Ứng dụng pcr đặc hiệu methyl hóa phát hiện methyl hóa gen DAPK và RASSF1A trong mẫu máu bệnh nhân ung thư vòm mũi họng

ISSN: 1859-2171 TNU Journal of Science and Technology 194(01): 75 - 80 
 Email: jst@tnu.edu.vn 75 
ỨNG DỤNG PCR ĐẶC HIỆU METHYL HÓA PHÁT HIỆN 
METHYL HÓA GEN DAPK VÀ RASSF1A TRONG MẪU MÁU 
BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG 
Nguyễn Thị Hồng Gấm1*, Nguyễn Thị Hải Yến1, Nguyễn Văn Đô2, Nguyễn Thanh Bình2 
1Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên, 2Trường Đại học Y Hà Nội 
TÓM TẮT 
Methyl hóa gây ra sự giảm hoặc không biểu hiện các gen ức chế ung thư Rassf1A và DAPK được 
chỉ ra trong rất nhiều nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh ung thư vòm mũi họng. Tuy nhiên tại Việt 
Nam những nghiên cứu này còn chưa nhiều. Mặc dù tới 70% bệnh nhân ung thư này được phát 
hiện thì đã muộn và thời gian sống thêm rất ngắn. Nghiên cứu này tiến hành nhằm phát hiện tình 
trạng methyl hóa của các gen ức chế ung thư trong mẫu máu của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng 
góp phần xây dựng bộ công cụ để chẩn đoán sớm ung thư vòm mũi họng. Phương pháp nghiên 
cứu mô tả cắt ngang, chọn mẫu thuận tiện không xác suất với 9 bệnh nhân. Xây dựng kỹ thuật 
PCR đặc hiệu methyl hóa (MSP: Methylation-Specific Polymerase chain reaction) làm bộ công cụ 
phát hiện tình trạng methyl hóa: Gen RASSF1A đã tìm ra 100% (9/9) bị methyl hóa ở bệnh nhân 
ung thư vòm mũi họng. Gen DAPK chưa phát hiện tình trạng methyl hóa 100% (9/9) trong mẫu 
máu bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Cả gen RASSF1A và DAPK đều không tìm thấy methyl 
hóa trong mẫu máu người bình thường được chọn làm đối chứng. 
Từ khóa: MSP: Methylation-Specific Polymerase chain reaction; RASF1A: RAS association 
domain family member; DAPK: Death-associated protein kinase 
Ngày nhận bài: 21/11/2018; Ngày hoàn thiện: 28/11/2018; Ngày duyệt đăng: 31/01/2019 
APPLYCATION OF METHYLATED PCR TECHNIQUE TO DETECT 
METHYLATION OF RASSF1A DAPK GENE IN THE BLOOD SIMPLES OF 
NASOPHARYLGEAL CARCINOMA PATIENTS 
Nguyen Thi Hong Gam
1
, Nguyen Thi Hai Yen
1
, Nguyen Van Do
2
, Nguyen Thanh Binh
2
1University of Medicine and Pharmacy - TNU, 2Hanoi Medical University 
ABSTRACT 
Methylation that reduces or does not express the cancer gene Rassf1A and DAPK has been shown 
in numerous studies on lung cancer. However, in Vietnam the research on methylation of tumor 
surpress gene have not much yet. Although 70% of human cancer is detected now, the last time 
and the extra time is very short. This relerve process to methylation of the genes of the genes of 
the genes in the blood of the package of the nasopharylgeal carcinoma. Cross-sectional descriptive 
study, non-probability sampling with 9 nasopharyngeal carcinoma and 9 normal patient. 
Meththylation Specipic PCR as methylation state is released tool: RASSF1A gene found for 100% 
(9/9) is methylated. The DAPK gene does not detect 100% methylation (9/9) in blood samples of 
patients with nasopharyngeal carcinoma. Both RASSF1A gene and DAPK gene are not found 
methyl in the normal blood pattern selected as an argument. 
Key words: MSP: Methylation-Specific Polymerase chain reaction; RASF1A: RAS association 
domain family member ; DAPK: Death-associated protein kinase 
Received: 21/11/2018; Revised: 28/11/2018; Approved: 31/01/2019 
* Corresponding author: Email: gamhoabinh83@gmail.com
Nguyễn Thị Hồng Gấm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 75 - 80 
 Email: jst@tnu.edu.vn 76 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là ung thư 
thường gặp nhất vùng đầu cổ và mang tính 
khu vực. Ở Việt Nam, UTVMH là loại ung 
thư hàng đầu trong các ung thư vùng tai mũi 
họng và đứng hàng thứ 5 trong 10 loại ung 
thư phổ biến gặp ở nam giới [1]. 
Nguyên nhân tử vong chính là bệnh được phát 
hiện muộn khi đã giai đoạn III, IV và khối u 
đã di căn xa. Thời gian sống thêm sau 5 năm 
của bệnh nhân UTVMH giai đoạn III, IV là 
54,5% trong khi nếu phát hiện sớm giai đoạn 
I, II là 95%, [2]. Do đó, dấu ấn sinh học chi 
phí thấp, không xâm lấn để phát hiện sớm 
UTVMH có tầm quan trọng lớn trong thực 
hành lâm sàng. Nhiều gen ức chế ung thư 
được đã được chứng minh là thường xuyên bị 
methyl hóa và giảm hoặc không biểu hiện 
được tìm thấy ở bệnh nhân UTVMH bằng các 
kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau [3]. Gen 
Ras hiệp hội miền gia đình 1A: RASSF1A 
nằm ở vị trí nhiễm sắc thể 3p21.3, bình 
thường đóng vai trò là những gen ức chế ung 
thư nhưng khi bị methyl hóa một cách bất 
thường thì sẽ dẫn đến hình thành khối u, gen 
RASSF1A đã được nghiên cứu rộng rãi như 
một dấu ấn sinh học methyl hóa và gen ức chế 
ung thư ở UTVMH kể từ khi phát hiện ra nó 
trong ung thư phổi vào năm 2000 [4]. Gen 
DAPK: Ở vị trí nhiễm sắc thể 9q21.33 có 
chức năng tham gia điều hòa quá trình chết 
theo lập trình. Mất biểu hiện DAPK đã được 
chứng minh có sự liên quan với vùng 
promoter bị methyl hóa trong UTVMH [5]. 
Để tìm hiểu cơ chế tác động của quá trình 
methyl hóa tới biểu lộ gen ức chế ung thư 
trong ung thư vòm họng chúng tôi đã tiến 
hành nghiên cứu này với mục tiêu: Hoàn 
thiện quy trình kỹ thuật PCR đặc hiệu 
methyl hóa (Methylation Specifics PCR) để 
xác định sự methyl hóa gen RASSF1A và 
DAPK trong ung thư vòm mũi họng. 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
Đối tượng nghiên cứu 
- 09 mẫu máu bệnh nhân ung thư biểu mô 
vòm mũi họng thể không biệt hóa 
- 09 mẫu máu người không bị ung thư vòm 
mũi họng và bệnh ung thư khác. 
Tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ 
mẫu nghiên cứu 
Tiêu chuẩn lựa chọn 
- Nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô vòm mũi 
họng thể không biệt hóa: Được chẩn đoán xác 
định bằng giải phẫu bệnh mô sinh thiết tại 
khối u. 
- Nhóm người làm đối chứng: Là những người 
đến khám nội soi tai mũi họng được xác định 
không mắc bệnh ung thư vòm mũi họng bằng 
xét nghiệm giải phẫu bệnh mô sinh thiết. 
Tiêu chuẩn loại trừ: 
- Các trường hợp bị ung thư tế bào vảy, ung 
thư đầu mặt cổ khác như amidal, khoang 
miệng, lưỡi hoặc UTVMH ở giai đoạn IV đều 
bị loại ra khỏi đối tượng nghiên cứu. 
Dụng cụ và hóa chất 
Dụng cụ: 
- Các dụng cụ thông thường trong phòng thí 
nghiệm sinh học phân tử bao gồm: Kẹp lấy 
mẫu, eppendorf, đầu côn, pipet, đầu tip, cốc 
thủy tinh, Và máy móc: Vortex, máy ly 
tâm, bộ điện di DNA, tủ lạnh, tủ hút, máy 
quang phổ kế, máy luân nhiệt, máy chụp ảnh 
gel, lò vi sóng. 
Hóa chất: 
- Bộ hóa chất tách DNA: Qiagene DNA blood 
body fluit (Catologue number: 51304). 
- Bộ hóa chất xử lý bisulfite: Epitect fast 
bisulfite của Qiagene (Catologue number: 
59824). 
- Hóa chất dùng để PCR: Mastermix (2X), 
- Hóa chất điện di: Agarose 2 g, TBE 1X 100 
ml, Ethilium 1,7 µl 
Thu thập mẫu nghiên cứu 
- Đối tượng tham gia nghiên cứu được tiến 
hành lấy 3 – 5 ml máu ngoại vi chống đông 
của các đối tượng nghiên cứu, bảo quản nhiệt 
độ 2 - 8o trong thời gian không quá 3 h. Sau 
đó ly tâm tách huyết tương giữ lại khối huyết 
cầu, bảo quản huyết cầu ở điều kiện – 30oC. 
Nguyễn Thị Hồng Gấm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 75 - 80 
 Email: jst@tnu.edu.vn 77 
Xử lý mẫu nghiên cứu 
- Tiến hành tách DNA từ khối huyết cầu bằng 
bộ hóa chất 
- DNA thu được tinh sạch và đo OD kiểm tra 
chất lượng, bảo quản từ - 300c. 
- Tiến hành chuyển đổi methyl hóa DNA 
bằng cách sử dụng dung dịch Bisulfite từ bộ 
hóa chất 
- DNA thu được sau chuyển đổi được bảo 
quản - 200C. 
Thực hiện phản ứng PCR 
- Nguyên lý kỹ thuật MSP (Methylation-
specific PCR): 
MSP là một phương pháp phân tích mô hình 
methyl hóa ở vị trí giàu dinucleotide cytosine 
và guanin viết tắt là CpG (P: phosphodieste) 
dựa trên phản ứng PCR với mồi đặc hiệu để 
phát hiện vị trí bị methyl hóa. Để thực hiện 
mô hình này, DNA phải được tinh sạch và sửa 
đổi bằng cách sử dụng dung dịch sodium 
bisulfite, trong quá trình này chuyển đổi tất cả 
dư lượng cystosine thành methyl - cystosine, 
mục đích là gắn nhóm CH3 với vị trí cacbon 
số 5 của cytosin nằm ở vị trí hai nucleotid 
CpG. Đặc điểm của methyl cystosine là 
không bị chuyển đổi thành tyrosine trong 
phản ứng PCR [6]. 
Thành phần Thể tích 25 ( µl) 
Mastermix 10 
F+R (10 uM) 4 
MgCl₂ (25 mM) 2 
H₂O 8 
DNA 1 
- Mồi sử dụng được thết kế dựa theo trình tự 
tham khảo, đối với thí nghiệm MSP cặp mồi 
đặc hiệu methyl hóa cần đảm bảo phải có > 
50% C [7] 
- Thành phần phản ứng PCR 
- Chu kỳ nhiệt: 
Nhiệt độ Thời gian 
95⁰C 2' 
95⁰C 30s 
x 35 chu kỳ 
60⁰C 45s 
72⁰C 45s 
72⁰C 5' 
- Kết quả điện di 5 µl sản phẩm trên thạch 
agarose 2% x 100v/60 phút 
KẾT QUẢ 
Nhóm bệnh nhân ung thư vòm mũi họng 
Sản phẩm DNA 
Bảng 1. DNA sau khi chiết tách sau chuyển đổi 
bisulfite nhóm bệnh nhân 
STT Mã Nồng độ (ng/ul) OD (A260/280) 
1 B1 85,6 1,89 
2 B2 78,2 1,87 
3 B3 63,7 1,92 
4 B4 100,0 1,89 
5 B5 55,4 1,83 
6 B6 46,4 1,98 
7 B7 48,4 1,92 
8 B8 45,0 1,91 
10 B10 104,0 1,91 
Trung 
bình 
 69,63 
Nhận xét: Tại bảng 1 và 2, giá trị OD 260/280 
đạt trong khoảng 1,8-2,0 cho thấy DNA chiết 
tách từ mẫu máu nhóm bệnh trước và sau khi 
sửa đổi bisulfite đều đảm bảo độ tinh sạch và 
nồng độ tốt cho phản ứng PCR. Chỉ số OD 
260/280 của DNA từ mẫu máu nhóm chứng 
sau sửa đổi bisulfite mẫu mẫu chứng đạt từ 
1,7-1,8 cũng đạt yêu cầu cho phản ứng PCR. 
Bảng 2. DNA sau khi chuyển đổi bisulfite nhóm chứng 
STT Mã NC Nồng độ (ng/ul) A280/260 
1 CO1801 28,5 1,8 
2 CO1811 18 1,7 
3 CO1803 24 1,8 
4 CO1804 25 1,7 
5 CO1805 54,5 1,8 
6 CO1806 53 1,8 
7 CO1807 34 1,7 
8 CO1808 86,5 1,8 
9 CO1809 44 1,7 
Trung bình 40,83 
Nguyễn Thị Hồng Gấm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 75 - 80 
 Email: jst@tnu.edu.vn 78 
Hình ảnh sản phẩm phản ứng MSP 
- Tiến hành điện di 5 ul sản phẩm trên thạch agarose 2%, 100v, 60 phút, ladder 100 bp với chứng 
(+) là Actin. 
Hình 1. B1,6,5 DNA mẫu máu bệnh nhân UTVMH; 1805, 1806,1809 mẫu máu người bình thường 
Hình 2. B2, 3,4, DNA mẫu máu bệnh nhân UTVMH 1801, 1811,1803 mẫu máu người bình thường 
Hình 3. B7, 8,10 DNA mẫu máu bệnh nhân UTVMH 1804,1807, 1808 DNA mẫu máu người bình thường 
100bp 
100bp 
100bp 
100bp 
Nguyễn Thị Hồng Gấm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 75 - 80 
 Email: jst@tnu.edu.vn 79 
Nhận xét: Hình 1, 2, 3: Tất cả mẫu máu bệnh nhân UTVMH cho thấy Actin (+) chứng tỏ sản 
phẩm khuếch đại DNA máu rất tốt, gen RASSF1A, xác định bị methyl hóa, gen DAPK không 
xác định được methyl hóa. Ngược lại mẫu máu ở người không bị UTVMH chứng gen Actin (+) ở 
mẫu chứng 18011 với cặp mồi Actin có kích thước sản phẩm tương đương là 184 bp, còn 8 mẫu 
chứng khác đều có Actin (+) với cặp mồi tương ứng kích thước sản phẩm 89 bp, 9 mẫu chứng 
đều không xác định gen Rass và Dapk methyl hóa. 
Tổng hợp kết quả 
Bảng 4. Tình trạng methyl hóa nhóm gen nghiên cứu nhóm bệnh nhân UTVMH 
 Gen 
Nhóm 
MRASSF1A 
N=9 
MDAPK 
N= 9 
ACTIN 
N=9 
Bệnh nhân 
(+) 
9/9 
(100%) 
(-) 
9/9 
(100%) 
(+) 
9/9 
(100%) 
Bảng 5. Tình trạng methyl hóa nhóm gen nghiên cứu nhóm bệnh nhân không UTVMH 
 Gen 
Nhóm 
MRASSF1A 
N= 9 
MDAPK 
N=9 
ACTIN 
N= 9 
Bệnh nhân chứng 
(-) 
9/9 
(100%) 
(-) 
9/9 
(100%) 
(+) 
9/9 
(100%) 
Ghi chú : (+) xác định có methyl hóa, (-) không xác định methyl hóa 
- Nhận xét: Tại bảng 4: Gen actin (+) 100%, 
tỷ lệ methyl hóa RASSF1A, DAPK rất cao 
chiếm 9/9 (100%) mẫu máu bệnh nhân 
UTVMH. Tại bảng 5: Gen không phát hiện 
methyl hóa gen RASSF1A, gen DAPK không 
xác định được có sự methyl hóa trên toàn bộ 
9/9 chiếm 100% mẫu máu người đối chứng 
không bị UTVMH, tuy nhiên khi tiến hành 
phản ứng PCR DNA mẫu đối chứng với cặp 
mồi Actin ở hai kích thước khác nhau đều cho 
kết quả actin (+) ở 9/9 mẫu máu. 
BÀN LUẬN 
Mức độ methyl hóa của gen bất kỳ có thể 
được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật trên nhiều 
loại mẫu khác nhau. Kết quả phát hiện tần số 
methyl hóa phụ thuộc vào kỹ thuật dùng để 
đánh giá mức độ methyl hóa và nguồn mẫu sử 
dụng. Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện methyl hóa 
phát hiện cao nhất khi sử dụng kỹ thuật MSP 
[8]. Phương pháp MSP được sử dụng nhiều 
nhất để phát hiện methyl hóa với tỷ lệ 60%, 
MMSP 10%, RT- PCR 30% trong 10 nghiên 
cứu tương đương, [9], [10]. Trong khi đó so 
với một nghiên cứu tương tự với mẫu máu 
bệnh nhân UTVMH với n = 50 và n= 220 cho 
tỷ lệ phát hiện methyl hóa gen RASSF1A là 
88,6% và 72,7%. Trong nghiên cứu này của 
chúng tôi do khảo sát với cỡ mẫu n= 9 nên tỷ 
lệ phát hiện methyl hóa gen RASSF1A cao 
100%. Gen DAPK bị methyl hóa với tỷ lệ 
thấp hơn 23,3% với n =14 và 36,8 với n = 21 
[11]. Như vậy kết quả của chúng tôi có sự 
khác biệt này có thể do số mẫu nghiên cứu 
chưa đủ lớn. 
KẾT LUẬN 
Kỹ thuật MSP được ứng dụng thành công để 
xác định được tình trạng methyl hóa gen ức 
chế ung thư RASSF1A và DAPK gồm: 
- Tách chiết được DNA từ tế bào máu ngoại 
vi với nồng độ trung bình nhóm bệnh nhân 
UTVMH là 69,63 ng/ul và nhóm chứng là 
40,83 ng/ul. 
- Sản phẩm PCR sau điện di đạt 100% xác 
định tỷ lệ phát hiện methyl hóa gen RASS1A ở 
toàn bộ mẫu máu của bệnh nhân UTVMH 
được khảo sát. 
- Sản phẩm PCR sau điện di chưa phát hiện 
được tình trạng methyl hóa gen DAPK, cần 
khảo sát thêm về trình tự và nhiệt độ gắn mồi 
đặc hiệu methyl hóa để xác định sự methyl 
hóa của DAPK với nghiên cứu tiếp theo. 
Nguyễn Thị Hồng Gấm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 194(01): 75 - 80 
 Email: jst@tnu.edu.vn 80 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Trần Thị Hợp (1999), Ung thư vòm mũi họng, 
Nxb Y học, tr. 97-101. 
2. L. A. Torre, F. Bray, R. L. Siegel et al (2015), 
"Global cancer statistics 2012", CA Cancer J. 
Clin., 65 (2), pp. 87-108. 
3. I. Nawaz, K. Moumad, D. Martorelli et al 
(2015), "Detection of nasopharyngeal carcinoma 
in Morocco (North Africa) using a multiplex 
methylation-specific PCR biomarker assay", Clin. 
Epigenetics, 7, pp. 89. 
4. A. Fendri (2009), "Inactivation of RASSF1A, 
RARβ2 and DAP-kinase by promoter methylation 
correlates with lymph node metastasis in 
nasopharyngeal carcinoma", Cancer Biology & 
Therapy, 8 (5), pp. 444-445. 
5. A. M. Michie, A. M. McCaig, R. Nakagawa et 
al (2010), "Death-associated protein kinase 
(DAPK) and signal transduction: regulation in 
cancer", FEBS J., 277 (1), pp. 74-80. 
6. Q. Tao, Robertson, K. D., Manns, A., 
Hildesheim, A. and Ambinder R. F. (1998), "The 
Epstein-Barr virus major latent promoter Qp is 
constitutively active, hypomethylated, and 
methylation sensitive", J. Virol, 72 (9), pp. 75-83. 
7. Z. Zhang, D. Sun, S. H. Hutajulu et al (2012), 
"Development of a non-invasive method, 
multiplex methylation specific PCR (MMSP), for 
early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma", 
PLoS One, 7 (11), pp. e45908. 
8. X. Yang, W. Dai, D. L. Kwong et al (2015), 
"Epigenetic markers for noninvasive early 
detection of nasopharyngeal carcinoma by 
methylation-sensitive high resolution melting", 
Int. J. Cancer, 136 (4), pp. E127-135. 
9. H. W. Chang, A. Chan, D. L. Kwong et al 
(2003), "Evaluation of hypermethylated tumor 
suppressor genes as tumor markers in mouth and 
throat rinsing fluid, nasopharyngeal swab and 
peripheral blood of nasopharygeal carcinoma 
patient", Int. J. Cancer, 105 (6), pp. 851-855. 
10. J. Zhang, Z. Shen, H. Liu et al (2018), 
"Diagnostic potential of methylated DAPK in 
brushing samples of nasopharyngeal carcinoma", 
Cancer Manag. Res., 10, pp. 2953-2964. 
11. M. Ye, T. Huang, C. Ni et al (2017), 
"Diagnostic Capacity of RASSF1A Promoter 
Methylation as a Biomarker in Tissue, Brushing, 
and Blood Samples of Nasopharyngeal 
Carcinoma", EBioMedicine, 18, pp. 32-40.