Xác định hoạt lực của enzyme lipolitic trong bột lòng trắng trứng đà điểu nuôi ở tỉnh Quảng Nam - Đà Nẵng

XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC CỦA ENZYME LIPOLITIC
TRONG BỘT LÒNG TRẮNG TRỨNG ĐÀ ĐIỂU NUÔI
Ở TỈNH QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG
LÊ VẦN HOÀNG Giáo sư - Tiến sĩ khoa học, Trường Đại học Cửu Long
, LÊ THỊ LIÊN THANH Phó Giáo sư - Tiến sĩ, Trường Đại học Cửu Long
,
BÙI THẾ VINH Tiến sĩ, Trường Đại học Cửu Long
, VƯƠNG BÀO THY***
Ngày nhận bài: 10/8/2019 - Ngày gửi phản biện: 15/8/2019
Tóm tắt
X
ác định hoạt lực enzyme lỉpolỉtỉc trong bột lòng trắng trứng đà điểu nói riêng và trứng gia cầm nói chung nhằm mục đích: hạn chế tối đa tác dụng của enzyme này trong việc chuyển hóa chất béo thành vị xà phòng và vị bị oxy hóa khác trong các sản phẩm thực phẩm có sử dụng lòng trắng trứng trong quá trình bảo quản.
• Nồng độ bột lòng trắng trứng nhỏ nhất cần thiết sử dụng để kiểm tra hoạt lực enzyme lỉpolitic trên môi trường (I) và (II) là 0,05g/ml.
• Giới hạn cho phép sự hiện diện của lỉpolỉtỉc trong bột lòng trắng trứng đà điểu được xác định: không vượt quá khối lượng 2.1 ừ2g lỉpolỉtỉc/g bột lòng trắng trứng (tức là từ lữ4 - 10~3g lipolitic/g bột lòng trắng trứng).
Abstract
This study is aimed to determine the activity of lipolitic enzyme in the power produced from ostrich egg whites in particular and poultry eggs ones in general with the aim of: minimizing the effect of this enzyme in converting fat into soap state and other oxidized flavors in food products that use egg whites during storage.
• The minimum concentration of egg white powder needed to test lipolitic enzyme activity on the cultured environment (I) and (II) is 0.05g/ml.
• The allowable limit of the presence oflipolitic in ostrich egg white powder is determined not to exceed the weight of 2.10r2g oflipolitic / g of egg white powder (i.e. Id4 - ld3g of lipolitic / g egg white powder).
Đặt vấn đề
Lòng trắng của các loại trứng gia cầm có giá trị dinh dưỡng không cao ngoài thành phần albumine (trung bình từ 9,7 -11%), các thành phần dinh dưỡng khác có trị số hầu như không đáng kể. Thế nhưng, thành phần lòng trắng trứng lại mang những đặc tính công nghệ quý giá với tư cách là một phụ gia tự nhiên như: Khả năng nhũ hóa, chống kết tinh, tạo đông, kết dính, giữ khí, làm nở V. V... Các đặc tính này có ý nghĩa công nghệ cao khi sử dụng chế tác thực phẩm, đặc biệt trong kỹ nghệ sản xuất bánh và kẹo mem (bakery).
Nuôi đà điểu để cấp giống và tạo nguồn thịt mới du nhập vào Việt Nam khoảng 1 thập niên trở lại đây, đã được nhiều địa phương nuôi dưỡng, có nơi phát triển thành trang trại lớn.
Trứng đà điểu (Ostrich egg) có khối lượng trung bình từ 1,2 - 1,5 kg/quả. Do vậy, sản xuất bột trứng từ lòng trắng trứng đà điểu sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với tiêu dùng thường nhật trên đối tượng là trứng đà điểu không cho khả năng làm giống.
Tuy nhiên, lòng trắng trứng chứa phức hệ enzyme lỉpolitỉc (chủ yếu Lipase và Esterase) là nguyên nhân tạo vị bị oxy hóa cho dòng sản phẩm giàu chất béo. Đe ứng dụng tốt nhiều lợi thế từ phụ gia tự nhiên này, cần phải khống chế sự hiện diện của enzyme lỉpolỉtỉc trong bột lòng trắng trứng nói chung và đà điểu nói riêng nhằm hạn chế tối đa quá trình sinh học bất lợi nêu trên.
Xác định hoạt lực của lipolỉtỉc không chỉ: trước mắt, kiểm tra sự hiện diện của phức hệ enzyme này từ nguồn bột trứng nhập ngoại mà trong tương lai gần, giúp các doanh nghiệp sản xuất bột trứng ở Việt Nam có biện pháp công nghệ thích hợp nhằm giảm thiểu lượng enzyme này trong quá trình gia công kỹ thuật.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Bột lòng trắng trứng đà điểu thực nghiệm sau sấy màng theo các thông số kỹ thuật:
Chiều dày lớp lòng trắng trứng (d, mm): 1
Nhiệt độ sấy (°C): 64
Thời gian sấy (phút) : 20
Độ ẩm sản phẩm (W,% ): 6,7
Thời gian bảo quản sản phẩm sau sấy (ngày): 15
Bột lòng trắng trứng gia cầm thương mại nhập từ Ấn Độ.
Enzyme tinh khiết Lipase s 80000 và Esterase 30000 từ hãng Grist - Brocade - CH Pháp.
Dung dịch hòa tan enzyme và bột trứng: ringerl/4 - CHLB Đức.
Môi trường Tributyrin (I)
Thành phần của môi trường:
Môi trường cơ bản (PCA, pH 7,0 ± 0,2): 1 lit
Tributyrin (hoặc glycerol tributyrat): 10 ml
Phenol đỏ: 50 ml
Tributyrin (hoặc glycerol tributyrat) được sử dụng với tư cách là chất cảm ứng cho lipase. Tributyrin không tan trong nước và khi kết hợp với thạch hắng (agar) có trong môi trường sẽ tạo nên trạng thái nhũ hóa và làm đục môi trường. Khi có sự hiện diện của lipase, thành
Tween 80 (còn gọi là monooleate sorbitol) là chất cảm ứng cho esterase. Các thành phần có trong môi trường Tween 80 hòa tan tốt nên môi trường luôn luôn trong. Khi có sự hiện diện của esterase, chúng sẽ chuyển hóa monooleate sorbitol tạo ra acid béo tự do. Acid tự do này sẽ kết hơp với canxi có trong môi trường tạo muối canxi clorua (CaCl2) không tan nên làm cho môi trường từ trong chuyển thành đục. Sự chuyển đổi trạng thái môi trường khẳng định sự có mặt của esterase. Vì vậy môi trường Tween 80 được đánh giá là chỉ thị nhận diện esterase.
2 môi trường được thanh trùng ở 121°c, 20 phút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp enzyme: xác định hoạt lực của lỉpolitic
* Nguyên tắc:
L
	2 - monoglycerid + acid béo
MGLP^ Glycerol + acid béo
GK
	► Glycerol - 3 photphate +
GPO
	Dihydroxyacetone + H2O2
POD
	► Quinondimine + 4 H2O
phần triglycerid sẽ chuyển hóa thành glycerol và acid butyric. Các hợp phần chuyển hóa đều có tính tan, do đó sẽ làm cho môi trường từ đục chuyển sang trong. Mặt khác, phenol đỏ (có màu đỏ da cam ở pH = 8,2, màu vàng chanh ở pH = 6,4). Khi môi trường bị acid hóa bởi sự tạo thành acid butyric, màu của môi trường từ đỏ da cam chuyển thành vàng chanh. Sự chuyển màu và sự thay đổi trạng thái môi trường khẳng định sự có mặt của lipase. Vì vậy, môi trường này được xem là chỉ thị giúp nhận diện lipase.
* Môi trường Tween 80 (II)
Thành phần môi trường:
Môi trường cơ bản (PCA, pH 7,0 ± 0,2): 1 lít
CaCl21% : 10 ml
Tween 80 : 17,5 ml
Thạch trắng (agar) : 15 g
1,2 diglycerid
2 - monoglycerid
Glycerol + ATP
Glycerol - 3 photphate + O2
2H2O2 + amino-antipyrine + TOOS
Tốc độ tạo thành quinondimine tự do tỷ lệ thuận với hoạt lực của lipase có trong mẫu thử.
Tên enzyme:
L: Lipase', MGLP: Monoglycerid lipase', GPO: Glyceol - 3 photphatoxydase', POD: Peroxydase', TOOS: N - ethyl - N - [2 - hydroxy - 3 - sulfopropyl] - m - toluidine
Tính toán:	_	t .
u /I máu thữ - A máu tràng
— = T”~	;—:	:	r , - X «
ỉ A tiéu íTỉuứĩỉ — A mau trăng
Trong đó,
n: hoạt lực enzyme tính bằng đơn vị U/I của enzyme tiêu chuẩn được ghi trên lọ chứa enzyme tinh khiết
2.2.2. Phương pháp toán học: Tính khối lượng enzyme lỉpolỉtic
Khối lượng enzyme lỉpolỉtic (tính bằng gam) có trong 1 gam bột lòng trắng trứng được tính theo biểu thức:
Ẽ
(1)
Trong đó,
C: khối lượng enzyme lipolitid 1 gam bột lòng trắng trứng đà điểu (gam);
A: nồng độ nhỏ nhất của bột lòng trắng trứng thực nghiệm cho kết quả chuyển đổi trạng thái môi trường dương tính (+) trên hộp petri chứa môi trường (I) và (II) (gam);
B: dung dịch đệm chứa enzyme lỉpolỉtic tinh khiết có nồng độ và kết quả trên 2 môi trường (I) và (II) như A.
Kết quả nghiên cứu
Để xác định hoạt lực lỉpolỉtỉc trong bột lòng trắng trứng đà điểu và nhập ngoại, chúng tôi sử dụng dung dịch ringer 1/4 để chuẩn bị các nồng độ khác nhau từ enzyme tinh khiết và hòa tan mẫu lòng trắng thực nghiệm. Giới hạn thực nghiệm ứng với các nồng độ sau:
+ Enzyme tinh khiết (Ịipase S80000 và esterase 30000): 100; 50; 10; 5,0; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01 (mg/ml).
+ Bột lòng trắng trứng đà điểu và bột trứng nhập ngoại từ Ấn Độ: 0,8; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01; 0,005 (g/ml).
Tương ứng với nồng độ đã chuẩn bị (cả enzyme và bột trứng), tiến hành gieo cấy bằng phương pháp chấm điểm trên 2 môi trường đặc I và II đã được chuẩn bị sẵn trong hộp petri. Các hộp petri được nuôi trong tủ ấm ở 30°C, 72 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sự thay đổi trạng thái và màu của môi trường (Ị) và (II) phụ thuộc vào nồng
độ enzyme lipolitic tinh khiết
Nồng độ enzyme Upolitic tinh khiết (mg/ml)
Kêt quả chuyên đôi trạng thái và màu của môi trường
Tributyrin (I)
Tween 80 (II)
100
Môi trường từ đục chuyển thành trong, màu vàng trong 24 giờ
Môi trường từ trong chuyển sang đục trong 24 giờ
50
Môi trường từ đục chuyển thành trong, màu vàng trong 24 giờ
Làm đục nhanh môi trường trong 24 giờ
10
Môi trường từ đục chuyển thành trong, màu vàng trong 48 giờ
Môi trường chuyển từ trong sang đục trong 48 giờ
5
Môi trường có màu vàng, xen lẫn vùng trong khá rõ
Môi trường đục xen lẫn những vùng trong
1
Môi trường màu vàng, nhiều vùng chuyển thành trong suốt sau 3 ngày nuôi cấy
Môi trường đục xen lẫn những vùng trong sau 3 ngày nuôi cấy
0,5
Môi trường có màu vàng với nhiều vùng trong
Môi trường xen lẫn 1 vài vùng đục
0,2
Môi trường có màu vàng xuất hiện một vài vùng trong
Môi trường xen lẫn 1 vài vùng đục nhẹ
0,1
Môi trường màu vàng, đục hoàn toàn
Môi trường giống đối chứng
0,05
Môi trường màu vàng, không có vùng trong
Môi trường trong giống đối chứng
0,01
Môi trường màu vàng, hoàn toàn đục
Môi trường trong giống đối chứng
Đối chứng
Môi trường có màu đỏ da cam và đục
Môi trường trong
Từ kết quả trong bảng 3.1 được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Sự chuyển đỗi trạng thái của môi trường
(Trải): Môi trường Tributyrin (I) từ đục thành trong tương ứng với nồng độ 50 mg/ml trong 24 giờ
(Phải): Môi trường Tween 80 (II) từ trong thành đục tương ứng với nồng độ 50 mg/ml trong 24 giờ
Kêt quả bảng 3.1 cho thây:
Trên môi trường Tributyrin (I): Sự thay đổi trạng thái và màu của môi trường khá đặc trưng. Cường độ thay đổi tỷ lệ thuận với nồng độ của enzyme. Vì vậy, môi trường Tributyrin có thể đóng vai trò như chỉ thị để nhận diện lỉpase.
Trên môi trường Tween 80 (II): Qui luật và cường độ thay đổi trạng thái của môi trường Tween 80 có cùng kết quả tương tự như trên môi trường Tributyrin, chỉ khác là enzyme esterase. Vì thế, có thể sử dụng môi trường Tween 80 để kiểm tra sự hiện diện của esterase.
Trên cả 2 môi trường (I) và (II) nồng độ enzyme lỉpolitic thấp nhất cho kết quả rõ nét về sự chuyển đổi trạng thái lẫn màu của môi trường [kết quả dương tính (+)] nằm trong giới hạn từ 1 - 0,2mg/ml. Với liều lượng này cho thấy: cả 2 môi trường được chọn sử dụng vào mục tiêu xác định cường lực enzyme lỉpolitic là khả thi mang tính ứng dụng cao.
Sử dụng kết quả thu được trong bảng 3.1 làm căn cứ để tính toán lượng enzyme lipolitỉc hiện diện trong bột lòng trắng trứng có thể cho phép là bao nhiêu thì không có khả năng gây ra phản ứng xà phòng hóa hoặc oxy hóa trực tiếp chất béo bởi enzyme này. Chúng tôi sử dụng bột lòng trắng trứng đà điểu thực nghiệm và bột lòng trắng trứng gia cầm của Ấn Độ. Ket quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Định lượng enzyme lipase trong bột lòng trắng trứng đà điểu trên môi trường
Trỉbutyrỉn (I)
Nồng độ bột lòng trắng trứng đà điểu (g/ml)
Kết quả trên môi trường Tributyrỉn (I)
0,8
Môi trường từ đục chuyển trong hoàn toàn (++++), màu vàng
0,6
Môi trường trong hoàn toàn (1 1 1 1), màu vàng
0,5
Môi trường có màu vàng và trong (+++)
0,4
Môi trường có màu vàng và trong (+++)
0,3
Môi trường có màu vàng và trong (+++)
0,2
Môi trường trong (++), màu vàng
0,1
Môi trường có màu vàng và trong (+)
0,05
Môi trường có màu vàng và bán trong (+)
0,01
Môi trường giữ nguyên như đối chứng
0,005
Môi trường giữ nguyên như đối chứng
0,001
Môi trường giữ nguyên như đối chứng
Đối chứng
Môi trường có màu đỏ da cam và đục
Điều kiện thí nghiệm:
+ Số lần lặp lại thực nghiệm trên cả 2 loại bột trứng : 10
+ Nuôi cấy trong cùng chế độ nhu khi tiến hành thực nghiệm trên enzyme tinh khiết (30°C, 72 giờ)
Biểu diễn kết quả:
Chỉ trình bày kết quả thu được trên môi trường Tributyrin (I) bởi lipase được đánh giá là enzyme chủ đạo trong phản ứng sinh học tạo nên mùi, vị bị oxy hóa từ chất béo.
Lượng enzyme lipase tính được từ bột lòng trắng trứng gia cầm Ấn Độ có cùng giá trị đại số với lượng enzyme từ bột lòng trắng trứng đà điểu (bảng 3.2) nên không trình bày kết quả.
Ket quả từ bảng 3.2 cho thấy:
Nồng độ bột lòng trắng trứng đà điểu thấp nhất cho kết quả dương tính (+) trên môi trường Tributyrin (I) là 0,05g/ml.
Kết quả nhận được tưong tự khi cấy các dung dịch đệm chứa lipase s 80000 tinh khiết có nồng độ lmg/ml trên môi trường (I).
2 kết quả thu được nêu trên có nghĩa: Trong 0,05g bột lòng trắng trứng đà điểu chứa Img lipase.
Từ công thức (1) và kết quả bảng 3.2, tính khối lượng lipase (C) [gam lipase/g bột lòng trắng trứng đà điểu], kết quả:
c ~	bột lộngtriqgtrửnịi
Kết quả tính toán trên cho phép khẳng định: Trong lgam bột trứng nếu chứa 1 xlO'2 gam enzyme lipolitic sẽ gây ra vị xà phòng và vị bị oxy hóa do sản phẩm giàu chất béo có sử dụng bột lòng trắng trứng.
• Ở nồng độ bột trứng sử dụng nhỏ nhất là 0,05 g/ml cho kết quả dương tính (+) về hoạt lực của lipolitic. Do đó, cho phép chúng ta lựa chọn nồng độ thích hợp để kiểm tra vừa giảm số lượng mẫu thử vừa tiết kiệm enzymee tinh khiết vốn rất đắt. Cụ thể chọn các nồng độ 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1 và 0,01.
Kết luận
Bằng phương pháp enzyme kết quả thu được cho phép kết luận:
Khi sử dụng bột lòng trắng trứng đà điểu vào sản xuất thực phẩm giàu chất béo thì hàm lượng enzymee lỉpolỉtỉc phải có giá trị nhỏ hơn 2xl0'2 gam enzyme/1 gam bột lòng trắng trứng (tức là từ 10’4 - 10’3 gam enzyme/l gam bột lòng trắng) sẽ đảm bảo chất lượng cho sản phẩm về phương diện mùi lẫn an toàn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
V. Duport - Dosage de 1’activité lipolitique dans le poudre blanc d’oeuf. IUT d’Anger, France, 1997.
Grist-brocades - Détemination cinétique de 1’activité lipasique par kit enzymeatique, 1992.
R.Lecorq - Manuel I’identification médicales et de biologie Clinique, ed. DOIN, 1971.
N.Marchal, J.L.Bourdon, C.I.Richard - Les milieux de culture pour 1’isolement et I’entification biochimique des bactéries, ed. DOIN, 1987.
J.L.Thapon, C.M.Bourgeois - L’oeuf et les ovoproduits, collection sciences et techniques Agro-alimentaire, 1989.