Ứng dụng phương pháp PRC kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt (droplet digital PRC) trong phân tích đột biến gen phục vụ điều trị đích ung thư

GIẢI PHẪU BỆNH 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
229 
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR KỸ THUẬT SỐ KẾT HỢP 
TẠO VI GIỌT (DROPLET DIGITAL PCR) TRONG PHÂN TÍCH 
ĐỘT BIẾN GEN PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ 
TRẦN LÊ SƠN1,2, PHẠM THỊ HỒNG ANH1, TRẦN THANH TRƯỜNG1, 
TRẦN VŨ UYÊN1, ĐẶNG MAI ANH TUẤN3, ĐINH NGUYỄN THIÊN KIM4, 
PHAN VĔN HIẾU3, GIANG HOA1,2, NGUYỄN HOÀI NGHĨA5 
TÓM TẮT 
Thuốc điều trị ung thư (UT) thuộc nhóm ức chế hoạt tính của enzyme tyrosine kinase (tyrosine kinase 
inhibitor, TKI) được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) phê duyệt cho điều trị UT phổi không tế 
bào nhỏ. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy các bệnh nhân UT mang những kiểu đột biến đặc trưng cho đáp ứng 
khác nhau với các thế hệ thuốc TKI khác nhau và sau một thời gian điều trị biểu hiện các đột biến kháng thuốc 
mới. Do đó, việc xác định các kiểu đột biến đặc trưng này rất quan trọng cho dự đoán và đề ra liệu pháp điều trị 
trúng đích hiệu quả, đồng thời theo dõi đáp ứng của bệnh nhân trong quá trình điều trị lâm sàng. Sinh thiết mô 
u hiện vẫn là phương pháp chuẩn vàng cho xác định các đột biến gen. Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất của phương 
pháp xâm lấn này là khó tiến hành lấy mẫu nhiều lần và trong nhiều trường hợp không thể thu nhận đủ mô u 
cho phân tích di truyền. Gần đây phương pháp sinh thiết lỏng dựa trên việc phát hiện các DNA ngoại bào được 
phóng thích từ tế bào ung thư (circulating tumor DNA, ctDNA) cho phép phân tích di truyền của khối u. Tuy 
nhiên do tỉ lệ DNA phóng thích bởi các tế bào UT so với DNA của các loại tế bào khác thường rất thấp nên cần 
một phương pháp có độ nhạy cao để có thể phát hiện các đột biến với tần suất thấp. Trong nghiên cứu này, 
chúng tôi xây dựng phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp với tạo vi giọt (digital droplet PCR, ddPCR) nhằm 
phân tích các đột biến liên quan đến điều trị đích UT phổi trên gen EGFR từ các mẫu sinh thiết lỏng (ctDNA). 
Phương pháp ddPCR được xây dựng có ngưỡng phát hiện đột biến ở tần suất 0.5-1% (nghĩa là 5-10 phân tử 
DNA ung thư trong 10.000 phân tử DNA bình thường). Qui trình ddPCR này được sử dụng để phát hiện đột 
biến trên các mẫu sinh thiết lỏng và mô u của 43 bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ. Phương pháp ddPCR 
cho kết quả tương đồng cao (87.5%) khi so sánh kết quả phân tích đột biến từ các mẫu sinh thiết lỏng và mô u 
tương ứng của cùng bệnh nhân. Như vậy, ddPCR là phương pháp có độ nhạy cao, đơn giản và dễ dàng triển 
khai hỗ trợ quá trình điều trị UT lâm sàng. 
ABSTRACT 
Detection of clinically actionable mutations in cancer liquid biopsies using droplet 
digital polymerase chain reaction (ddPCR) 
Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are a series of pharmaceutical drugs approved by the Food and Drug 
Administration (FDA) for treatment of many types of cancers including non-squamous cell lung cancer. Clinical 
studies showed that patients with somatic mutations in certain cancer driver genes exhibit strong correlation 
with therapeutic efficacy to different types of TKIs and tend to acquire new mutations rendering resistance to 
previous TKI therapies. Hence, the identification of such mutations is critically important for effective genotype-
directed therapies and assessment of patients’ responses in clinical practice. Tumor biopsy remains the gold 
standard for assessing genetic mutations in both lung and colorectal cancer. However, it is not always feasible 
to obtain sufficient tumor tissue or perform repeat biopsy in these patients. Recently, “liquid biopsy” which 
involves isolating cell free DNA released by cancer cells into the bloodstream (circulating tumor DNA, ctDNA) 
represents a noninvasive and potential technique for tumor genetic analysis. Due to the relatively low 
1
 Công ty giải pháp gene 
2
 Viện di truyền Y học 
3
 Trung tâm Pháp Y TP.HCM 
4
 Bệnh viện Đa khoa Tân Hưng 
5
 Đại học Y dược TP.HCM 
GIẢI PHẪU BỆNH 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
230 
abundance of ctDNA in the peripheral circulation, a highly sensitive genotyping assay is required to detect such 
low frequency mutations. In this study, we developed a novel digital droplet PCR (ddPCR) assays to identify 
clinically actionable mutations of a cancer driver gene, EGFR. The limit of detection of our assays was 0.5-1% 
(5-10 target mutation DNA molecules in 10.000 wild type DNA molecules). These assays were further applied 
to evaluate the sensitivity and specificity for detection of mutations in both plasma and matched formalin-
fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples of 43 non-small cell lung cancer patients. Our results 
suggested that ddPCR based mutation detection assays are highly accurate and accessible platforms for 
directing and assisting targeted cancer therapy in clinical practice. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Tyrosine kinase là nhóm enzyme đóng vai trò 
quan trọng trong các con đường tín hiệu kiểm soát 
chu trình phân bào và được chứng minh liên quan 
đến nhiều dạng ung thư[1]. Hiện nay, một nhóm gồm 
37 chất ức chế hoạt tính của các enzyme này 
(Tyrosine kinase inhibitor, TKI) được FDA chấp 
thuận cho sử dụng cho điều trị UT lâm sàng[2]. Tuy 
nhiên, hiệu quả điều trị của nhóm thuốc này được 
quyết định bởi kiểu đột biến đặc trưng mà bệnh nhân 
biểu hiện (Bảng 1). Chẳng hạn, nghiên cứu lâm sàng 
cho thấy bệnh nhân ung thư (UT) phổi không tế bào 
nhỏ (Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC) mang 
các đột biến thay thế amino acid thứ 858 (L858R) 
hay đột biến mất đoạn vùng exon19 (del19) trên gen 
mã hóa thụ thể tyrosine kinase EGFR cho đáp ứng 
tốt với nhóm TKI thế hệ I như Iressa (Gefitinib) và 
Tarceva (Erlotinib)[3]. Tuy nhiên, sau một thời gian 
điều trị (khoảng 1-2 nĕm), hầu hết các bệnh nhân 
này biểu hiện một đột biến kháng thuốc T790M cũng 
trên gen EGFR[4]. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy các 
trường hợp NSCLC mang đột biến T790M lại cho 
đáp ứng tốt với TKI thế hệ thứ ba như AZD9291 
(Osimertinib)[5]. Như vậy, việc xác định các đột biến 
của UT có ý nghĩa quan trọng giúp dự đoán đáp ứng 
với thuốc và đề ra phác đồ điều trị trúng đích thích 
hợp cho bệnh nhân. 
Bảng 1. Các kiểu đột biến khảo sát và tính đáp ứng với thuốc kháng UT 
Kí hiệu Kiểu đột biến 
Tính đáp ứng với thuốc 
TKI Thế Hệ I 
(erlotinib, gefitinib) 
TKI Thế Hệ II 
(afatinib, dacomitinib, neratinib) 
TKI Thế Hệ III 
(Osimertinib) 
del19 
Mất đoạn Nucleotide 
thuộc vùng exon 19, gen EGFR 
+ 
L858R 
Thay thế amino acid 
 tại codon 858, exon 21, gen EGFR 
+ + + 
T790M 
Thay thế amino acid 
 tại codon 790, exon 20, gen EGFR 
- + 
(+): tĕng đáp ứng với thuốc 
(-): giảm đáp ứng với thuốc 
Hiện nay sinh thiết mô u vẫn được xem là 
chuẩn vàng cho đánh giá di truyền nhưng phương 
pháp này mang tính xâm lấn và khó thực hiện thu 
mẫu nhiều lần để theo dõi quá trình điều trị[6]. Ngoài 
ra, kết quả phân tích di truyền tại một vị trí sinh thiết 
mô u xác định không phản ảnh được tính phức tạp 
và đa dạng của khối u, đặc biệt ở các trường hợp u 
di cĕn[6]. 
Gần đây, phương pháp sinh thiết lỏng thu nhận 
các đoạn DNA do các tế bào UT phóng thích vào 
máu (ctDNA) trong quá trình chết theo chương trình 
của tế bào (apoptosis) hoặc hoại tử (necrosis) là 
phương pháp không xâm lấn và được chứng minh 
có thể hỗ trợ phân tích di truyền khối u[7]. Tuy nhiên, 
để có thể phát hiện các đột biến trên ctDNA cần một 
phương pháp có độ nhạy cao vì hàm lượng ctDNA 
trong máu của bệnh nhân và tần suất của các đột 
biến thường rất thấp[8]. 
Nhiều phương pháp đã được phát triển để phát 
hiện các đột biến trên ctDNA như phương pháp 
khuyếch đại chịu nhiệt (amplification refractory 
mutation system, ARMS), giải trình tự thế hệ kế tiếp 
(next-generation sequencing, NGS) và PCR kỹ thuật 
số (digital PCR). Nhiều công bố gần đây cho thấy 2 
phương pháp ARMS và NGS chưa đạt độ nhạy tốt 
trong việc phát hiện các đột biến có tần suất thấp[5,9]. 
GIẢI PHẪU BỆNH 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
231 
Phương pháp PCR kỹ thuật số kết hợp tạo vi giọt 
(droplet digital PCR, ddPCR) được phát triển và 
thương mại hoá từ nĕm 2011[8]. Phương pháp này 
cho phép phân tách các phân tử DNA bản mẫu vào 
hàng chục nghìn giọt dầu và phản ứng PCR sẽ diễn 
ra độc lập trong từng giọt riêng lẻ này. Kết quả được 
xác định dựa trên tín hiệu phát huỳnh quang của 
mẫu dò (probe) sau khi phản ứng PCR kết thúc [10]. 
Nguyên lý này cho phép ddPCR định lượng tuyệt đối 
và chính xác đột biến có tần suất <1% trong khi 
phương pháp PCR định lượng truyền thống (qPCR) 
chỉ có thể phát hiện các đột biến có tần suất > 1%[10]. 
Ngoài ra, so với phương pháp giải trình tự thế hệ kế 
tiếp, ddPCR có thể phát hiện đột biến xác định với 
độ nhạy tốt hơn và có giá thành thấp hơn[10]. 
Trong nghiên cứu này chúng tôi xây dựng bộ 
phản ứng ddPCR để phát hiện các đột biến trên gen 
EGFR xuất hiện phổ biến nhất ở các trường hợp UT 
phổi và có liên quan tính đáp ứng của dạng UT này 
với nhóm thuốc điều trị UT được FDA công nhận. 
Phương pháp của chúng tôi đạt độ phát hiện các đột 
biến ở tần suất tối thiểu là 0.5-0.1% (nghĩa là 5-10 
phân tử DNA ung thư trong 1,000 phân tử DNA bình 
thường). Đồng thời, hiệu quả phát hiện đột biến của 
phương pháp này khi ưng dụng trên mẫu sinh thiết 
lỏng và sinh thiết mô u đạt độ tương đồng khá cao là 
87.5%. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Vật liệu 
Máu và sinh thiết mô u tương ứng của 43 bệnh 
nhân UT phổi tế bào không nhỏ (kí hiệu là LBL001-
LBL043) được thu nhận tại các bệnh viện Phạm 
Ngọc Thạch, Đại Học Y Dược và Thủ Đức. Các 
bệnh nhân này đều chưa qua điều trị và đồng ý tham 
gia nghiên cứu. Mẫu sinh thiết mô u sau khi cố định 
trong formalin và đúc trong nến paraffin (formalin-
fixed paraffin-embedded, FFPE) được xác định đặc 
điểm mô bệnh học và giai đoạn của UT. Trong một 
số trường hợp mẫu sinh thiết quả nhỏ không thể tiến 
hành tách DNA và phân tích di truyền. 
Máu ngoại biên (10ml) sẽ được thu nhận trong 
ống EDTA Vacutainer (Becton Dickinson) và giữ mát 
tại 4°C không quá 6 giờ trước khi tiến hành tách 
chiết DNA ngoại bào (cell free DNA, cfDNA). 
Phương pháp tách chiết DNA 
Từ mẫu máu: máu được ly tâm li tâm 2 đợt: 
2.000 g trong 10 phút và 16.000 g, 10 phút để tách 
huyết tương. Bộ kit MagMAX™ Cell-Free DNA 
Isolation Kit (Thermo Fisher) được sử dụng để tách 
cfDNA từ các mẫu huyết tương. 
Từ mẫu mô u FFPE: DNA bộ gen được tách 
chiết từ các mẫu mô u đã cố định sử dụng bộ kit 
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) theo 
hướng dẫn của nhà sản xuất. 
Phương pháp phân mảnh tạo DNA chứng dương 
Mẫu DNA chuẩn mang các đột biến khảo sát 
với tần suất đột biến (MAF) xác định được cung cấp 
bởi Horizon Discovery (Bảng 2). Các mẫu chuẩn 
mang đột biến này và mẫu không mang đột biến 
(WT) được phân mảnh ngẫu nhiên bằng bộ kit 
NEBNext® dsDNA Fragmentase® (New England 
BioLabs) nhằm tạo các đoạn DNA kích thước tương 
tự cfDNA (~160bp). DNA sau phân mảnh có kích 
thước từ 100bp- 450bp được chọn lọc bằng hạt từ 
Kapa Pure Beads (Roche). Sau đó, DNA chuẩn và 
DNA WT được định lượng bằng QuantiFluor® 
dsDNA System (Promega) và trộn với nhau để tạo 
các mẫu DNA chứng dương có tần suất biến xác 
định. Tổng lượng DNA đầu vào cũng được sử dụng 
tương tự như hàm lượng trung bình của DNA ngoại 
bào tách chiết từ các bệnh nhân ung thư: 1.6ng. 
Bảng 2. Mẫu chuẩn mang đột biến 
Genomic DNA chuẩn 
(Horizon Discovery) 
Gene Đột biến 
Tần 
suất đột 
biến (%) 
Structural Control EGFR 
Del19: ΔE746 
- A750 
5.3 
Tru- Q1 EGFR T790M 4.2 
Tru- Q2 EGFR L858R 4.2 
Phương pháp droplet digital PCR (ddPCR) 
Phương pháp ddPCR được thực hiện theo 
hướng dẫn của hãng Bio-rad gồm 4 giai đoạn 
chính[11]: 
Chuẩn bị mẫu: mỗi phản ứng PCR có tổng thể 
tích là 20l gồm các thành phần chính sau: DNA bản 
mẫu được định lượng bằng phương pháp bằng 
Quantus (Promega), 900nM mồi và 250nM mẫu dò, 
2X supermix (Bio-rad). Đối với DNA tách chiết từ 
mẫu FFPE, phản ứng PCR được bổ sung enzym cắt 
(2 units) giới hạn HindIII và UDG (Uracil DNA 
glycosylase) (2 units), ủ ở 370C trong 20 phút. Mồi 
và mẫu dò cho phản ứng phát hiện đột biến EGFR 
del19 được cung cấp bởi hãng Bio-rad. Với đột biến 
EGFR T790M và L858R, mồi và mẫu do được chúng 
tôi thiết kế. 
Tạo vi giọt: 20.000 vi giọt được tạo bởi hệ thống 
QX200 droplet genenator (Bio-rad) 
Phản ứng PCR: Vi giọt được chuyển lên đĩa 96 
giếng. Phản ứng PCR được tiến hành với chu trình 
nhiệt: 95°C trong 10 phút, 94°C trong 30 giây và 
GIẢI PHẪU BỆNH 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
232 
55°C trong 60 giây và lặp lại 40 chu kỳ, 98°C trong 
10 phút. 
Đọc và phân tích kết quả: Sau khi PCR, kết quả 
nhân bản trong vi giọt được đọc bởi hệ thống QX200 
Droplet reader (Bio-Rad) có thể đọc đồng thời 2 màu 
huỳnh quang khác nhau (FAM và VIC hoặc HEX). 
Dữ liệu ddPCR được phân tích bằng phần mềm 
phân tích QuantaSoft (Bio-Rad). 
KẾT QUẢ 
Kết quả xác định ngưỡng phát hiện đột biến 
(Limit of Detection, LOD) 
Các vị trí đột biến được lựa chọn trong nghiên 
cứu này là những đột biến xuất hiện phổ biến trên 
gen gây UT EGFR và có liên quan đến tính đáp ứng 
thuốc của tế bào UT. Để phát hiện các đột biến này, 
chúng tôi thiết kế 2 phản ứng multiplex PCR: (1) 1 
phản ứng duplex với 2 mẫu dò huỳnh quang khác 
nhau đặc hiệu cho 2 vị trí đột biến thay thế amino 
acid là T790M (FAM) và L858R (HEX); (2) 1 phản 
ứng duplex (Bio-rad) với mẫu dò huỳnh quang 
(FAM) phát hiện 15 kiểu đột biến mất đoạn trên vùng 
exon 19 (del19) và mẫu dò huỳnh quang (HEX) đặc 
hiệu cho trình tự không mang đột biến (WT). 
500
300
200
75
500
300
200
75
WT L L MT
Hình 1. Kết quả xử lý phân mảnh mẫu DNA 
không mang đột biến (WT) và mẫu chuẩn DNA 
mang đột biến (MT). L: thang DNA 
Trước tiên, chúng tôi tiến hành xác định 
ngưỡng phát hiện đột biến (LOD) của từng phản 
ứng PCR này. LOD là giá trị tần suất đột biến thấp 
nhất mà phương pháp ddPCR cho phép phân biệt 
mẫu mang đột biến (Mutant, MT) với mẫu không 
mang đột biến (wild type, WT). Thông số này cũng 
cho phép đánh giá hiệu quả hoạt động của mồi 
(primers), mẫu dò (probe) của từng phản ứng 
ddPCR. LOD được xác định dựa trên các mẫu 
chuẩn thương mại (Horizon) mang các đột biến khảo 
sát có tần suất xác định (Bảng 2). Các mẫu chuẩn 
này được tiến hành phân mảnh để tạo những đoạn 
DNA có kích thước tương tự ctDNA. Kết quả điện di 
(Hình 1) cho thấy sau khi xử lý phân mảnh, mẫu 
không mang đột biến (WT) và mẫu chuẩn mang đột 
biến (MT) xuất hiện vệt “smear” là những đoạn DNA 
bị đứt gãy, trong đó có những đoạn có kích thước 
khoảng 160 bp, tương tự như cfDNA. 
Sau khi thu hồi các đoạn có kích thước tương 
tự ctDNA, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu MT với 
mẫu WT để thu được các mẫu có phổ tần suất đột 
biến khác nhau. Các mẫu này được chạy cùng với 2 
mẫu chứng âm là mẫu chỉ có DNA WT (WT) và mẫu 
không có DNA bản mẫu (No template control, NTC). 
Chứng âm được sử dụng để kiểm soát khả nĕng 
ngoại nhiễm và tính đặc hiệu của mồi và mẫu dò của 
phản ứng ddPCR. Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh 
quang của hơn 10.000 vi giọt trong các mẫu chứng 
âm (WT và NTC) (Hình 2) đều không thấy xuất hiện 
vi giọt có tín hiệu huỳnh quang của mẫu dò đặc hiệu 
cho các trình tự đột biến. Ngược lại, tín hiệu huỳnh 
quang của mẫu dò đột biến xuất hiện ở các mẫu 
chuẩn mang đột biến khảo sát và có số lượng vi giọt 
dương tính giảm dần khi tần suất đột biến giảm. Kết 
quả này chứng tỏ mồi và mẫu dò sử dụng trong các 
phản ứng ddPCR đặc hiệu cho các vị trí đột biến 
khảo sát. Ở vị trí đột biến T790M, tần suất tối thiểu 
mà ddPCR vẫn phát hiện được vi giọt dương tính là 
1% (Hình 2a). Trong khi, phản ứng ddPCR phát hiện 
các vị trí đột biến còn lại gồm L858R (Hình 2b) và 
Del19 (Hình 2c) đạt tần suất tối thiểu là 0.5%. Như 
vậy, phản ứng ddPCR trong nghiên cứu này đạt 
LOD là 0.5-1%, nghĩa là có thể phát hiện được 5-10 
bản sao DNA mang các đột biến này trong tổng số 
1000 bản sao DNA phân tích. 
4% 1% 0.5% WT NTC
E
G
F
R
 T
7
9
0
M
A
m
p
li
tu
d
e
Event number
4% 1% 0.5% WT NTC
E
G
F
R
 L
8
5
8
R
A
m
p
li
tu
d
e
Event number
1% 0.5% 0.1% WT NTC
E
G
F
R
 D
e
l1
9
A
m
p
li
tu
d
e
Event number
a b
c
EGFR T790M EGFR L858R
EGFR Del19
Hình 2. Kết quả xác định LOD của phản ứng ddPCR 
đặc hiệu cho các vị trí đột biến trên gen EGFR 
Sau khi xử lý phân mảnh, mẫu DNA chuẩn 
mang các đột biến khảo sát gồm T790M (a), L858R 
(b) và del19 (c) trên gen EGFR được pha loãng với 
mẫu DNA không mang đột biến (WT) để đạt phổ tần 
suất đột biến là 4%, 1%, 0,5% và 0,1%. 1,6ng DNA 
của mỗi mẫu chuẩn này được sử dụng để xác định 
LOD. Mẫu chỉ DNA WT và mẫu không có DNA bản 
mẫu (NTC) được sử dụng làm chứng âm. Điểm bắt 
GIẢI PHẪU BỆNH 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
233 
đầu phát hiện tín hiệu huỳnh quang của mẫu dò đột 
biến (Threshold, đường màu hồng) được xác định 
bởi phần mềm QuantaSoft (Bio-Rad). LOD là tần 
suất đột biến thấp nhất mà phản ứng ddPCR có thể 
phát hiện được ít nhất 1 vi giọt mang tín hiệu huỳnh 
quang của mẫu dò đột biến. 
Kết quả ứng dụng ddPCR phát hiện đột biến gen 
EGFR của bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ 
Sau khi xác lập giá trị LOD của mỗi phản ứng 
ddPCR, chúng tôi ứng dụng phương pháp này để 
phân tích đột biến trên cfDNA thu từ mẫu sinh thiết 
lỏng của 43 bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ. 
Mẫu được kết luận là dương tính với đột biến khảo 
sát khi ddPCR xuất hiện vi giọt có tín hiệu huỳnh 
quang của mẫu dò đột biến và có tần suất đột biến 
(MAF, mutation allelic frequency) lớn hơn giá trị LOD 
đã xác định. Trong số 43 mẫu, chúng tôi phát hiện 7 
trường hợp (16.33%) mang một trong các đột biến 
khảo sát trên gen EGFR. Trong đó, 5 trường hợp 
mang đột biến L858R và 2 trường hợp mang đột 
biến del19 đều là các đột biến có đáp ứng tốt với TKI 
và không có trường hợp mang đột biến kháng thuốc 
T790M được phát hiện. 
Bảng 3. Kết quả phát hiện đột biến trên gen EGFR từ mẫu cfDNA và DNA mô u (FFPE) 
bằng phương pháp ddPCR 
MT: trình tự đột biến 
N/A: bệnh nhân không thu được mẫu DNA mô u 
GIẢI PHẪU BỆNH 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
234 
Ngoài ra, chúng tôi tiến hành thu nhận DNA từ 
các mẫu mô u được cố định trong paraffin (FFPE) 
của các bệnh nhận này và thực hiện ddPCR để so 
sánh với kết quả phát hiện đột biến trên mẫu sinh 
thiết lỏng. Tuy nhiên, do điều kiện bệnh lý của bệnh 
nhân nên trong một số trường hợp chúng tôi không 
thể thu đủ mẫu sinh thiết mô u cho phân tích di 
truyền. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành so sánh kết 
quả của 32 trường hợp có cả mẫu cfDNA và DNA 
mô u. 
Bảng 3 cho thấy ddPCR cho kết quả phát hiện 
đột biến gen EGFR có mức tương đồng khá cao là 
87.5% (28/32) giữa cfDNA thu từ máu và mẫu DNA 
thu nhận từ mô u tương ứng của cùng một bệnh 
nhân. Trong đó, đột biến L858R cùng được phát 
hiện trên cả cfDNA và DNA mô u của 2 bệnh nhân 
LBL015 và LBL017. Đặc biệt, mẫu LBL015 mang đột 
biến L858R ở tần suất khá cao trên cả cfDNA và 
DNA mô u lần lượt là 46.25% và 38.99%. Kết quả 
này cho thấy bệnh nhân này có thể mang đột biến 
L858R là dạng đột biến được di truyền (germline 
mutation). Trong 4 trường hợp có kết quả không 
tương quan (LBL021, LBL026, LBL030 và LBL033), 
ddPCR phát hiện được đột biến del19 trên DNA mô 
u nhưng cho kết quả âm tính trên mẫu cfDNA tương 
ứng cùng bệnh nhân. 
Tóm lại, bộ phản ứng ddPCR của chúng tôi xây 
dựng có thể xác định các kiểu đột biến trên gen 
EGFR có liên quan đến đáp ứng thuốc của bệnh 
nhân ung thư phổi từ nguồn mẫu sinh thiết lỏng của 
và đạt độ tương đồng cao (87.5%) khi so sánh với 
kết quả trên mẫu sinh thiết mô u. 
KẾT LUẬN VÀ BIỆN LUẬN 
Đột biến trên gen EGFR xuất hiện phổ biến ở 
các bệnh nhân UT phổi không tế bào nhỏ (35%) và 
liên quan đến tính đáp ứng của bệnh nhân này với 
các thuốc điều trị UT hiện được công nhận bởi 
FDA[2]. Hiện nay, việc xác định các đột biến này 
được tiến hành chủ yếu trên nguồn DNA thu nhận 
bằng phương pháp sinh thiết mô u. Phương pháp 
này mang tính xâm lấn nên không thể tiến hành lấy 
mẫu lặp lại để theo dõi đáp ứng của bệnh nhân 
trước và sau điều trị và trong nhiều trường hợp 
không đủ mẫu để phân tích di truyền [6]. Hơn nữa 
việc lấy mẫu sinh thiết tại một vị trí xác định có thể 
không phản ảnh được tính đa dạng và phức tạp của 
khối u[6]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển 
phương pháp ddPCR có độ nhạy phát hiện đột biến 
ở tần suất tối thiểu là 0.5% (ngoại trừ đột biến 
T790M được phát hiện ở LOD 1%). Hiện nay, bộ thử 
nghiệm thương mại Cobas (Roche) được FDA công 
nhận và cho lưu hành dựa trên nguyên lý của phản 
ứng PCR thông thường có thể phát hiện đột biến 
del19 và L858R ở LOD là 5%[6]. Như vậy, so với bộ 
kit này phương pháp ddPCR chúng tôi phát triển có 
độ nhạy hơn 10 lần. Đồng thời, trong nghiên cứu 
này, chúng tôi chứng minh phương pháp ddPCR có 
thể ứng dụng trong lâm sàng để phát hiện đột biến 
trên ctDNA từ các mẫu sinh thiết lỏng của bệnh nhân 
UT phổi với độ tương đồng cao (87.5%) khi so sánh 
với kết quả phát hiện đột biến trên mẫu DNA mô u. 
Các trường hợp cho kết quả không tương quan giữa 
ctDNA và DNA mô u có thể do 1) tế bào ung thư 
phóng thích ít ctDNA hoặc khối u ở vị trí mà DNA 
ngoại bào khó được phóng thích vào máu ngoại vị 
hoặc tỉ lệ ctDNA mang đột biến quá thấp dưới 
ngưỡng phát hiện của phương pháp 2) sinh thiết mô 
u tại vị trí không có các dòng tế bào UT mang đột 
biến. Những nghiên cứu lâm sàng với số lượng mẫu 
lớn trước đây (AURA và AURA3) cho thấy với 
những mẫu cfDNA có tần suất đột biến >1% thì 
phương pháp ddPCR có thể đạt độ nhạy phát hiện là 
97% và mức âm tính giả chấp nhận là 3%[12]. Vì vậy, 
Hiệp Hội Ung Thư Hoa Kỳ (ASCO) khuyến cáo nếu 
kết quả phát hiện các đột biến trên cfDNA là dương 
tính sẽ cho phép kết luận là bệnh nhân mang đột 
biến khảo sát. Tuy nhiên, do giới hạn về độ nhạy của 
phương pháp sử dụng nên trong những trường hợp 
kết quả âm tính trên cfDNA thi ASCO khuyến cáo 
cần phải tiến hành phân tích đột biến trên mẫu mô u 
để có thể đưa ra kết luận chính xác[12]. 
Tóm lại, với độ nhạy tốt và việc phân tích kết 
quả không quá phức tạp, ddPCR là phương pháp có 
thể triển khai phát hiện một số đột biến gen xác định 
nhằm hỗ trợ điều trị ung thư lâm sàng. Đặc biệt, 
phương pháp này có ý nghĩa lớn trong các trường 
hợp bệnh nhân ung thư đã di cĕn hoặc đã qua phẫu 
thuật mà sinh thiết mô u không thể thực hiện. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Schlessinger J. Cell signaling by receptor 
tyrosine kinases. Cell 2000; 103: 211-25. 
2. Bhullar KS, Lagaron NO, McGowan EM, Parmar 
I, Jha A, Hubbard BP, et al. Kinase-targeted 
cancer therapies: progress, challenges and 
future directions. Molecular cancer 2018; 17: 48. 
3. Douillard JY, Ostoros G, Cobo M, Ciuleanu T, 
McCormack R, Webster A, et al. First-line 
gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive 
NSCLC patients: a phase-IV, open-label, single-
arm study. British journal of cancer 2014; 110: 
55-62. 
4. Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, Sima CS, 
Zakowski MF, Pao W, et al. Analysis of tumor 
specimens at the time of acquired resistance to 
EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-
mutant lung cancers. Clinical cancer research: 
GIẢI PHẪU BỆNH 
TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 
235 
an official journal of the American Association for 
Cancer Research 2013; 19: 2240-7. 
5. Gu J, Zang W, Liu B, Li L, Huang L, Li S, et al. 
Evaluation of digital PCR for detecting low-level 
EGFR mutations in advanced lung 
adenocarcinoma patients: a cross-platform 
comparison study. Oncotarget 2017; 8: 67810-
20. 
6. Kim SS, Choi HJ, Kim JJ, Kim MS, Lee IS, Byun 
B, et al. Droplet digital PCR-based EGFR 
mutation detection with an internal quality control 
index to determine the quality of DNA. Scientific 
reports 2018; 8: 543. 
7. Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, 
Bardelli A. Liquid biopsy: monitoring cancer-
genetics in the blood. Nature reviews. Clinical 
oncology 2013; 10: 472-84. 
8. Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA, Belgrader 
P, Heredia NJ, Makarewicz AJ, et al. High-
throughput droplet digital PCR system for 
absolute quantitation of DNA copy number. 
Analytical chemistry 2011; 83: 8604-10. 
9. Feng WN, Gu WQ, Zhao N, Pan YM, Luo W, 
Zhang H, et al. Comparison of the SuperARMS 
and Droplet Digital PCR for Detecting EGFR 
Mutation in ctDNA From NSCLC Patients. 
Translational oncology 2018; 11: 542-5. 
10. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet 
Digital PCR versus qPCR for gene expression 
analysis with low abundant targets: from variable 
nonsense to publication quality data. Scientific 
reports 2017; 7: 2409. 
11. Bio-Rad Laboratories I. Rare Mutation Detection 
Best Practices Guidelines. 
12. Meador C, Hu Y, Yang JC-H, Mok T, Laus G, 
Hovey T, et al.