Xác định cefalexin trong nước thải bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng với detector photodioide array

Tạp Chí Khoa Học Giáo Dục Kỹ Thuật Số 37 (09/2016) 
Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật TP. Hồ Chí Minh 
1 
XÁC ĐỊNH CEFALEXIN TRONG NƢỚC THẢI 
BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG 
VỚI DETECTOR PHOTODIOIDE ARRAY 
DETERMINATION OF CEFALEXIN IN WASTEWATER 
BY ULTRA-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY 
 WITH PHOTODIODE ARRAY DETECTOR 
 Nguyễn Huy Hoài, Nguyễn Văn Hợp 
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 
Ngày tòa soạn nhận bài 28/3/2016, ngày phản biện đánh giá 25/5/2016, ngày chấp nhận đăng 15/6/2016 
TÓM TẮT 
Phương pháp sắc ký lỏng nhanh siêu hiệu năng đã được xây dựng để xác định Cefalexin 
trong nước thải. Quá trình phân tích được tiến hành trên hệ thống ACQUITY UPLC với cột 
Cortecs-C18, hệ pha động Methanol - Acetonitril - Kali dihydrogen orthophosphate 13,6 g/L 
- Nước cất (2:5:10:83), lưu lượng dòng 0,3 ml/phút với đầu dò UV-PDA. Kết quả đánh giá 
cho thấy, phương pháp phân tích đạt các yêu cầu tính đặc hiệu, độ lặp lại, độ nhạy, tính tuyến 
tính và độ đúng. N ng độ cefalexin tuyến tính trong khoảng t 4 - 60 µg/L. Giới hạn phát hiện 
(LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 1,2 µg/L và 4,0 µg/L. T kết quả nghiên c u, 
phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng có thể ng dụng để xác định cefalexin trong nước 
thải ở n ng độ thấp (µg/L). 
Từ khóa: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng; cefalexin; nước thải; đầu dò diod array tử 
ngoại; pha đảo. 
ABSTRACT 
The Ultra Performance Liquid Chromatography method has been developed for the 
determination of cefalexin in wastewater samples. The chromatography was performed by 
ACQUITY UPLC with Cortecs-C18 column using a mobile phase containing the mixture of 
methanol R, acetonitrile R, 13.6 g/l solution of potassium dihydrogen phosphate R and water 
R in the ratio of 2:5:10:83 (v/v), at a flow rate 0,3 ml/min and a UV-PDA detector. The 
statistical data analysis of the method such as the specificity, sensitivity, linearity, precision, 
accuracy, giving results within the acceptable range. Linearity for cefalexin concentrations 
was established in the range of 4 - 60 µg/L. The limits of detection (LOD) and the limits of 
quantification (LOQ) were found to be 1.2 µg/L and 4.0 µg/L, respectively. The method has 
showed the advantages of the Ultra Performance Liquid Chromatography for determination 
of cefalexin in wastewater at very low concentration levels (µg/L). 
Keywords: Ultra-Performance Liquid Chromatography; cefalexin; wastewater;UV-
PDA detector, reversed phase. 
1. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Sự hiện diện ngày càng nhiều của nhiều 
dược chất (API/active pharmaceutical 
ingredient) trong môi trường đã gây lo lắng về 
các tác động bất lợi của chúng đến sức khỏe 
và các hệ sinh thái [1]: có thể gây ung thư, rối 
loạn sinh trưởng của sinh vật, kích thích sự 
phát triển của các vi sinh vật kháng thuốc. 
2 
Tạp Chí Khoa Học Giáo Dục Kỹ Thuật Số 37 (09/2016) 
Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật TP. Hồ Chí Minh 
Trong các API thuộc nhóm kháng sinh 
(Antibiotics), cefalexin là một trong những 
chất được sử dụng khá phổ biến, như chỉ 
định trong điều trị nhiễm khuẩn đường hô 
hấp, chống nhiễm trùng đường tiểu, nhiễm 
khuẩn da [2]. Hiện nay, rất nhiều chế phẩm 
chứa cefalexin đã được Cục Quản lý Dược – 
Bộ Y tế Việt Nam cấp giấy phép sản xuất và 
lưu hành. Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất, 
sử dụng và tiêu huỷ, dư lượng cefalexin có 
trong nước thải và lan tryền trong môi trường 
làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người [3] . 
Dược điển Anh (BP2015), Dược Điển 
Mỹ (United States Pharmacopeia 36) [4], [5] 
chỉ đưa ra quy trình phân tích cefalexin trong 
dược phẩm (sản phẩm thuốc) bằng phương 
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với 
đầu dò tử ngoại (UV). Song, nồng độ 
cefalexin trong nước thải rất thấp, thường ở 
mức siêu vết (< ppb hay µg/L) thì phương 
pháp trên tỏ ra không hiệu quả [6], Để khắc 
phục nhược điểm này chúng tôi đã tiến hành 
nghiên cứu xác định cefalexin trong nước 
thải ằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu 
năng (UPLC–Ultra-Performance Liquid 
Chromatography) với đầu dò (detector) 
photodiod array tử ngoại (UV-PDA) và định 
lượng bằng phương pháp đường chuẩn. 
2. PHƢƠNG PHÁP – THỰC NGHIỆM 
2.1. Hóa chất, thuốc thử, thiết bị 
Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng 
ACQUITY UPLC (Mỹ) với đầu dò (detector) 
PDA UV-VIS, phần mềm xử lý phổ 
Empower 3, phần mềm ACQUITY columns 
Calculator của Waters, cột tách Cortecs C18 
(Mỹ), cột chiết pha rắn Oasis HLB cartridges 
– Oasis (200 mg, 6 mL). 
Mẫu nước thải được thu gom từ nhà 
máy sản xuất cefalexin. Các hóa chất được sử 
dụng bao gồm: Kali dihydrogen 
orthophosphate (tinh khiết phân tích), 
Na2EDTA (tinh khiết phân tích), Acid formic 
(tinh khiết phân tích), Methanol HPLC (tinh 
khiết sắc ký), Acetonitril HPLC (tinh khiết 
sắc ký), nước cất 2 lần. Chất chuẩn Cefalexin 
(Viện kiểm nghiệm TP.Hồ Chí Minh). 
2.2. Phƣơng pháp thực nghiệm 
2.2.1. Kỹ thuật UPLC 
Kỹ thuật UPLC sử dụng cột tách thước 
hạt nhỏ và áp suất hệ thống cao để tăng độ 
nhạy, tăng độ phân giải, giảm thời gian phân 
tích. Trong nghiên cứu này sử dụng cột tách 
Cortecs; chất nhồi cột octadeclsilyl silica 
(ODS/C18), kỹ thuật tạo hạt lõi rắn). 
2.2.2. Xác định điều kiện sắc ký 
Do cefalexin có đặc điểm cấu tạo phân 
tử chứa nhóm car onxylic, cho nên phân tử 
cefalexin phân cực và tan trong nước. Chúng 
tôi sử dụng phương pháp sắc ký pha đảo 
(Reversed Phase/RP) dùng để phân tích 
cefalexin đã được công ố trong Dược điển 
[4]. Tuy nhiên, các điều kiện sắc ký được 
công ố chỉ phù hợp cho hệ thống HPLC, vì 
vậy cần phải chuyển đổi để thích hợp cho 
phương pháp UPLC bằng phần mềm 
ACQUITY columns Calculator của Hãng 
Waters - phần mềm dùng chuyển đổi điều 
kiện HPLC sang UPLC. 
2.2.3. Quy trình phân tích 
Lấy mẫu: Mẫu nước thải được lấy theo 
quy định của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 
4556:1988: Mẫu được đựng trong chai thủy 
tinh sạch, kín, tránh sáng và được bảo quản ở 
nhiệt độ 4oC trước khi phân tích (không quá 
24 giờ kể từ khi lấy mẫu); 
Dãy dung dịch cefalexin chuẩn: Hòa 
tan cefalexin chuẩn trong nước cất và pha 
loãng bằng nước cất để được dãy nồng độ 
dung dịch chuẩn từ 4 µg/L- đến 60 µg/L. 
Mẫu trắng (blank) hay mẫu nền: Là 
mẫu nước cất, xử lý và phân tích tương tự 
với mẫu nước thải. 
Tạp Chí Khoa Học Giáo Dục Kỹ Thuật Số 37 (09/2016) 
Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật TP. Hồ Chí Minh 
3 
Chiết pha rắn (SPE): Hoạt hóa cột chiết 
pha rắn Oasis HLB cartridges lần lượt ằng 4 
mL methanol và 4 ml nước cất, tốc độ nạp 
dung dịch qua cột không quá 3 mL/phút. [7]. 
Xử lý mẫu: Mẫu thử và chuẩn được lọc 
qua màng lọc 0,45 m và tiến hành xử lý và 
phân tích theo như quy trình ở hình 1. 
Hình 1. Quy trình xử lý mẫu và phân tích 
cefalexin trong nước thải 
2.2.4. Tính toán kết quả 
Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính 
dạng y = ax + để tính nồng độ cephalexin có 
trong nước thải C (µg/L) theo công thức: 
C = 
a
bY 
 (1) 
Trong đó, y; tín hiệu đo (diện tích 
đỉnh/peak) của cefalexin chuẩn, x (µg/L); 
nồng độ Cefalexin chuẩn, a; hệ số góc, b; 
đoạn cắt trên trục tung. Y; tín hiệu đo của 
mẫu nước thải. 
2.3. Kiểm soát chất lƣợng c a phƣơng 
pháp [8] 
Chất lượng của phương pháp phân tích 
được đánh giá ằng tính đặc hiệu, độ lặp lại, 
độ đúng (bằng cách phân tích mẫu thêm 
chuẩn – spiked sample), khoảng tuyến tính, 
giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. 
Các số liệu thí nghiệm được xử lý ằng phần 
mềm Excel 2010 để xác định giá trị trung 
 ình, độ lệch, thiết lập đường tuyến tính, hệ 
số tương quan. 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Xác định điều kiện UPLC 
Dựa trên điều kiện sắc ký HPLC đã 
được công ố trong Dược điển, bằng phần 
ACQUITY UPLC columns Calculator 
chuyển để đổi điều kiện thích hợp cho hệ 
thống UPLC, kết quả được mô tả ở bảng 2. 
Bảng 2. Kết quả chuyển đổi điều kiện HPLC 
sang điều kiện UPLC 
Thông số 
Hệ thống 
HPLC-UV 
Hệ thống 
UPLC/UV-PDA 
Cột phân 
tách 
Xterra : pha đảo 
với chất nhồi 
C18; 4,6 mm x 
250 mm,5µm). 
Cortecs: pha đảo 
với chất nhồi 
C18; 4,6 mm x 
100 mm,2,7µm) 
Thể tích 
tiêm mẫu 
20 l 10 l 
Pha động 
Methanol –
Acetonitril -Kali 
dihydrogen 
orthophosphate 
13,6 g/L-Nước 
cất (2:5:10:83) 
Methanol-
Acetonitril-Kali 
dihydrogen 
orthophosphate 
13,6 g/L-Nước 
cất (2:5:10:83) 
Lưu 
lượng 
dòng 
1,5 mL/phút 0,3 mL/phút 
3.2. Khảo sát điều kiện đo 
Điều kiện đo được khảo sát ằng cách 
phân tích sắc ký mẫu trắng, cephalexin chuẩn 
bằng đầu dò diod array tử ngoại đồng thời 3 
thông số; thời gian lưu đỉnh (RT), ước sóng 
Mẫu thử 
(500ml) 
Dung dịch đã 
axit hóa 
Thêm 10 mL dung dịch 
Na2EDTA 5% , điều chỉnh 
đến pH khoảng 3,0 - 3,5 bằng 
dung dịch acid formic 5M 
Chiết pha rắn 
(SPE) 
Lấy 40 ml dung dịch lọc nạp 
qua cột chiết cột chiết Oasis 
HLB cartridges, rửa cột 
bằng 2x2 mL nước cất, giải 
hấp bằng 2x2 mL methanol 
Dịch chiết 
Cô dịch chiết bằng dòng khí 
N2 ở nhiệt độ phòng đến thể 
tích <0,5 mL. Định mức 
bằng nước cất đến 4 ml 
Dung dịch thử 
Phân tích UPLC 
4 
Tạp Chí Khoa Học Giáo Dục Kỹ Thuật Số 37 (09/2016) 
Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật TP. Hồ Chí Minh 
từ 200-400 nm với các điều kiện UPLC đã 
được nêu ở bảng 1. Kết quả khảo sát cho 
thấy phổ hấp thụ phân tử (UV) của cephalexin 
chuẩn có một đỉnh cực đại hấp thụ ở ước 
sóng (λ) 264 nm (hình 2) và mẫu trắng không 
có đỉnh hấp thụ trùng với cực đại hấp thụ 
chuẩn. Vì vậy, ước sóng được chọn để đo là 
264 nm, Bước sóng này khác với thông áo 
trong phương pháp Dược điển (254 nm) [4]. 
Hình 2. Phổ UV của cefalexin chuẩn 
3.3. Kiểm soát chất lƣợng phƣơng pháp 
3.3.1. Tính đặc hiệu và độ ổn định hệ thống 
Tính đặc hiệu của phương pháp phân 
tích được đánh giá ằng sự ảnh hưởng nền 
mẫu lên chất cần phân tích-cefalexin. Kết 
quả cho thấy mẫu trắng (nền mẫu) không có 
đỉnh ở thời gian lưu tương ứng với thời gian 
lưu cefalexin (2,353 phút). Như vậy, phương 
pháp phân tích đạt tính đặc hiệu. 
Độ ổn định hệ thống được thực hiện 
bằng cách tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn 
vào hệ thống UPLC, kết quả ở bảng 3. 
Bảng 3. Kết quả xác định độ ổn định hệ thống 
TT 
Thời gian 
lưu (phút) 
Diện tích peak 
(µAu.min) 
Hệ số đối 
xứng (T) 
1 2,345 206257 1,29 
2 2,367 202990 1,30 
3 2,347 202922 1,27 
4 2,365 208295 1,28 
5 2,353 209561 1,26 
6 2,342 203187 1,28 
XTB 2,354 205535 1,28 
RSD 0,5% 1,4% 1,1% 
Kết quả ở ảng 3 cho thấy, điều kiện 
sắc ký đạt độ ổn định hệ thống; RSD đối với 
thời gian lưu, diện tích đỉnh đều < 2%, hệ số 
đối xứng <1,5; 
3.3.2. Khoảng tuyến tính 
Pha các dung dịch chuẩn cefalexin có 
nồng độ x trong khoảng từ 4 µg/L- đến 60 
µg/L. Tiến hành phân tích sắc ký theo quy 
trình ở hình 1, thu được đường hồi quy tuyến 
tính ở hình 3. 
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ 
cefalexin 4,0 – 60,0 µg/L, giữa tín hiệu đo 
(y) và nồng độ (x) có tương quan tuyến tính 
tốt với R2 > 0,99. 
Tạp Chí Khoa Học Giáo Dục Kỹ Thuật Số 37 (09/2016) 
Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật TP. Hồ Chí Minh 
5 
Hình 3. Đường h i quy tuyến tính (phương trình đường chuẩn): 
y = 2825,3x với R2 = 0,9997. 
3.3.3. Độ lặp lại 
Để xác định độ lặp lại của phương 
pháp phân tích UPLC/UV-PAD, tiến hành 
phân tích lặp lại 6 lần (n = 6) trên mẫu thực 
tế (mẫu nước thải), xác định nồng độ 
cefalexin (C) theo công thức (1), rồi tính độ 
lệch chuẩn tương đối (RSD). Kết quả ở bảng 
4 cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt 
(RSD < ½RSD yêu cầu). 
Bảng 4. Kết quả xác định độ lặp lại của 
phương pháp phân tích 
TT C (µg/L) Thông số thống kê 
1 5,2 
CTB 
: 5,4 µg/L 
RSD: 7,0 % 
½RSD yêu cầu(a): 
17,5 % 
2 6,1 
3 5,5 
4 5,0 
5 5,3 
6 5,8 
(a) Độ lệch chuẩn tương đối tính theo hàm 
Horwitz, RSD= 2
1-0,5lgC 
với C là nồng độ 
chất phân tích được biểu diễn bằng phân 
số [9]. 
3.3.4. Độ đúng 
Độ đúng của phương pháp phân tích 
được đánh giá qua độ thu hồi (Recovery/Rev) 
khi phân tích mẫu thêm chuẩn; với C0 là nồng 
độ cefalexin trong mẫu nước thải; C1 là nồng 
độ cefalexin chuẩn thêm vào mẫu; C2 là nồng 
độ cefalexin xác định được trong mẫu đã thêm 
chuẩn. Kết quả xác định độ đúng của phương 
pháp phân tích cefalexin được nêu ở bảng 5 
Bảng 5. Kết quả xác định độ đúng của 
phương pháp phân tích cefalexin 
Thí 
nghiệm 
C0 
(µg/L) 
C1 
(µg/L) 
C2 
(µg/L) 
Rev 
(%) 
1 5,4 5,0 9,4 79,5 
2 5,4 5,0 9,9 89,4 
3 5,4 5,0 9,8 86,8 
Trung ình (n=3) 85,2 
Theo quy định số 2002/657/EC của Ủy 
 an Châu Âu (The European Commission) 
[10], khi phân tích những nồng độ trong mẫu 
cỡ 1 ppb – 10 ppb, nếu đạt được độ thu hồi từ 
70 – 110% là đạt yêu cầu. Như vậy, có thể 
cho rằng, phương pháp phân tích đạt được độ 
đúng cao khi phân tích cefalexin. 
6 
Tạp Chí Khoa Học Giáo Dục Kỹ Thuật Số 37 (09/2016) 
Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật TP. Hồ Chí Minh 
3.3.5. Giới hạn phát hiện (LOQ) và giới hạn 
đinh lượng (LOD) 
Xác định LOD theo quy tắc 3 và dựa 
vào hồi quy tuyến tính theo công thức (2); Từ 
đó xác định LOQ theo (3) 
LOD = (2) 
LOQ = (3) 
Trong đó, s độ lệch chuẩn của tín hiệu 
y trên đường hồi quy tuyến tính (còn được 
gọi là độ lệch chuẩn dư), a là hệ số góc của 
đường hồi quy tuyến tính ở hình 2. 
Từ (2) và (3), với s = 1151,1 và 
a = 2825,3, tính được LOD = 1,2 µg/L và 
LOQ= 4,0 µg/L. Với giới hạn phát hiện đó, 
phương pháp đủ nhạy để phân tích những 
lượng vết cefalexin trong nước thải. [11]. 
4. KẾT LUẬN 
Phương pháp UPLC đầu dò UV-PDA 
xây dựng được thích hợp cho định tính và 
định lượng cefalexin trong nước thải với thời 
gian phân tích nhanh, tiết kiệm dung môi. 
Chất lượng của phương pháp đã được đánh 
giá đạt yêu cầu về tính đặc hiệu, độ lặp lại, 
độ nhạy, tính tuyến tính và độ đúng. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1] Irena Branowska, Using HPLC Method with DAD Detection for the Simultaneous 
Determination of 15 Drugs in Surface Water and Wastewater, Polish Journal of 
Environmental Studies; Volume 20, Issue 1, Pages 21, 2011. 
[2] Dược Thư Quốc Gia, nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, 2012. 
[3] I. Arslan Alaton, Combined chemical and biological oxidation of penicillin formulation 
effluent, Journal of Environmental Management, Volume 73, Issue1, Pages 155–163, 2004. 
[4] Dược Điển Anh (BP2015), Volume 2, Pages 2015, 2015. 
[5] Dược Điển Mỹ (USP 36), Volume 1, Pages 2587, 2014. 
[6] M.I. Bailon-Perez, Determination of 10 beta-lactam antibiotics in environmental and 
food samples by capillary liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 
Volume 1216, Issue 47, Pages 8355–8361, 2009. 
[7] A. Gulkowska, Removal of antibiotics from wastewater by sewage treatment facilities in 
Hong Kong and Shenzhen, China, Water Research, Volume 42, Issues 1–2, January 2008. 
[8] J.C. Miller and J.N. Miller, Statistics for Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, 2nd 
Edition , 1998. 
[9] AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary 
Supplementsand otanicals, 2002. 
[10] Jared Anderson, Analytical Separation Science, Pages 1794, Wiley–VCH, December 2015. 
[11] Johan Bengtsson-Palme, Concentrations of antibiotics predicted to select for resistant 
bacteria: Proposed limits for environmental regulation, Environment International, 
Volume 86, Pages 140–149, 2016. 
Tác giả chịu trách nhiệm bài viết 
Nguyễn Huy Hoài 
Trường Đại học Khoa học Huế, Đại học Huế 
Email: [email protected] 
a
s3 
1 0 s
a