Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình gen NAT2 ở bệnh nhân lao Việt Nam

VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
96 
Original Article 
Establishing the Genotyping Method for NAT2 Polymorphism 
in Vietnamese Tuberculoma Patients 
Pham Thi Hong Nhung1,*, Kieu Hong Nhung1, Nguyen Thi Thu Ha2, 
Dinh Doan Long1, Vu Thi Thom1, Le Thi Luyen1 
1VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam 
2National Hospital of Tropical Diseases, 78 Giai Phong, Dong Da, Hanoi, Vietnam 
Received 14 March 2019 
Revised 08 May 2019; Accepted 21 June 2019 
Abstract: The metabolism of Isoniazid, one of the first-line antituberculosis drugs for TB 
treatment and prophylaxis, depends on the acetyltransferase 2 acetylation (NAT2) phenotype. 
Different phenotypes of NAT2 will lead to differences in drug concentration and the risk of 
uncontrolled side effects, such as hepatitis, peripheral neuropathy, gastrointestinal disorders 
(nausea, vomiting, and stomach pain). These risks are related to the presence of mutant NAT2 
alleles such as NAT2*5 (c.341T> C), *6 (c.590G> A) and *7 (c.857G> A), that reduce the N- 
acetyltransferase activity. Therefore, the genotyping method for NAT2 polymorphism using RFLP 
and Sanger sequencing was established. The method was successfully applied to determine the 
polymorphism of 84 TB patients. This study provides a better tool for analyzing NAT2 gene to 
assist clinicians in treating isoniazid. 
Keywords: Enzyme NAT2, isoniazid, single nucleotide polymorphism, RFLP, Sanger sequencing. 
________ 
 Corresponding author. 
 Email address: nhungpham_smp@vnu.edu.vn 
 https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4137 
VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
 97 
Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình gen NAT2 
ở bệnh nhân lao Việt Nam 
Phạm Thị Hồng Nhung1,*, Kiều Hồng Nhung1, Nguyễn Thị Thu Hà2, 
Đinh Đoàn Long1, Vũ Thị Thơm1, Lê Thị Luyến1 
1Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam 
2Bệnh viện Nhiệt Đới Trung Ương, 78 Giải Phóng, Đống Đa, Hà Nội, Việt Nam 
Nhận ngày 14 tháng 3 năm 2019 
Chỉnh sửa ngày 08tháng 5 năm 2019; Chấp nhận đăng ngày 21 tháng 6 năm 2019 
Tóm tắt: Isoniazid là một trong các thuốc chống lao hàng một trong điều trị và dự phòng lao, sự 
chuyển hóa của thuốc này phụ thuộc vào kiểu hình acetyl hóa của enzym N-acetyltransferase 2. 
Kiểu hình chuyển hóa isoniazid khác nhau sẽ dẫn đến khác biệt về nồng độ thuốc và nguy cơ tác 
dụng không mong muốn (viêm gan, bệnh lý thần kinh ngoại vi, tác dụng phụ trên đường tiêu hóa 
như buồn nôn, nôn, đau dạ dày). Sự khác biệt về kiểu hình chuyển hóa isoniazid có liên quan đến 
sự xuất hiện của các alen đột biến thuộc gen NAT2 làm giảm hoạt tính acetyl hóa của enzym N-
acetyltransferase 2 như NAT2 *5 (c.341T > C), *6 (c.590G > A) và *7 (c.857G > A). Chính vì vậy, 
chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình phân tích gen NAT2 trên bệnh nhân lao sử dụng phương 
pháp RFLP và giải trình tự gen. Quy trình phân tích gen đã được áp dụng thành công để xác định 
đa hình gen NAT2 ở 84 bệnh nhân lao. Kết quả của nghiên cứu này sẽ cung cấp thêm công cụ hỗ 
trợ các bác sĩ trong y học cá thể hóa với điều trị isoniazid. 
Từ khóa: Enzym NAT2, isoniazid, đa hình đơn nucleotit, RFLP, giải trình tự. 
1. Đặt vấn đề 
Theo Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới 
vàChương trình Chống lao Quốc gia, các thuốc 
chống lao hàng 1 gồm có isoniazid, rifampicin, 
ethambutol, pyrazinamid, streptomycin. Trong 
đó, isoniazid (viết tắt là INH) đóng vai trò then 
________ 
 Tác giả liên hệ. 
 Địa chỉ email: nhungpham_smp@vnu.edu.vn 
 https://doi.org/10.25073/2588-1132/vnumps.4137 
chốt và được sử dụng rộng rãi trong điều trị và 
dự phòng lao [1]. Isoniazid ở dạng tự do (chiếm 
40%) có tác dụng ức chế sự tổng hợp acid 
mycolic của vi khuẩn lao. Thuốc được chuyển 
hóa chủ yếu bằng con đường acetyl hóa nhờ 
enzym N-acetyltransferase 2 (viết tắt là NAT2) 
có trong gan và ống tiêu hóa. Sự chuyển hóa 
này có thể tạo nhiều sản phẩm gây độc cho gan 
như hydrazine, acetyldiazen Tốc độ acetyl 
hóa của enzym NAT2 thay đổi ở mỗi người và 
được chia làm 3 dạng kiểu hình là acetyl hóa 
P.T.H. Nhung et al. / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
98 
chậm, acetyl hóa trung gian và acetyl hóa nhanh 
[2-3]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, 
bệnh nhân mang kiểu hình acetyl hóa chậm có 
nồng độ INH trong huyết tương cao hơn 2 kiểu 
hình còn lại, làm tăng tỉ lệ tổn thương gan [4]. 
Mặt khác một số nghiên cứu cũng cho thấy kiểu 
hình acetyl hóa INH khác nhau cũng ảnh hưởng 
đến dược động học của INH trong huyết tương. 
Nghiên cứu trên 224 bệnh nhân điều trị lao 
bằng isoniazid đã chứng minh những bệnh nhân 
có kiểu hình acetyl hóa chậm gây độc cho gan 
nhiều hơn bệnh nhân có kiểu hình acetyl hóa 
nhanh (26,4 % so với 11,1 %) [5]. Ngoài ra, các 
tác dụng không mong muốn cũng gia tăng do 
giảm tốc độ thanh thải khi điều trị đơn lẻ hoặc 
khi phối hợp giữa isoniazid và rifampicin trên 
bệnh nhân lao có kiểu hình acetyl hóa chậm [6]. 
Hoạt tính enzym NAT2 thấp làm xuất hiện tổn 
thương đa dây thần kinh khi điều trị bằng 
isoniazid không phối hợp với pyridoxal [3]. 
Như vậy, nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra 
hiệu quả điều trị khác biệt giữa các dạng kiểu 
hình của enzym NAT2, bệnh nhân mang kiểu 
hình acetyl hóa chậm có nguy cơ thất bại cao 
hơn các nhóm khác [7-8]. 
Trong các alen gây ra kiểu hình acetyl hóa 
chậm, các alen NAT2*5, *6, *7 phổ biến và 
được tập trung nghiên cứu nhiều nhất [9]. Alen 
NAT2*5 (c.341T > C) và NAT2*7 (c.857G 
>A)gây ra sự thay đổi cấu hình protein, qua đó 
gây giảm hoạt tính enzym. Alen 
NAT2*6 (c.590G>A) làm giảm độ bền của 
enzym NAT2 [2]. 
Năm 1973, một báo cáo của tổ chức Y tế 
Thế giới đã nhấn mạnh tầm quan trọng của việc 
xác định kiểu hình acetyl hóa của bệnh nhân 
mắc lao trong tiên lượng đáp ứng điều trị với 
isoniazid [10]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu cũng 
như ứng dụng quy trình phân tích kiểu gen 
NAT2 vào thực hành lâm sàng ở Việt Nam vẫn 
chưa được quan tâm đúng mức. Chính vì vậy, 
chúng tôi tiến hành quy trình phân tích gen 
NAT2 sử dụng phương pháp phân tíchđa hình 
độ dài đoạn cắt giới hạn (restriction fragment 
length polymorphism, viết tắt RFLP) và giải 
trình tự. Đây là hai phương pháp xác định các 
đột biến điểm được sử dụng phổ biến và dễ 
dàng ứng dụng tại các cơ sở phân tích gen, 
khám chữa bệnh của Việt Nam hiện nay.Mục 
tiêu của của nghiên cứu này là: (1)Tối ưu hóa 
quy trình xác định các đa hình NAT2*5, *6 và 
*7 trên mẫu máu bệnh nhân mắc lao tại Việt 
Nam, (2) Áp dụng quy trình để xác định kiểu 
gen của một số bệnh nhân lao. 
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 
Nghiên cứu được tiến hành theo phương 
pháp mô tả cắt ngang, sử dụng phương pháp 
chọn mẫu thuận tiện. Đối tượng nghiên cứu là 
84 bệnh nhân mắc lao tại Bệnh viện Phổi Trung 
ương, Bệnh viện Phổi Hà Nội, Bệnh viện 74 
Trung. Nghiên cứu tuân thủ theo quy định và 
được thông qua bởi Hội đồng đạo đức của Khoa 
Y Dược, ĐHQG Hà Nội. Các thí nghiệm được 
thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Y 
dược học Cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc 
gia Hà Nội. 
Thu thập và bảo quản mẫu máu: Mẫu máu 
toàn phần lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân được 
bảo quản trong ống chuyên dụng chống đông 
bằng EDTA, lưu ở -20oC cho đến khi sử dụng. 
Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng số 
được tách chiết từ 84 mẫu máu bằng E.Z.N.A 
Blood DNA mini kit (Omega-Biotek). Kết quả 
thu được được đánh giá chất lượng thông qua 
điện di trên gel agarose 1,2 %, sử dụng thang 
chuẩn DNA λ/HindIII ladder và đo quang phổ 
hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. 
Nhân dòng gen đoạn gen NAT2 bằng 
PCR: Cặp mồi 5'-GGA ACA AAT TGG ACT 
TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT 
GC-3' đã sử dụng trong một số nghiên cứu 
trước đây [11] được đặt tổng hợp hóa học ở 
công ty PHUSA Biochem (Việt Nam). Để có 
quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, chúng 
tôi tiến hành tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ 
ADN khuôn tham gia phản ứng sử dụng 
Kapa2G Robust Hotstart ADN polymerase 
(Technismax). Chu trình nhiệt gồm 3 giai đoạn: 
biến tính 95 ˚C trong 3 phút; 35 chu kì: 95 ˚C 
P.T.H. Nhung et al. /VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
99 
trong 10 giây, gắn mồi trong 15 giây, 72 ˚C 
trong 60 giây; thời gian kéo dài cuối 72 ˚C 
trong 10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra 
trên gel agarose 1,5 %. Những sản phẩm nhân 
dòng thành công được tinh sạch bằng 
E.Z.N.A.® CyclePure Kit (Omega-biotek) 
trước khi tiến hành phân tích gen. 
Xác định kiểu gen NAT2 bằng RFLP: Sản 
phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ được pha 
loãng về nồng độ 100 ng/µl dùng cho phản ứng 
cắt. Các enzym cắt giới hạn loại FastDigest 
mua từ hãng Thermo Scientific. Alen NAT2*5 
không có vị trí nhận biết của enzym cắt, tuy 
nhiên lại liên kết chặt chẽ với c.481C > T có vị 
trí nhận biết của KpnI. Chính vì vậy, chúng tôi 
xác định kiểu gen NAT2*5 thông qua kiểu gen 
của c.481C > T. Alen NAT2 *6, *7 được xác 
định thông qua phản ứng cắt với các enzym lần 
lượt là TaqI, BamHI. Mỗi phản ứng cắt có tổng 
thể tích 10 µl bao gồm 3,5 µl ADN, 1 µl 10X 
enzym Buffer, 1 µl FastDigest enzym và 4,5µl 
nước khử ion. Thời gian ủ chung cho các 
enzym cắt là 5 phút ở 37 ˚C, bất hoạt enzym 
trong 5 phút ở 80 ˚C. Sản phẩm cắt NAT2*5 và 
*7 được điện di trên gel agarose 2 %. Sản phẩm 
cắt NAT2*6 điện di trên gel acrylamide 10 %, 
hiện hình bằng phương pháp nhuộm bạc. 
Xác định kiểu gen bằng giải trình tự. Sản 
phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ gửi đến hãng 
First base (Malaysia) để giải trình tự. Kết quả 
gửi về sẽ được phân tích trên phần mềm 
BioEdit version 7.1.9, qua đó xác định kiểu gen 
của bệnh nhân. 
3. Kết quả 
Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số 
được tách chiết thành công với một băng DNA 
rõ nét, cho thấy DNA thu được ít bị đứt gãy. 
Chất lượng DNA từ các mẫu khác nhau tương 
đối đồng đều và ổn định, thể hiện qua các băng 
điện di có độ sáng cao. Kết quả đo quang phổ 
hấp thụ cho chỉ số OD260/280 dao động trong 
khoảng từ 1,6 đến 2,0. Kết quả này cho thấy 
DNA đảm bảo độ tinh sạch và đủ điều kiện để 
tiến hành phản ứng nhân dòng tiếp theo. 
Hình 1. Kết quả DNA tổng số tách chiết điện di trên 
gel agarose 1,2%.LànM1: thang chuẩn DNA 
λ/HindIII; Làn 1 – 12: sản phẩm DNA tổng số của 
12 mẫu nghiên cứu. 
Hình 2. Kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng gen 
NAT2 trên gel agarose 1,5%.(A) Kết quả tối ưu nhiệt 
độ gắn mồi DNA; (B) Kết quả tối ưu nồng độ; (C) 
Kết quả nhân dòng gen NAT2 10 của mẫu nghiên 
cứu theo điều kiện tối ưu. Làn M: O Gene Ruler 
Ladder DNA marker, Làn (-): đối chứng âm. 
Nhân dòng gen đoạn gen NAT2 bằng 
PCR: Chúng tôi tiến hành PCR trên 10 nhiệt độ 
khác nhau trong dải nhiệt từ 51,1 oC đến 
59,9 oC. Nồng độ DNA nhân dòng tối ưu được 
xác định từ dải nồng độ của mẫu lần lượt là 25, 
50, 100, 150, 200 và 250 ng/µl. Kết quả điện di 
trên Hình 2A cho thấy tại nhiệt độ gắn mồi 
58oC cho băng sáng nhất nên được chọn là nhiệt 
độ gắn mồi cho các phản ứng tiếp theo. Kết quả 
điện di trên Hình 2B cho thấy PCR thành công 
P.T.H. Nhung et al. / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
100 
với nồng độ DNA tổng số từ 150-250 ng/µl, tuy 
nhiên nồng độ DNA khuôn tối ưu nhất là 200 
ng/µl. Dựa vào kích thước của marker, chúng 
tôi nhận thấy đã nhân dòng thành công 33 mẫu 
bệnh phẩm trong nghiên cứu với kích thước phù 
hợp với kích thước tính toán lý thuyết ban đầu 
là 1093 bp. Hình 2C là ảnh điện di sản phẩm 
nhân dòng gen NAT2 của một số bệnh nhân lao. 
Tất cả các thí nghiệm đều có đối chứng âm đảm 
bảo mẫu nghiên cứu không bị ngoại nhiễm. 
Xác định kiểu gen NAT2 bằng RFLP. 
Xác định kiểu gen NAT2*5 bằng KpnI: 
KpnI cắt alen kiểu dại 481C thành 2 băng có 
kích thước 659 bp và 434 bp và không cắt đối 
với alen đột biến 481T. Chính vì vậy, kiểu gen 
đồng hợp tử kiểu dại CC sẽ cho hai băng với 
kích thước là 659 bp và 434 bp; kiểu gen dị hợp 
tử CT cho ba băng có kích thước lần lượt là 
1093, 659 và 434 bp; kiểu gen đồng hợp tử đột 
biến TT không bị cắt cho một băng với kích 
thước 1093 bp. Từ kết quả nghiên cứu về alen 
481C, chúng tôi xác định alen NAT2*5 bởi vì 
khi xảy ra đột biến 481T thì đồng thời cũng xảy 
ra đột biến thay 341C và ngược lại (Hình 3A). 
Xác định kiểu gen NAT2*6 bằng TaqI: TaqI 
có 3 vị trí nhận biết của alen kiểu dại G và chỉ 
có 2 vị trí nhận biết của alen đột biến A. Chính 
vì vậy, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG sau 
khi cắt bằng enzym giới hạn sẽ cho 4 băng điện 
di với kích thước 316, 226, 170 và 381 bp. Kiểu 
gen dị hợp tử GA cho 5 băng điện di với kích 
thước 396, 381, 316, 226 và 170 bp. Kiểu gen 
đồng hợp tử đột biến AA sẽ cho 3 băng điện di 
với kích thước 396, 381 và 316 bp (Hình 3B). 
Xác định kiểu gen NAT2*7 bằng BamHI: 
BamHI cắt alen kiểu dại G thành 2 băng có kích 
thước 810 bp và 283 bp và không cắt đối với 
alen đột biến A. Chính vì vậy,kiểu gen đồng 
hợp tử kiểu dại GG sẽ cho 2 băng với kích 
thước 810 bp và 283 bp, kiểu gen dị hợp GA 
cho 3 băng với kích thước 1093, 810 và 283 bp. 
Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA không bị cắt 
cho 1 băng duy nhất với kích thước 1093 bp 
(Hình 3A). 
Hình 3. Phân tích kiểu gen NAT2 dựa vào RFLP (A, B) và giải trình tự (C). (A) Các kiểu gen NAT2*5, *7 
điện di trên gel agarose 2%. (B) Kiểu gen NAT2*6 điện di trên gel acrylamide 10%. Làn M: 100 bp DNA 
marker. Làn M2: Lonza DNA marker. 
P.T.H. Nhung et al. /VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
101 
Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình 
tự: Giải trình tựlà tiêu chuẩn vàng để xác định 
các đột biến điểm. Trên phần mềm BioEdi 
verson 7.1.9, mỗi loại nucleotit được thể hiện 
bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh 
lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, 
T: màu đỏ). Hình 3Clà kết quả giải trình tự thu 
được sau khi phân tích 33 bệnh nhân. Tiến hành 
phân tích kiểu gen bằng RFLP và giải trình tự 
cho kết quả khớp nhau 100% cho thấy độ chính 
xác cao của 2 phương pháp. Như vậy, cả hai 
phương pháp này đều có thể dùng để phân tích 
gen NAT2 một cách độc lập. 
84 bệnh nhân lao đều xác định được kiểu 
gen NAT2 thành công với quy trình phân tích 
được xây dựng và tối ưu. Với NAT2*5, có 78 
bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại TT, 
10 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử TC và 1 
bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử đột biến 
CC. Với NAT2*6, có 41 bệnh nhân có kiểu gen 
đồng hợp tử kiểu dại GG, 31 bệnh nhân có kiểu 
gen dị hợp tử GA và 12 bệnh nhân có kiểu gen 
đồng hợp tử đột biến AA. Với NAT2*7, có 66 
bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, 
16 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử GA và 2 bệnh 
nhân có kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA. 
4. Bàn luận 
Trên thế giới hiện nay có nhiều phương 
pháp phân tích SNP được sử dụng như sử dụng 
đầu dò DNA (DNA probe), phân tích đahình 
cấu tạo sợi đơn (single strand conformational 
polymorphism), giải trình tự, phân tíchđa hình 
độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP), sắc kí lỏng 
cao áp biến tính (Denaturing high performance 
liquid chromatography), phân tíchDNA bằng vi 
dãy (DNA microarray), Với gen NAT2 hầu 
hết các nghiên cứu sử dụng hai phương pháp là 
giải trình tự và RFLP. RFLP có ưu điểm là kỹ 
thuật thao tác đơn giản, cho kết quả nhanh, có 
độ tin cậy cao vàchỉ yêu cầu các thiết bị nghiên 
cứu cơ bản cho phân tích gen như máy PCR và 
hệ thống điện di nên nhiều cơ sở có thể áp 
dụng.Để phân tích 3 SNP đã nêu của NAT2, 
hiện nay giá thành của RFLP rẻ bằng 1/3 so với 
giải trình tự, phân tích và trả kết quả 6 tiếng 
(bằng thời gian nếu tự giải trình tự). Tuy nhiên 
để hạ chi phígiải trình tự Sanger, các cơ sở 
thường phải gom tối thiểu 8 phản ứng cho mỗi 
lần chạy. Nếu gửi giải trình tự tại cơ sở khác, 
thời gian phân tích sẽ dài hơn do mất thêm thời 
gian chuyển mẫu. Tuy nhiên, RFLP chỉ phân 
tích được 1 đột biến trên gen NAT2với mỗi loại 
enzym cắt. Đối với phương pháp giải trình tự, 
hiện nay giá thành mẫu phân tích ngày càng 
giảm, số lượng các cơ sở có máy giải trình tự 
trong nước ngày càng nhiều. Vì vậy, tại các cơ 
sở y tế nghiên cứu không có hệ thống giải trình 
tự vẫn có thể tiến hành gửi mẫu sang cơ sở khác 
đọc. Ưu điểm chính của giải trình tự là cung 
cấp đầy đủ thông tin về các điểm đột biến có 
trong phân đoạn gen được khuếch đại, vì vậy 
rất phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác định 
rõ được đa hình liên quan đến bệnh lý quan 
tâm. Trong nghiên cứu này, cặp mồi sử dụng 
cho phép nhân dòng toàn bộ vùng gen mã hóa 
cho enzym NAT2, vì vậy ngoài alen *5, *6, *7 
thì các alen khác cũng được xác định. Như vậy, 
khi áp dụng vào thực hành lâm sàng, đối với 
các bệnh nhân yêu cầu gửi kết quả sớm, phương 
pháp RFLP thể hiện rõ ưu điểm về thời gian. 
Còn với các nghiên cứu xác định mối liên quan 
giữa các đột biến trên gen NAT2 với một bệnh 
lý nào nó, giải trình tự là lựa chọn để cung cấp 
tối đa các thông tin di truyền trên gen NAT2 của 
bệnh nhân. 
Kết quả nghiên cứu trên 84 bệnh nhân cho 
thấy quy trình phân tích kiểu gen NAT2 của 
chúng tôi đảm bảo tính chính xác, độ lặp lại và 
ổn định. Việc nhân dòng gen NAT2 có kích 
thước dài hơn 1 kb thường gây khó khăn trong 
quá trình khuếch đại gen. Bên cạnh đó, bệnh 
nhân lao thường phải điều trị phối hợp nhiều 
thuốc, các thuốc có thể tồn lưu trong mẫu DNA 
thu được và ức chế PCR. Chính vì vậy, chúng 
tôi lựa chọn Kapa2GTM Robust Hotstart Ready 
Mixvới ưu điểmlà khả năng khuếch đại gen dù 
có hiện diện của một số chất ức chế PCR hoặc 
với các mẫu DNA có độ tinh sạch thấp. Ngoài 
hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase, Kapa2G còn 
P.T.H. Nhung et al. / VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
102 
có hoạt tính 5’-3’ exonuclease cho phép tăng độ 
chính xác trong quá trình khuếch đại gen. Ngoài 
ra, dòng sản phẩm này giúp giảm 20% -50% 
thời gian thao tác so với các dòng enzym 
polymerase khác.Ngoài enzym Kapa2G, 
HotStartTaq DNA polymerase của hãng 
QIAGEN cũng được chúng tôi thử nghiệm và 
cho thấy kết quả nhân dòng với hiệu suất và độ 
đặc hiệu cao hơn hẳn các dòng enzym như Pfu 
polymerase. 
Các biến thể di truyền NAT2 đóng vai trò 
quan trọng trong khả năng acetyl hóa của gan, 
có thể tác động đến chuyển hóa thuốc và tính 
nhạy cảm với một số bệnh nhất định.Tốc độ 
acetyl hóa là không đổi ở một cá thể, nhưng 
biến đổi giữa các bệnh nhân khác nhau.Phần 
lớn các nghiên cứu bỏ qua phân tích các đa hình 
không làm thay đổi chức năng của enzym, tập 
trung vào số ít các đột biến “chỉ thị” cho phép 
dự đoán được trạng thái acetyl hóa như 
NAT2*5,*6 và *7. Dựa vào kết quả phân tích 
kiểu gen tại 3 vị trí trên, kiểu hình acetyl hóa 
được xác định như sau: nếu không có alen đột 
biến thì bệnh nhân có kiểu hình acetyl hóa 
nhanh, nếu có một alen đột biến thì bệnh nhân 
có kiểu hình acetyl hóa trung gian, nếu xuất 
hiện trên 2 đột biến thì bệnh nhân có kiểu hình 
acetyl hóa chậm [6]. Ngoài ra, thuật toán và 
phần mềm dự đoán kiểu hình acetyl hóa dựa 
vào kiểu gen NAT2 cũng đã được công bố. Nếu 
kết hợp kiểu gen của 6 SNPlà c.282C>T,c.341T 
>C, c.481C>T, c.590G>A, c.803A>G và 
c.857G>A), dự đoán kiểu hình acetyl hóa có thể 
đạt được độ chính xác 99,9%, độ nhạy và độ đặc 
hiệu từ 99,6 đến 100% [12]. Trong trường hợp 
cần xác định đồng thời nhiều SNP như vậy, giải 
trình tự Sanger lại là phương pháp kinh tế nhất. 
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành 
xác định tỷ lệ các kiểu hình acetyl hóa, kết quả 
cho thấy tỷ lệ này là khác nhau giữa các chủng 
tộc, quốc gia [13]. Nhiều nghiên cứu về mối 
tương quan giữa kiểu gen với nồng độ INH 
trong huyết thanh, liều điều trị hiệu quả với mỗi 
kiểu hình acetyl hóa đã được tiến hành. Cụ thể, 
Kinzig-Schipper (2005) đã nghiên cứu về sự 
biến đổi dược động học của INH ở những người 
tình nguyện khỏe mạnh sau khi dùng liều 
chuẩn. Nghiên cứu chỉ ra có mối quan hệ vè 
nồng độ INH với các biến thể di truyền của 
NAT2 và các đặc điểm nhân khẩu học. Nồng độ 
INH huyết thanh tăng lên ở các cá thể có kiểu 
hình acetyl hóa chậm do giảm hoạt tính enzym 
NAT2 [3]. Trong một nghiên cứu của Parkin và 
cộng sự, bệnh nhân có kiểu hình acetyl hóa 
chậm có nồng độ INH trong huyết thanh cao 
hơn bệnh nhân acetyl hóa nhanh 4-6 lần sau 2 
đến 6 giờ uống INH, kết quả này khiến các tác giả 
đề xuất phác đồ liều isoniazid riêng cho mỗi kiểu 
gen NAT2 [14].Nghiên cứu trên 172 bệnh nhân 
Nhật Bản đã chứng minh điều trị liều INH theo 
kiểu gen NAT2 cải thiện rõ khả năng dung nạp 
thuốc so với phác đồ chuẩn.Kết quả của nghiên 
cứu cũng đưa ra tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm là 
9,3% và acetyl hóa nhanh là 53,3% trong quần thể 
người Nhật. 78% bệnh nhân có kiểu hình acetyl 
hóa chậm điều trị theo phác đồ chuẩn được xác 
định có tổn thương gan do INH, trong khi điều trị 
liều INH theo kiểu gen NAT2 ghi nhận không có 
bệnh nhân nào tổn thương gan do INH hoặc thất 
bại điều trị sớm [2]. 
NAT2 có vai trò quan trọng trong chuyển 
hóa của nhiều loại thuốc khác INH như 
hydralazine, procainamide, sulphamethazine, 
sulphonamide, nitrazepam,... Sự acetyl hóa 
chậm ảnh hưởng đến chuyển hóa thuốc và quá 
trình giải độc của cơ thể, có thể làm tăng nguy 
cơ mắc một số bệnh và phát sinh các phản ứng 
quá mẫn với các loại thuốc. Năm 1979, Lower 
và cộng sự lần đầu tiên chứng minh sự liên 
quan giữa kiểu hình acetyl hóa chậm với ung 
thư bàng quang [15], sau đó các tác giả khác 
chứng minh mối liên quan giữa đa hình gen 
NAT2 với ung thư vú, ung thư đại tràng... Gần 
đây, một số nghiên cứu cho thấy người có kiểu 
hình NAT2 acetyl hóa chậm tăng nguy cơ mắc 
các bệnh liên quan đến suy giảm chức năng 
thần kinh như Parkinson, Alzheimer. Như vậy, 
phân tích đa hình gen NAT2 không chỉ có ý 
nghĩa trong dự đoán liều điều trị isoniazid mà 
còn có thể cung cấp thêm các dữ liệu liên quan 
đến đáp ứng của nhiều thuốc khác. 
P.T.H. Nhung et al. /VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, Vol. 35, No. 1 (2019) 96-103 
103 
5. Kết luận 
Chúng tôi đã xây dựng được quy trình phân 
tích các đa hình NAT2*5,*6,*7 bằng phương 
pháp RFLP và giải trình tự và áp dụng quy trình 
phân tích thành công kiểu gen của84 bệnh nhân 
mắc lao. Kết quả này sẽ giúp phát triển các 
nghiên cứu tiếp theo về đa hình gen NAT2 ứng 
dụng trong điều trị lâm sàng. 
Lời cảm ơn 
Nghiên cứu sử dụng kinh phí từ đề tài 
nghiên cứu KHCN cấp nhà nước (Mã số 
HNQT/SPĐP/01.16) do PGS.TS Lê Thị Luyến 
chủ trì. Đề tài được Bộ Khoa học và công nghệ tài 
trợ, thuộc Chương trình hợp tác Song phương và 
Đa phương về khoa học và công nghệ đến năm 
2020 và Chương trình Newton Fund Việt Nam. 
Chúng tôi cũng xin chân thành cảm ơn 
Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Phổi 
Hà Nội và Bệnh viện 74 Trung Ương đã cung 
cấp các mẫu phẩm phục vụ cho nghiên cứu. 
Tài liệu tham khảo 
[1] U.A. Boelsterli, K.K. Lee, Mechanisms of 
isoniazid-induced idiosyncratic liver injury: 
emerging role of mitochondrial stress, J. 
Gastroenterol. Hepatol. 29 (2014) 678–687. 
[2] A. Zabost, S. Brzezinska, M. Kozinska, M. 
Blachnio, J. Jagodzinski, Z. Zwolska, E. 
Augustynowicz-Kopec, Correlation of N-
acetyltransferase 2 genotype with isoniazid 
acetylation in Polish tuberculosis patients, Biomed 
Res Int. 2013 (2013) 1-5. 
[3] M. Kinzig-Schippers, D. Tomalik-Scharte, A. 
Jetter, B. Scheidel, V. Jakob, M. Rodamer, I. 
Cascorbi, O. Doroshyenko, F. Sorgel, U. Fuhr, 
Should we use N-acetyltransferase type 2 genotyping 
to personalize isoniazid doses? Antimicrob 
Agents Chemother. 49 (2005) 1733-8 
[4] K. Walker, G. Ginsberg, D. Hattis, D.O. Johns, 
K.Z. Guyton, B. Sonawane, Genetic 
polymorphism in N-Acetyltransferase (NAT): 
Population distribution of NAT1 and NAT2 
activity, J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 
12 (2009) 440-472. 
[5] G. Ramachandran, S. Swaminathan, Role of 
pharmacogenomics in the treatment of 
tuberculosis: a review, Pharmgenomics Pers 
Med. 5 (2012) 89-98. 
[6] J. Azuma, M. Ohno, R. Kubota, S. Yokota, T. 
Nagai, K. Tsuyuguchi, Y. Okuda, T. Takashima, 
S. Kamimura, Y. Fujio, I. Kawase, 
Pharmacogenetics-based tuberculosis therapy 
research group, NAT2 genotype guided regimen 
reduces isoniazid-induced liver injury and early 
treatment failure in the 6-month four-drug standard 
treatment of tuberculosis: a randomized controlled 
trial for pharmacogenetics-based therapy, Eur J Clin 
Pharmacol. 69 (2013) 1091-1101. 
[7] P.S. Adole, P.S. Kharbanda, S. Sharma, N-
acetyltransferase 2 (NAT2) gene polymorphism as 
a predisposing factor for phenytoin intoxication in 
tuberculous meningitis or tuberculoma patients 
having seizures - A pilot study, Indian J Med Res. 
143 (2016) 581-590. 
[8] WHO Scientific Group on Pharmacogenetics and 
World Health Organization, Pharmacogenetics: 
report of a WHO scientific group,World Health 
Organization Technical Report Series. (1973) 
[9] T.D. Da Silva, A.V. Felipe, J.M. De Lima, C.T. 
Oshima, N.M. Forones, N-Acetyltransferase 2 
genetic polymorphisms and risk of colorectal 
cancer, World J Gastroenterol. 17 (2011) 760-765. 
[10] E.Y. Lau, J.S. Felton, F.C. Lightstone, Insights 
into the o-acetylation reaction of hydroxylated 
heterocyclic amines by human arylamine N-
acetyltransferases: a computational study, Chem 
Res Toxicol. 19 (2006) 182-1190. 
[11] Ensembl - EBI, 
ulation?db=core;r=8:18399844-
18400844;v=rs1801280;vdb=variation;vf=1243314,
2019 (Ensembl release 96 - April 2019). 
[12] I.B. Kuznetsov, M. McDuffie, R. Moslehi, A web 
server for inferring the human N-
acetyltransferase-2 (NAT2) enzymatic phenotype 
from NAT2 genotype, Bioinformatics. 25 (2009) 
1185-1186. 
[13] P. Wang, K. Pradhan, X.B. Zhong, X. Ma, 
Isoniazid metabolism and hepatotoxicity, Acta 
Pharm Sin B. 6 (2016) 384-392. 
[14] M. Ohno, I. Yamaguchi, I. Yamamoto, T. Fukuda, 
S. Yokota, Slow N-acetyltransferase 2 genotype 
affects the incidence of isoniazid and rifampicin-
induced hepatotoxicity, Int J Tuberc Lung Dis. 
4 (2000) 256-261. 
[15] G.M. Lower, T. Nilsson, C.E. Nelson, H. Wolf, 
T.E. Gamsky, G.T. Bryan, N-acetyltransferase 
phenotype and risk in urinary bladder cancer: 
approaches in molecular epidemiology. 
Preliminary results in Sweden and Denmark, Int J 
Epidemiol. 36 (2007) 11-18.