập mẫu và tư liệu liên quan, xác 
định độc tính và kiểm chứng tính chất của một 
số độc tố. Hiện vẫn chưa có nghiên cứu phát 
sinh chủng loại nào về ốc cối Việt Nam được tiến 
hành ở mức độ phân tử. Một vấn đề gây quan 
ngại đó là một số loài ốc cối có vỏ rất đẹp, vân 
đa dạng nên thường được khai thác lấy vỏ làm 
đồ mỹ nghệ. Nếu không có những nghiên cứu 
bảo tồn kịp thời, nguồn dược liệu quý này có thể 
bị mai một. Vì vậy, trong đề tài này, nghiên cứu 
phát sinh chủng loại ở mức độ phân tử được tiến 
hành trên các đối tượng ốc cối Việt Nam nhằm 
góp phần vào công tác bảo tồn và lưu giữ nguồn 
gen ốc cối Việt Nam.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU
1. Mẫu ốc cối
Các loài ốc cối được thu thập tại các vùng 
biển thuộc khu vực đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), 
Cù Lao Chàm (Quảng Nam) và vịnh Vân Phong 
(Khánh Hòa) từ năm 2008 - 2010. Các mẫu ốc 
cối sau đó được phân loại sơ bộ dựa trên các 
đặc điểm hình thái theo mô tả của Röckel và cs 
(1995) và Nguyễn Ngọc Thạch (2007). Các loài 
được khảo sát bao gồm: Conus arenatus, C. 
bandanus, C. betulinus, C. capitaneus, C. carac-
teristicus, C. distans, C. generalis, C. imperialis, 
C. literatus, C. lividus, C. magus, C. marmoreus, 
C. miles, C. quercinus, C. striatus, C. tessulatus, 
C. textile và C. vexillum. Các cá thể ốc cối được 
giữ trong nitơ lỏng và bảo quản ở -70oC. Mỗi loài 
có 3 cá thể được chọn cho các nghiên cứu phân 
tử tiếp theo. 
2. Tách chiết DNA và nhân gen bằng kỹ thuật 
PCR
DNA tổng số được tách chiết từ phần mô 
cơ chân bò của từng cá thể ốc cối bằng bộ kit
Wizard SV genomic DNA purifi cation system 
(Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 
Đoạn gen 16S rDNA được khuếch đại bằng 
cặp mồi 16S (Integrated DNA Technologies) có 
trình tự như sau: mồi xuôi 16SF 5′-CCGGTCT-
GAACTCAGATCACGT-3′ và mồi ngược 16SR 
5′-GTTTACCAAAAACATGGCTTC- 3′ (Espiritu 
và cs, 2001). 
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể 
tích 50 µl (bao gồm 20 ng khuôn DNA, Taq buffer 
1X, 0,25 nM mỗi loại dNTP, 0,2 pM mỗi mồi, 2 
mM MgCl2 và 1 đơn vị Taq polymerase) trên máy 
luân nhiệt Icycler (Bio-rad) theo chương trình 
nhiệt như sau: biến tính ban đầu tại 94oC trong 
3 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ của 94oC trong 40 
giây, 47oC trong 40 giây, 72oC trong 90 giây và 
giai đoạn cuối ở 72oC trong 5 phút. 
Sản phẩm PCR được điện di trên gel
agarose 1,2% nhuộm ethidium bromide. Kết quả 
được ghi nhận sử dụng hệ thống ghi ảnh gel 
tự động Geldoc và phần mềm Quantity One®
(Bio-rad). 
3. Giải trình tự gen
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit 
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
102  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG
PCR clean up system (Promega) theo hướng 
dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn 
trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo 
nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big 
Dye® Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với 
các đoạn mồi 16SF và 16SR theo chương trình 
nhiệt như sau: 960C trong 20 giây, 500C trong 
20 giây và 600C trong 4 phút. Sản phẩm phản 
ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự 
tự động ABI Prism® 3700 DNA Analyser (Applied 
Biosystems). Các trình tự xuôi và ngược được 
kết nối bằng phần mềm Vector NTI v.9.
4. Phân tích trình tự
Trình tự của các loài ốc cối được xác nhận 
bằng chương trình BLAST (
nlm.nih.gov/Blast.cgi). Các trình tự được chỉnh 
sửa bằng phần mềm BioEdit 7.0.1 (Hall, 1999) 
và gióng hàng bằng phần mềm Clustal X v.1.8 
(Thompson và cs, 1997).
5. Phân tích phát sinh chủng loại các loài ốc 
cối 
Phân tích phát sinh chủng loại được thực 
hiện dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của 
18 loài ốc cối thuộc nghiên cứu hiện tại và 3 
trình tự từ Genbank (Bảng 1). Trình tự 16S rDNA 
của 2 loài ốc thuộc họ Conidae là Lophiotoma 
erithiformis và Thatcheria mirabilis từ Genbank 
được sử dụng làm nhóm ngoại.
Phân tích được tiến hành dựa trên 3 thuật 
toán maximum parsimony (MP), maximum
likelihood (ML) và Bayesian inference (BI) bằng 
các phần mềm PAUP 4.0 (Swofford, 2001) và 
MrBayes 3.1.2 (Huelsenbeck và Ronquist, 2001). 
Đối với thuật toán MP, 1000 độ lặp lại ngẫu nhiên 
được áp dụng. Tuy nhiên, đối với thuật toán ML, 
độ lặp lại là 100 vì tổng số trình tự nghiên cứu 
quá lớn. Trước khi tiến hành thuật toán ML và BI, 
các mô hình tiến hóa được kiểm tra bằng phần 
mềm Modeltest 3.7 (Posada và Crandall, 1998) 
và MrModeltest 2.2 (Nylander, 2004). Mô hình 
tối ưu là HKY+I+G với tần suất các base nitơ là 
A = 0,3487; C = 0,1299; G = 0,1744; T = 0,3470, 
tỷ lệ các vị trí đa hình là 0,4011 và thông số dạng 
phân bố gamma là 0,4110. 
Đối với thuật toán BI, các mô hình thay 
thế được tính toán. Chương trình được chạy 
trên 4 kênh với 1 triệu thế hệ, với tần suất tính 
toán trên 100 thế hệ. Phân tích được lặp lại 2 
lần để xác định độ chính xác của phương pháp 
phân tích. Giá trị tin cậy được biểu hiện trên 
các nhánh của cây tiến hóa (Huelsenbeck và 
Ronquist, 2001).
Giá trị bootstrap được tính toán để xác định 
tính chính xác của thuật toán MP với độ lặp lại 
100. Do sự hạn hẹp về thời gian và số lượng 
trình tự quá lớn, chúng tôi áp dụng phương 
pháp xấp xỉ liên tiếp (successive approximation
approach) (Sullivan và cs, 2005) đối với thuật 
toán ML, xác định cây tiến hóa dựa trên mô 
hình tiến hóa và so sánh kết quả thu được với 
phương pháp phân tích MP và BI. Cây đa dạng 
loài được hiển thị và hiệu chỉnh bằng phần mềm 
TreeView 1.6.6 (Page, 1996).
III. KẾT QUẢ
1. Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA
DNA tổng số của các mẫu ốc sau khi kiểm 
tra nồng độ và độ tinh sạch được dùng làm 
khuôn cho phản ứng khuếch đại gen 16S rDNA. 
Theo tính toán lý thuyết, khi sử dụng cặp mồi 
16S, sản phẩm PCR thu được là đoạn DNA có 
kích thước ~ 550 bp. Kết quả nhân gen được 
hiển thị trên Hình 1. Sản phẩm điện di là một 
băng đậm nét có kích thước phù hợp với tính 
toán lý thuyết.
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  103
Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S 
rDNA của các mẫu ốc cối
Sản phẩm PCR (6 µl) được điện di trên gel agarose 1,2%.
Giếng 1: thang DNA chuẩn 100 bp. Giếng 2-7,
sản phẩm PCR của các mẫu ốc cối. Giếng 8: đối chứng âm.
2. Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA của các 
loài ốc cối
Để đảm bảo độ tin cậy, phản ứng giải trình tự 
được tiến hành theo cả hai chiều xuôi và ngược 
với mỗi mẫu được lặp lại 2 lần. Sau khi phân 
tích và kiểm tra, trình tự đoạn gen 16S rDNA của 
18 mẫu ốc cối nghiên cứu được đăng ký trên 
Genbank. Mã số trình tự và thông tin chi tiết về 
các loài ốc cối được trình bày trong Bảng 1. Hầu 
hết các loài ốc cối thu thập tại các vùng ven biển 
Việt Nam thuộc loại ăn giun biển (ký hiệu là V). 
Có 3 loại thuộc nhóm ăn nhuyễn thể (ký hiệu là 
M), 1 loài ăn cá (ký hiệu là P) và 2 loài vừa ăn 
giun biển và cá tùy theo giai đoạn phát triển của 
chúng (ký hiệu là P&V)). Các loài có chế độ ăn 
chưa được nghiên cứu cụ thể ký hiệu là U (Nam 
và cs, 2009; Duda và cs, 2001).
3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ốc cối
Sau khi so sánh và gióng hàng, trình tự 
thu được gồm 548 bp đoạn gen 16S rDNA của 
18 loài ốc cối nghiên cứu được sử dụng cho 
phân tích. Trong đó có 347 nucleotide không 
đổi (constant character), 76 nucleotide không 
mang thông tin (parsimony-uninformative
character) và 125 nucleotide mang thông
tin (parsimony-informative character). Trình tự 
đoạn gen 16S rDNA của 3 loài ốc cối khác trên 
Genbank cũng được sử dụng trong xây dựng 
cây phát sinh chủng loại với nhóm ngoại là 2 
loài ốc Lophiotoma cerithiformis và Thatcheria 
mirabilis. 
Phân tích cây phát sinh chủng loại được 
tiến hành dựa trên cả 3 thuật toán maximum
parsimony (MP), maximum likelihood (ML) và 
Bayesian inference (BI). Kết quả phân tích dữ 
liệu trình tự gen 16S rDNA dựa trên phương 
pháp MP và BI cho kết quả tương tự về cây đa 
dạng loài. Tuy nhiên, phương pháp ML cho thấy 
mức độ thấp trong mối quan hệ loài.
Cây phân loại loài thu được theo phương 
pháp MP được trình bày trên Hình 2 với giá trị 
bootstrap (BT) và độ tin cậy (PP) được biểu hiện 
trên các nhánh. Đối với thuật toán MP, cây đa 
dạng loài thu được với 549 bước (Consistency 
index = 0,5301, Retention index = 0,5204). Theo 
Hình 2 cho thấy các loài thuộc giống ốc cối có 
sự tương đồng cao với giá trị bootstrap và độ 
tin cậy cao (PR 99%, BI 100%). Từ cây phát 
sinh loài cho thấy các loài ốc cối nghiên cứu 
phân thành 4 nhóm loài (từ nhóm I-IV) với giá trị
bootstrap và độ tin cậy tương đối (>70%), và 1 
loài (nhóm V) có vị trí phân loại không xác định 
(C. imperialis). 
Nhóm I và nhóm II lần lượt lại tiếp tục được 
chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm I.1 bao gồm các 
loài C. distans, C. bandanus, C. mamoreus, C. 
betulinus; nhóm I.2 bao gồm các loài C. magus, 
C. achatinus, C. striatus, C. generalis; nhóm II.1 
bao gồm các loài C. tessulatus, C. eburneus, C. 
literatus, C. leopardus; và nhóm II.2 bao gồm các 
loài C. caracteristicus, C. textile, C. arenatus.
Nhóm III bao gồm 2 loài C. quercinus và C.
lividus. Nhóm IV gồm 3 loài C. capitaneus, C. 
miles và C. vexillum. 
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
104  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG
Bảng 1: Danh mục các loài ốc cối sử dụng cho phân tích phát sinh chủng loại
dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA
STT Tên loài Mã số Genbank Chế độ dinh 
dưỡng
Tài liệu tham khảo
1 Conus arenatus HM212491 V Nghiên cứu hiện tại
2 Conus bandanus HQ234757 M Nghiên cứu hiện tại
3 Conus betulinus HQ234758 V Nghiên cứu hiện tại
4 Conus capitaneus HM212492 V Nghiên cứu hiện tại
5 Conus caracteristicus HM212493 U Nghiên cứu hiện tại
6 Conus distans HM212494 V Nghiên cứu hiện tại
7 Conus generalis HQ234761 V Nghiên cứu hiện tại
8 Conus imperialis HQ234755 V Nghiên cứu hiện tại
9 Conus literatus HM212495 V Nghiên cứu hiện tại
10 Conus lividus HQ234760 V Nghiên cứu hiện tại
11 Conus magus HM212496 V&P Nghiên cứu hiện tại
12 Conus marmoreus HQ234759 M Nghiên cứu hiện tại
13 Conus miles HQ234756 V Nghiên cứu hiện tại
14 Conus quercinus HM212497 V Nghiên cứu hiện tại
15 Conus striatus HM212498 P Nghiên cứu hiện tại
16 Conus tessulatus HM212499 V Nghiên cứu hiện tại
17 Conus textile HM212500 M Nghiên cứu hiện tại
18 Conus vexillum HM212501 V Nghiên cứu hiện tại
19 Conus eburneus AF174165 V&P (Duda và cs, 2001)
20 Conus leopardus AF174175 V (Duda và cs, 2001)
21 Conus achatinus FJ868053 U (Puillandre và cs, 2010)
22 Lophiotoma cerithiformis EU682307 (Nam và cs, 2009)
23 Thatcheria mirabilis GU137313 (Nam và cs, 2009)
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  105
Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của các loài ốc cối thu nhận
tại các vùng ven biển Nam Trung bộ, Việt Nam
Phân tích được thực hiện dựa trên trình tự đoạn gen 16S rRNA của 21 loài ốc trong đó có 18 loài thuộc nghiên cứu hiện tại và 3 trình tự từ Genbank
(được ký hiệu với đuôi gb). Các loài ốc Lophiotoma cerithiformis và Thatcheria mirabilis được sử dụng làm nhóm ngoại.
Giá trị bootstrap (phân tích MP) và giá trị tin cậy (phân tích BI) được biểu hiện tại các nhánh. Cây phát sinh loài được chia làm 4 nhóm chính.
Chế độ dinh dưỡng của các loài trong nhóm được hiển thị trong ngoặc đơn (M: ăn nhuyễn thể; V: ăn giun biển;
P: ăn cá; V&P: ăn cá và giun biển; U: chưa biết).
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
106  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG
IV. THẢO LUẬN
1. Mối quan hệ loài của ốc cối (Conus spp.) 
Việt Nam được nghiên cứu ở mức độ phân 
tử 
Việc phân loại ốc cối theo phương pháp 
truyền thống thường dựa trên các đặc điểm hình 
thái như kích thước vỏ, kiểu hoa văn và màu sắc 
vân trên vỏ, số vòng xoắn ở phần nón, chế độ 
dinh dưỡng và đặc điểm hình thái các dải răng 
chitin. Tuy nhiên, do các đặc điểm hình thái có 
thể chịu tác động của môi trường, hay biến dị 
cá thể cùng loài và khác loài, nên dễ gây nhầm 
lẫn trong quá trình phân loại. Chính vì vậy, các 
marker phân tử của DNA ty thể và DNA nhân 
hiện đang được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu di truyền, định danh và xây dựng mối 
quan hệ tiến hóa (Nam và cs, 2009; Duda và 
cs, 2001; Espiritu và cs, 2001; Duda và Kohn, 
2005). 
Nghiên cứu hiện tại sử dụng chỉ thị 16S 
rDNA đã phân chia các loài ốc cối thành các 
nhóm riêng biệt. Kết quả phân tích phát sinh 
chủng loại của chúng tôi cũng phù hợp với các 
nghiên cứu trước đó. Ví dụ hai loài thuộc nhóm 
ăn nhuyễn thể C. bandanus và C. marmoreus, 
có phần nón rộng, được chia về cùng nhóm I.1; 
hai loài C. tessulatus và C. eburneus được phân 
chia về cùng một nhánh (Nam và cs, 2009). 
Các loài C. magus và C. striatus; C. miles và C.
vexillum; C. quercinus và C. lividus có quan hệ di 
truyền rất gần gũi (Espiritu và cs, 2001).
Mặc dù vậy mối quan hệ tiến hóa giữa các 
loài thuộc các nhóm dinh dưỡng khác nhau 
vẫn chưa được phân tách rõ ràng. Ví dụ loài 
C. distans thuộc nhóm ăn giun biển được xếp 
vào nhóm I.1 cùng với hai loài thuộc nhóm ăn 
nhuyễn thể, điều này cho thấy việc sử dụng chỉ 
thị 16S đơn lẻ chưa giải quyết triệt để được mối 
quan hệ giữa các loài ốc thuộc các nhóm dinh 
dưỡng. 
Bandyopadhyay và đồng tác giả (2008) 
đã sử dụng chỉ thị 16S rDNA và vùng liên gen
coxI/coxII nhằm phân tích quan hệ phát sinh 
chủng loại của các loài ốc cối Philippines. Kết 
quả cho thấy, vùng liên gen coxI/ coxII của các 
loài ốc cối dao động từ 130 - 170 bp, trong đó 
đoạn gen này của C. textile lớn hơn so với tất 
cả các loài còn lại. Nhóm tác giả đánh giá rằng 
đoạn chèn này rất hữu dụng trong các nghiên 
cứu tiến hóa, cũng như định danh loài. 
Hơn nữa, gần đây Nam và đồng tác giả 
(2009) đã sử dụng chỉ thị nhân ITS2 (đoạn chèn 
giữa gen mã hóa 5,8S và 28S rRNA) nhằm đánh 
giá mối quan hệ tiến hóa của 26 loài ốc thu 
thập tại vùng biển thuộc quần đảo Marinduque,
Philippines. Kết quả cho thấy trình tự ITS2 được 
bảo tồn giữa các cá thể thuộc cùng một nhóm 
dinh dưỡng, nhưng lại thể hiện sự đa dạng ở 
mức độ phù hợp cho việc xác định vị trí phân 
loại của các loài mới phân hóa. Hơn nữa, việc 
sử dụng kết hợp các chỉ thị ty thể (12S rDNA, 
16S rDNA và COI) và chỉ thị nhân ITS2 đã chia 
nhóm ăn nhuyễn thể (M) thành 3 nhánh rõ ràng 
là Conus, Cyclinder, và Darioconus. Chính vì 
vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo của chúng 
tôi, chỉ thị DNA ty thể cần được sử dụng kết hợp 
với chỉ thị nhân để có thể đánh giá chính xác 
hơn mối quan hệ loài của ốc cối Việt Nam.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây 
dựng cây phát sinh chủng loại của 18 loài ốc 
cối Việt Nam dựa trên trình tự đoạn gen ty thể 
16S rDNA. Đây là lần đầu tiên mối quan hệ loài 
của giống ốc cối Conus ở Việt Nam được nghiên 
cứu ở mức độ phân tử. Vì vậy, kết quả nghiên 
cứu này có ý nghĩa quan trọng góp phần vào 
công tác bảo tồn và lưu giữ nguồn gen ốc cối 
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  107
Việt Nam.
2. Mối liên hệ giữa phát sinh loài với chế độ 
dinh dưỡng và độc tố ốc cối
Duda và cộng sự (2001) đã khảo sát mối 
quan hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh 
dưỡng của 76 loài ốc cối thu thập từ các vùng 
biển Ấn Độ, Thái Bình Đương và Tây Đại Tây 
Dương. Kết quả cho thấy hình thức dinh dưỡng 
ăn giun biển nhiều tơ (errant polychaetes) là 
hình thức cổ xưa nhất. Các dạng dinh dưỡng 
khác như ăn các loài chân bụng, và một số họ 
giun biển khác như Terebellidae, Nereidae và 
Amphinomidae được tách ra cùng một lần, trong 
khi đó các loài ăn cá có thể tách ra từ 2 đến 3 lần 
trên cây tiến hóa. 
Các loài ốc cối Việt Nam trong nghiên cứu 
hiện tại chủ yếu thuộc loại ăn giun biển. Có ba 
loài thuộc nhóm ăn nhuyễn thể là C. bandanus, 
C. marmoreus và C. textile. Chỉ duy nhất một loài 
ăn cá (C. striatus) và một loài có chế độ ăn đa 
dạng, vừa ăn giun biển vừa ăn cá tùy theo giai 
đoạn sống (C. magus) được khảo sát. Trong đó, 
hầu hết các loài thuộc nhóm ăn giun biển được 
tách ra từ gốc cây tiến hóa (Hình 2). Điều này 
khá phù hợp với lý thuyết khi chế độ ăn giun biển 
là phương thức dinh dưỡng cổ xưa nhất (Duda 
và cs, 2001). Hơn nữa các loài thuộc nhóm ăn 
giun biển được phân chia thành các nhóm rất rõ 
ràng là nhóm III và nhóm IV. 
Tuy nhiên, một số loài ăn giun biển khác 
cũng được nhóm cùng với các loài ăn nhuyễn 
thể (nhóm I.1), và với các loài vừa giun biển vừa 
ăn cá, cũng như với các loài mà chế độ ăn chưa 
được nghiên cứu (nhóm I.2 và nhóm II.1). Điều 
này cho thấy sự chuyên biệt của các chế độ dinh 
dưỡng trong quá trình tiến hóa của ốc cối.
Cuối cùng, phân tích mối quan hệ tiến hóa 
giữa các loài ốc cối đóng vai trò quan trọng trong 
việc nghiên cứu tính đa dạng của các độc tố ốc 
cối, cũng như việc phát hiện và xác định đặc tính 
của các độc tố mới. Đây là nguồn dược liệu quý 
để sản xuất thuốc giảm đau trong y học. Chẳng 
hạn, Espiritu và cs (2001) đã phân tích nguồn 
gốc tính đa dạng của độc tố δ-conotoxin trên 9 
loài ốc cối bằng sử dụng chỉ thị 16 rDNA ty thể. 
Kauferstein và cs (2004) cũng sử dụng các trình 
tự 16 rDNA đại diện cho 104 haplotype nhằm 
khảo sát khả năng sản xuất các độc tố (thuộc 
siêu họ I) mới phát hiện ở các loài ốc cối khác 
nhau.
V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử 16S 
rDNA ty thể, chúng tôi đã xây dựng cây phát sinh 
chủng loại của 18 loài ốc cối Conus thu thập tại 
các vùng biển thuộc khu vực Nam Trung bộ, Việt 
Nam. Kết quả cho thấy các loài ốc cối thuộc 3 
nhóm dinh dưỡng được chia làm 4 nhóm chính 
trên cây chủng loại phát sinh. Điều này phù hợp 
với các nghiên cứu trước đó. Mặc dù vậy, việc 
sử dụng chỉ thị 16S rDNA vẫn có những hạn chế 
nhất định trong việc phân tách các loài ốc có 
quan hệ tiến hóa gần gũi. Vì vậy, để có thể xác 
định chính xác mối quan hệ loài của ốc cối Việt 
Nam, trong các nghiên cứu tiếp theo, các chỉ thị 
đa phân tử trong đó có các gen mã hóa độc tố ốc 
cối sẽ được sử dụng.
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
108  TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bandyopadhyay PK, Stevenson BJ, Ownby JP, Cady MT, Watkins M, Olivera BM (2008). The
mitochondrial genome of conus textile, coxi-coxii intergenic sequences and conoidean evolution. Mol 
Phylogenet Evol, 46:215-223.
2. Cunha RL, Castilho R, Ruber L, Zardoya R (2005). Patterns of cladogenesis in the venomous marine
gastropod genus conus from the cape verde islands. Syst Biol, 54:634-650.
3. Duda TF, Jr., Kohn AJ (2005). Species-level phylogeography and evolutionary history of the hyperdiverse 
marine gastropod genus conus. Mol Phylogenet Evol, 34:257-272.
4. Duda TF, Jr., Palumbi SR (1999). Developmental shifts and species selection in gastropods. Proc Natl 
Acad Sci USA, 96:10272-10277.
5. Duda TF, Kohn AJ, Palumbi SR (2001) Origins of diverse feeding ecologies within Conus, a genus of 
venomous marine gastropods. Biol. J. Linnean Soc, 73:391-409.
6. Espiritu DJ, Watkins M, Dia-Monje V, Cartier GE, Cruz LJ, Olivera BM (2001). Venomous cone snails: 
Molecular phylogeny and the generation of toxin diversity. Toxicon, 39:1899-1916.
7. Franklin JB, Fernando SA, Chalke BA, Krishnan KS (2007) Radular morphology of Conus (Gastropoda: 
Caenogastropoda: Conidae) from India. Molluscan Research, 27(3):111-122.
8. Grande C, Templado J, Zardoya R (2008). Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements. 
BMC Evol Biol, 8:61.
9. Hall TA (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for 
Windows 95/98/NT. Nucleic Acid Symposium Series, 41:95-98. Oxford University Press.
10. Huelsenbeck JP, Ronquist F (2001). Mrbayes: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics, 
17:754-755.
11. Hylleberg J, Kilburn RN (2003). Marine Molluscs of Vietnam. Tropical marine mollusk Programe 
(TMMP), 106-111.
12. James MJ (1980). Comparative morphology of radular teeth in conus: observations with scanning electron 
microscopy. J Mollus Stud, 46(1):116-128.
13. Kaufersteina S, Huysb I, Kucha U, Melauna C, Tytgatb J, Mebsa D (2004). Novel conopeptides of the
I-superfamily occur in several clades of cone snails. Toxicon, 44(5):539-548.
14. McArthur AG, Harasewych MG (2003). Molecular systematics of the major lineages of the Gastropoda. 
Smithsonian Books, Washington,140-160.
15. Mueller RL (2006). Evolutionary rates, divergence dates, and the performance of mitochondrial genes in 
bayesian phylogenetic analysis. Syst Biol, 55:289-300.
16. Nam HH, Corneli PS, Watkins M, Olivera B, Bandyopadhyay P (2009). Multiple genes elucidate the
evolution of venomous snail-hunting conus species. Mol Phylogenet Evol, 53:645-652.
17. Nylander JA (2004). Mr Modeltest v2. Program distributed by the author. Evolutionary Biology Centre. 
Uppsala University, Uppsala, Sweden. 
18. Nguyễn Ngọc Thạch (2007). Recently collected shells of Viet Nam. L’ Informatore piceno & N.N.T: 7-8 
& 24-142.
19. Page RD (1996). Treeview: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput 
Appl Biosci,12:357-358.
Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn Soá 3/2011
TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG  109
20. Puillandre N, Watkins M, Olivera BM (2010). Evolution of conus peptide genes: Duplication and positive 
selection in the a-superfamily. J Mol Evol (in press)
21. Röckel D, Korn W, Kohn AJ (1995). Manual of the Living Conidae (Vol. I: Indo- Pacifi c Region). Verlag 
Christa Hemmen, Wiesbaden, Germany.
22. Sullivan J, Abdo Z, Joyce P, Swofford DL (2005). Evaluating the performance of a successive-approxima-
tions approach to parameter optimization in maximum-likelihood phylogeny estimation. Mol Biol Evol, 
22:1386-1392.
23. Swofford DL (2002). PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. 
Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.
24. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997). The clustal-X windows
interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids 
Res, 25:4876-4882.