Xây dựng bộ mẫu huyết thanh có nồng độ vi-rút chuẩn cho chẩn đoán vi-rút học bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 274 
XÂY DỰNG BỘ MẪU HUYẾT THANH CÓ NỒNG ĐỘ VI-RÚT CHUẨN CHO CHẨN ĐOÁN 
VI-RÚT HỌC BỆNH SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE 
Phan Thị Kim Liên*, Cao Minh Thắng*, Huỳnh Thị Kim Loan*, Hoàng Thị Như Đào*, 
Huỳnh Phương Thảo*, Nguyễn Thị Công Dung*, Đoàn Thị Minh Tâm*, Vũ Thị Quế Hương* 
TÓM TẮT 
Đặt vấn ñề: Bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) là bệnh cấp tính ở người do vi-rút Dengue (DEN) gây ra và 
lan truyền qua muỗi Aedes aegypti. Trong Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống SXHD, giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD 
chủ yếu ñược tiến hành ở các viện khu vực. Việc chuẩn hóa kết quả xét nghiệm và kiểm tra chất lượng nội bộ dựa trên bộ mẫu huyết 
thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñang ñược quan tâm giữa các viện. 
Mục tiêu nghiên cứu: Thiết lập quy trình xây dựng và ñánh giá bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-
rút học bệnh SD/SXHD. 
Phương pháp nghiên cứu: Huyết thanh (HT) cấp tính của bệnh nhân SD/SXHD xác ñịnh bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào 
muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 và RT-PCR ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút ñể thiết lập bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho 
phân lập vi-rút và RT-PCR. 
Kết quả nghiên cứu: Các mẫu HT nghiên cứu có hiệu giá vi-rút DEN-1, -2, -3 là 105,77, 105,68, 105,77TCID50/mL tương ứng với 
CV < 1 % và ± 1 SD. Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD ñược thiết lập cho từng týp vi-
rút DEN riêng biệt với bộ thang nồng ñộ từ 101 ñến 105 TCID50/mL. Bộ mẫu HT chuẩn cho phép phân lập vi-rút DEN trên nuôi cấy 
tế bào C6/36 sau 7 ngày ở nồng ñộ 103-104 TCID50/mL và sau 14 ngày ở nồng ñộ 101– 103 TCID50/mL theo phương pháp cấy, mật ñộ 
tế bào ban ñầu và týp vi-rút DEN tương ứng. Ngoài ra, bộ mẫu HT chuẩn còn ñược phát hiện bằng RT-PCR DEN ở nồng ñộ 102 
TCID50/mL. 
Kết luận: Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng nội bộ và tiến trình 
chuẩn hóa phòng thí nghiệm ở các viện khu vực, cũng như tăng cường hiệu quả giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD. 
Từ khóa: Mẫu huyết thanh virus chuẩn, chẩn ñoán vi rút Dengue, vi rút Dengue, bệnh sốt xuất huyết Dengue. 
ABSTRACT 
SET-UP OF STANDARD SERUM PANELS WITH VIRUS TITRATIONS FOR VIROLOGICAL 
DIAGNOSIS OF DENGUE FEVER/DENGUE HEMORRHAGIC FEVER. 
Phan Thi Kim Lien, Cao Minh Thang, Huynh Thi Kim Loan, Hoang Thi Nhu Da, 
Huynh Phuong Thao, Nguyen Thi Cong Dung, Doan Thi Minh Tam, Vu Thi Que Huong 
 * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 274 - 279 
Background: Dengue fever/Dengue hemorrhagic fever (DF/DHF) is acute human diseases caused by dengue (DEN) viruses 
transmitting by Aedes aegypti. In National Program for Dengue control, virological surveillance of DF/DHF is mainly performed in 
regional institutes. The standardization of test results and internal quality control based on standard serum panels with virus 
titrations is considering between institutions. 
Objectives: To establish the procedures for set-up and assessment of standard serum panels with virus titrations using in 
virological diagnosis of DF/DHF. 
Method: Acute sera of DF/DHF patients confirmed by virus isolation in C6/36 clone Aedes albopictus mosquito cell culture 
and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were titrated to establish the standard serum panels with virus 
titrations for virus isolation and RT-PCR methods. 
Result: Study acute sera infected DEN-1, -2, -3 virus serotypes having the virus titers of 105,77, 105,68, 105,77TCID50/mL, 
respectively with Coefficient of Variation (CV) < 1 %, and ± 1 SD (Standard Deviation). The standard serum panels with virus 
titrations using in DF/DHF virological diagnosis were establish for each DEN virus serotype and virus titrations from 101 to 105 
TCID50/mL. The standard serum panels can be detected at 103-104 TCID50/mL after 7 infectious days and at 101–103 TCID50/mL after 
14 infectious days by virus isolation technique using different inoculated methods, primary mosquito cell culture concentrations and 
DEN virus serotypes, respectively. Moreover, this standard serum panels can also be detected at 102 TCID50/mL by DEN 
RT-PCR. 
Conclusion: Standard serum panels with virus titrations have an important part in internal quality control and laboratory 
standardization process in regional institutions as well as improving the effective virological surveillance of DF/DHF. 
*
 Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh 
Địa chỉ liên lạc:TS. Vũ Thị Quế Hương ĐT: 0903 618 809 Email: quehuong@pasteur-hcm.org.vn 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 275 
Keywords: Standard serum panels virus, diagnosis Dengue virus, Dengue virus, Dengue hemorrhagic fever disease. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Vi-rút Dengue (DEN) là vi-rút ARN thuộc nhóm 
Flavivirus họ Flaviviridae, có 4 týp vi-rút khác nhau về mặt 
kháng nguyên (gọi là DEN-1, -2, -3, -4). Vi-rút DEN gây bệnh 
cấp tính cho người lan truyền qua trung gian muỗi Aedes 
aegypti. Theo tổ chức Y tế thế giới, hằng năm có khoảng 100 
triệu ca nhiễm vi-rút DEN trong ñó 90% là trẻ em và 50.000 ca 
tử vong trên toàn thế giới. Bệnh nhiễm vi-rút DEN có phổ lâm 
sàng rất rộng từ không triệu chứng ñến sốt DEN (SD), sốt xuất 
huyết DEN (SXHD), hội chứng sốc DEN (HCSD) và tử vong. 
Do ñó, việc chẩn ñoán xác ñịnh bệnh DEN chủ yếu dựa vào 
chẩn ñoán phòng thí nghiệm bao gồm vi-rút học (phân lập vi-
rút trên nuôi cấy tế bào), huyết thanh học (phản ứng MAC-
ELISA) và sinh học phân tử (RT-PCR). 
Trong Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống 
SXHD (CTMTQG PCSXHD), công tác giám sát vi-rút học 
bệnh SD/SXHD chủ yếu ñược tiến hành ở các viện khu vực 
bằng kỹ thuật phân lập vi-rút trên nuôi cấy tế bào muỗi 
Aedes aegypti dòng C6/36 và ñịnh danh týp vi-rút DEN 
bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với các kháng 
thể ñơn dòng ñặc hiệu. Đôi khi, kỹ thuật RT-PCR cũng 
ñược áp dụng trong những trường hợp khẩn cấp nhằm xác 
ñịnh dịch bệnh DEN hoặc xác ñịnh căn nguyên trường hợp 
tử vong. Hiện nay, việc chuẩn hoá phòng xét nghiệm theo 
tiêu chuẩn iso-15189 ñang tiến hành ở các viện khu vực. Do 
ñó, việc xây dựng bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút 
DEN chuẩn nhằm kiểm tra chất lượng nội bộ các xét 
nghiệm chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD ñang ñược 
quan tâm ở các viện khu vực. 
Mục tiêu nghiên cứu 
Thiết lập quy trình xây dựng và ñánh giá bộ mẫu huyết 
thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học 
(bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi Aedes aegypti 
và RT-PCR) bệnh SD/SXHD. 
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Vật liệu nghiên cứu 
Mẫu HT cấp tính của bệnh nhân (BN) nhiễm vi-rút DEN 
(DEN-1, -2, -3) nhập bệnh viện 115-TP. HCM năm 2007 ñược 
xác ñịnh bằng hai phương pháp phân lập vi-rút trên nuôi cấy tế 
bào muỗi C6/36 rồi ñịnh danh bằng miễn dịch huỳnh quang 
gián tiếp với kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu týp huyết thanh vi-
rút DEN (do Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Colorado, Hoa kỳ 
cung cấp) và RT-PCR với mồi ñặc hiệu týp vi-rút DEN của 
Lanciotti(4). 
Phương pháp nghiên cứu 
Nồng ñộ vi-rút DEN (TCID50/ml) hiện diện trong mẫu HT 
nghiên cứu ñược xác ñịnh bằng phương pháp chuẩn ñộ vi-rút 
trên nuôi cấy tế bào muỗi C6/36 và ño lường mật ñộ quang 
(OD) phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể (3,5). Bộ 
mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược thiết lập riêng rẽ cho 
từng týp vi-rút DEN với thang nồng ñộ từ 101-105 (TCID50/ml). 
Bộ mẫu HT chuẩn này sử dụng ñể khảo sát giới hạn phát 
hiện vi-rút DEN của phương pháp phân lập vi-rút trên nuôi cấy 
tế bào muỗi Aedes aegypti dòng C6/36 và ñịnh danh bằng miễn 
dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp trên các thông số kỹ 
thuật: mật ñộ tế bào nuôi cấy ban ñầu, kỹ thuật gây nhiễm bệnh 
phẩm vào tế bào, ngày gặt bệnh phẩm(3,8). 
Đồng thời, bộ mẫu HT chuẩn này cũng ñược khảo sát giới 
hạn phát hiện vi-rút DEN của phương pháp RT-PCR với bộ 
mồi của Lanciotti sau khi chiết xuất ARN vi-rút DEN bằng bộ 
sinh phẩm QIAGEN(2,4,8). Vẽ ñồ thị và xử lý số liệu bằng phần 
mềm Microsoft Excel(Error! Reference source not found.). 
KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 
Về chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút trong HT nghiên cứu 
Hiệu giá vi-rút DEN của mẫu HT nghiên cứu 
Các mẫu HT cấp tính của BN nhiễm vi-rút DEN-1, -2, -3 
ñược pha loãng bậc 10 ra 9 ñộ pha loãng khác nhau. Mỗi ñộ 
pha loãng vi-rút ñược gây nhiễm trên 6 giếng tế bào muỗi 
C6/36. Sau 7 ngày, tính hiệu giá ñơn vị TCID50/mL bằng 
phương pháp miễn dịch enzyme trên khay nhựa 96 giếng. 
Giếng nào có giá trị OD > OD trung bình chứng âm + 3 ñộ 
lệch chuẩn (SD) là dương tính và tính hiệu giá vi-rút theo công 
thức Reed và Muench(6). Mỗi HT nhiễm từng týp vi-rút DEN 
ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút DEN 3 lần, cho kết quả trong 
bảng 1. 
Bảng 1: Hiệu giá vi-rút của các HT nhiễm vi-rút DEN-1, -2, -3 
theo log10 TCID50/mL 
Hiệu giá vi-rút (log10 
TCID50/mL) 
Mẫu 
HT 
nhiễm 
vi-rút Lần 1 Lần 2 Lần 3 
Trun
g vị 
hiệu 
giá 
Trung 
bình 
hiệu 
giá 
SD (ñộ 
lệch 
chuẩn) 
CV 
(Hệ số 
phân 
tán) 
(%) 
DEN-1 5,70 5,80 5,80 5,80 5,77 0,0579 1 
DEN-2 5,70 5,70 5,63 5,70 5,68 0,0406 0,72 
DEN-3 5,80 5,70 5,80 5,80 5,77 0,0579 1 
Hiệu giá vi-rút của các mẫu HT nhiễm týp vi-rút DEN 
khác nhau có hệ số phân tán (CV) dao ñộng từ 0,72 (HT nhiễm 
vi-rút DEN-2) ñến 1 (HT nhiễm vi-rút DEN-1 và DEN-3), nhỏ 
hơn 30%. Mặt khác, theo ñồ thị Shewhat và Levey-Jening và 
quy tắc Westgard, hiệu giá vi-rút DEN trong các mẫu HT 
nghiên cứu ñược xác ñịnh là ñáng tin cậy vì sự dao ñộng của 
hiệu giá vi-rút sau 3 lần xét nghiệm ñều nằm trong khoảng ± 
1SD (Biểu ñồ 1) với hiệu giá vi-rút DEN-1, -3 là (5,7-5,8) và 
DEN-2 là (5,63-5,7), không xảy ra trường hợp shift hay 
trend(5). 
Tính ổn ñịnh của hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên 
cứu (sau 3 tháng bảo quản ở -700C) 
Các mẫu HT nghiên cứu ñược bảo quản ở -700C trong 3 
tháng rồi chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút lặp lại 3 lần cho kết quả ở 
bảng 2. 
Bảng 2: Hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu trước 
(T0) và sau 3 tháng (T3) bảo quản ở -700C theo ñơn vị log10 
TCID50/mL. 
Hiệu giá vi-rút T0 Hiệu giá vi-rút T3 
Mẫu 
HT 
nhiễm 
vi-rút Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 
Trung 
bình 
hiệu giá 
T0 
Trung 
bình 
hiệu giá 
T3 
DEN-1 5,70 5,80 5,80 5,70 5,73 5,73 5,77 5,72 
DEN-2 5,70 5,70 5,63 5,70 5,63 5,63 5,68 5,65 
DEN-3 5,80 5,70 5,70 5,70 5,73 5,70 5,77 5,71 
Mẫu HT nhiễm vi-rút DEN-1 và DEN-3 giảm hiệu giá 
0,05 log10 TCID50/mL, còn mẫu HT nhiễm vi-rút DEN-2 giảm 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 276 
hiệu giá 0,03 log10 TCID50/mL. CV của 3 lần chuẩn ñộ hiệu giá 
vi-rút các mẫu HT nghiên cứu ñều nhỏ hơn 30%. Hiệu giá vi-
rút giảm không ñáng kể sau 3 tháng bảo quản ở -700C (< 0,2 
log10 TCID50 /mL). Phân tích T-test cho thấy mẫu HT DEN-1: 
T =1,34 < t 0,05 = 2,91, HT DEN-2: T = 0,707 < t 0,05 = 2,13 và 
HT DEN-3: T = 1,63 < t 0,05 = 2,9 và F-test cho thấy HT DEN-
1,-3: F= 11,11< F 0,05= 19 còn HT DEN-2: F= 1< F 0,05= 
19(Error! Reference source not found.). Kết quả phân tích thống kê cho 
thấy hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu trước và 
sau khi bảo quản 3 tháng không khác biệt. Như vậy, quy trình 
bảo quản HT nhiễm vi-rút DEN ở -700C ñảm bảo không làm 
giảm hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu cũng như 
trong bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn sau này. 
Biểu ñồ 1: Độ lặp lại hiệu giá vi-rút DEN theo ñơn vị log10 TCID50/mL (Trái: hiệu giá vi-rút DEN-1, -3; Phải: hiệu giá vi-rút DEN-
2) 
Về quy trình thiết lập bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-
rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học (phân lập vi-rút trên 
nuôi tế bào C6/36 và RT-PCR) 
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược thiết lập cho 
chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD phải riêng biệt cho từng 
týp vi-rút DEN và chia theo thang nồng ñộ từ 101 ñến 105 
TCID50/mL. Từ mẫu HT nghiên cứu nhiễm từng týp vi-rút 
DEN ñã ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút, bộ mẫu HT có nồng ñộ 
vi-rút chuẩn từ 101 ñến 105 TCID50/mL ñược chuẩn bị cho từng 
týp vi-rút DEN bằng cách pha loãng HT nghiên cứu trong môi 
trường DMEM 2% huyết thanh bào thai bê (FCS) (ñối với 
phân lập vi-rút trên nuôi tế bào C6/36) hoặc nước cất vô trùng 
(ñối với RT-PCR). Sau ñó, chia nhỏ và bảo quản ở -700C. 
Về ñánh giá thông số kỹ thuật của bộ HT có nồng ñộ vi-rút 
chuẩn 
Đối với phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và ñịnh 
danh bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DFA) và gián 
tiếp (IFA) 
Bộ HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn của từng týp vi-rút DEN 
ñược xác ñịnh giới hạn phát hiện dương tính của DFA và IFA 
theo: 1- mật ñộ tế bào ban ñầu (2.104 tế bào/mL và 2.105 tế 
bào/mL), 2- kỹ thuật gây nhiễm HT vào tế bào (cấy hấp phụ và 
cấy bề mặt) và 3- thời gian gặt tế bào gây nhiễm (sau 7 ngày 
hoặc sau 14 ngày). Kết quả ñược trình bày trong bảng 3. 
6.66 
6.37 
185
+2SD 
+1SD 
TB 
-1SD 
-2SD 
-3SD 
+3SD 6.67 
5.17 
4.8 
185
5.47 
5.77 
185
Lần 1 Lần 2 Lần 3 
(Trái) 
 5.68 
6.29 
6.08 
185
5.88 
5.48 
5.07 
5.28 -2SD 
-3SD 
Lần 1 Lần 2 Lần 3 
(Phải) 
+3SD 
+2SD 
+1SD 
-1SD 
TB 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 277 
Bảng 3: Giới hạn phát hiện dương tính của DFA và IFA theo typ vi-rút, kỹ thuật gây nhiễm tế bào, mật ñộ tế bào ban 
ñầu và thời gian gặt tế bào nhiễm 
HT nhiễm vi-rút Kỹ thuật gây nhiễm Mật ñộ tế bào (TB/mL) 
Thời gian gặt 
(ngày) DFA (TCID50/mL) IFA (TCID50/mL) 
Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105 
Cấy bề mặt 2.105 
7 104 103 
2.105 101 101 Cấy hấp phụ 
2.104 102 102 
DEN-1 
Cấy bề mặt 2.105 
14 
103 103 
Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105 
Cấy bề mặt 2.105 
7 103 103 
2.105 101 101 Cấy hấp phụ 
2.104 102 102 
DEN-2 
Cấy bề mặt 2.105 
14 
102 102 
Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105 
Cấy bề mặt 2.105 
7 104 103 
2.105 101 101 Cấy hấp phụ 
2.104 102 102 
DEN-3 
Cấy bề mặt 2.105 
14 
103 103 
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn của cả 3 týp DEN sau 7 ngày gặt cho ngưỡng phát hiện là 104 TCID50/mL 
(với DFA) và 103 TCID50/mL (với IFA), còn sau 14 ngày gặt thì ngưỡng phát hiện là 101 - 103 TCID50/mL (với DFA 
và IFA). Như vậy, không có sự khác biệt giữa các thông số kỹ thuật khảo sát sau 7 ngày gặt nhưng sự khác biệt thể 
hiện rõ khi gặt tế bào gây nhiễm sau 14 ngày. So sánh kết quả phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 ở hai thời 
ñiểm gặt tế bào gây nhiễm (7 và 14 ngày) cho thấy tỷ lệ dương tính của DFA và IFA cao nhất khi cấy hấp phụ ở mật ñộ 
2.105 tế bào/mL và gặt sau 14 ngày, ñồng thời tỷ lệ % tế bào nhiễm quan sát cũng cao hơn các thông số khác. 
Đối với RT-PCR DEN sử dụng bộ mồi Lanciotti 
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược chiết xuất ARN bằng bộ sinh phẩm Qiagen và khuếch ñại ñoạn gen ñặc 
hiệu cho týp vi-rút DEN bằng RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti. Kết quả trình bày trong hình 1. 
Hình 1: Kết quả ñịnh týp vi-rút DEN và giới hạn phát hiện của RT-PCR với mồi Lanciotti trên bộ mẫu HT có nồng ñộ 
vi-rút chuẩn 
Trong quy trình RT-PCR và PCR bán tổ, yếu tố quyết ñịnh ñộ ñặc hiệu và ñộ nhạy là mồi. Mồi của 
Lanciotti thiết kế nằm trong vùng gien cấu trúc C và PrM cho thấy ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu cao nhất, vì thế 
phù hợp cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD từ HT bệnh nhân(4,8). ARN vi-rút DEN ñược chiết xuất 
bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral RNA mini kit của Qiagen. Đây là bộ sinh phẩm thương mại có quy trình 
ñơn giản, nhanh, tinh chế ARN triệt ñể giúp tăng ñộ nhạy của RT-PCR(8). Khi xét nghiệm trên bộ mẫu HT 
có nồng ñộ vi-rút chuẩn, RT-PCR DEN cho kết quả dương tính ở nồng ñộ vi-rút 102 TCID50/mL (ñối với 
týp vi-rút DEN-2, -3), phù hợp với kết quả của Vũ Thị Quế Hương(8). Riêng bộ HT có nồng ñộ vi-rút DEN-
1 chuẩn thì RT-PCR chỉ dương tính từ nồng ñộ 104 TCID50/mL trở ñi. Độ nhạy của RT-PCR ñối với týp vi-
rút DEN-1 bị giảm so với 2 týp vi-rút DEN khác, có thể lý giải là do: 1-sai số khi pha loãng HT, 2- mồi 
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 278 
giảm ñộ nhạy do ñiều kiện bảo quản, 3- mồi giảm ñộ nhạy do chủng vi-rút DEN-1 ñã bị ñột biến ở vùng 
thiết kế mồi. 
Phân tích hồi quy tương quan tuyến tính giữa nồng ñộ vi-rút và hàm lượng ARN cho thấy nồng ñộ vi-rút 
tương quan tuyến tính với hàm lượng ARN tinh chế, thể hiện qua các phương trình hồi quy là: DEN-1 Y1 = 
2,03X + 0,48; DEN-2 Y2 = 2,88X + 0,48; DEN-3 Y3 = 2,03X + 0,48(Error! Reference source not found.). Hơn nữa, 
giá trị OD A260nm của ARN 3 týp vi-rút DEN ở nồng ñộ 102 TCID50/mL ñều là 0,48-0,49 µg/µL, như vậy 
không thể do sai số pha loãng HT. Đồng thời, ñiều kiện bảo quản các mồi của Lanciotti là như nhau. Do ñó, 
kết quả ñộ nhạy RT-PCR giảm ñối với bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút DEN-1 là do chủng vi-rút DEN-1 
phân lập trong giai ñoạn này ñã bị ñột biến ở vùng thiết kế mồi, gây cản trở cho sự bắt cặp, phù hợp với kết 
quả của Jean-Marc Reynes(7). Chúng tôi sẽ tiến hành giải trình tự vùng thiết kế mồi của týp vi-rút DEN-1 
trên chủng vi-rút DEN-1 nghiên cứu ñể khẳng ñịnh kết quả này. 
KẾT LUẬN 
Nghiên cứu ñã thiết lập thành công quy trình xây dựng bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút DEN chuẩn cho chẩn 
ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và RT-PCR. Kết quả thu 
ñược như sau: 
Xác ñịnh nồng ñộ vi-rút DEN từ mẫu HT nghiên cứu ban ñầu với ñộ tin cậy cao và ổn ñịnh trong ñiều kiện bảo 
quản -700C. 
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược xây dựng cho từng týp vi-rút DEN riêng rẽ với thang nồng ñộ từ 101 
ñến 105 TCID50/mL. 
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñã xác ñịnh giới hạn phát hiện của kỹ thuật phân lập vi-rút trên nuôi tế bào 
muỗi C6/36 và ñịnh danh vi-rút bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DFA) và gián tiếp (IFA) cũng như kỹ 
thuật RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti. 
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng nội bộ và tiến trình 
chuẩn hoá phòng thí nghiệm ở các viện khu vực, cũng như tăng cường hiệu quả giám sát vi-rút học bệnh 
SD/SXHD. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Đặng Văn Giáp (1997). Phân tích dữ liệu khoa học bằng phần mềm Microsoft Excel. Nhà xuất bản giáo dục. Tr: 
41-42. 
2. Figueiredo L.T., Batista W.C., Igarashi A. (1997). Detection and identification of dengue virus isolates from 
Brazil by a simplified reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Revista do Instituto de 
Medicina Tropical de Sao Paulo, 39(2): 79-83. 
3. Figueiredo L.T.M., Shope R.E. (1987). An enzyme immunoassay for dengue antibody using infected cultured 
cells as antigen. J. Virol. Methods, 17: 191-198. 
4. Lanciotti R.S, C.H. Calisher, D.J. Gubler, G. Chang, V. Vordam (1992). Rapid detection and typing of dengue 
viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 30: 545-
551. 
5. NSH (2008). Quality assurance in the diagnostic virobiology and serology laboratory. Standard Unit, Evaluations 
and standards laboratory center for infections. 
6. Reed L.J. and H. Muench (1938). A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints. Am J Epidemiol, 27: 
493-497. 
7. Reynes Jean-Marc, Sivuth Ong, Channa Mey, Chantha Ngan, Stefan Hoyer, Amadou A. Sall (2003). Improved 
Molecular Detection of Dengue Virus Serotype 1 Variants. J. Clin. Microbiol., 41(8): 3864-3867. 
8. Vũ Thị Quế Hương (2001). Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn ñoán sốt xuất huyết và nghiên cứu dịch tể 
học phân tử vi-rút dengue. Luận án tiến sĩ y học, chuyên ngành dịch tể học.