Tối ưu biểu hiện CsLAR1 tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli rosetta và phân tích hoạt tính

 ISSN: 1859-2171 
e-ISSN: 2615-9562 
TNU Journal of Science and Technology 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 37 
TỐI ƯU BIỂU HIỆN CsLAR1 TÁI TỔ HỢP 
TRONG VI KHUẨN E. COLI ROSETTA VÀ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH 
Hoàng Thị Thu Yến1*, Nguyễn Thị Yến1, Huỳnh Thị Thu Huệ2, Nguyễn Hải Đăng3,4
1Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên 
2Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
3Trung tâm tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa sinh biển - Viện HLKH & CNVN 
4Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội - Viện HLKH & CNVN 
TÓM TẮT 
Gen CsLAR1 phân lập từ chè Trung Du xanh trồng tại Thái Nguyên đã được gắn vào vector 
pET32a(+) và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli Rosetta. Nghiên cứu này trình bày kết quả tối ưu 
biểu hiện và phân tích hoạt tính của CsLAR1 tái tổ hợp (recombinant CsLAR1 - rCsLAR1). 
Chủng E.coli chứa pET32a(+)_CsLAR1 tạo rCsLAR1 lượng lớn ở pha tan khi được nuôi trong môi 
trường LB có bổ sung ethanol ở nhiệt độ 16 oC, 24 giờ. rCsLAR1 pha tan được ủ trong dịch chiết 
lá chè tưởi có hoạt động xúc tác làm thay đổi hàm lượng của một số chất so với đối chứng mà 
không phải là catechin, gallocatechin hoặc epicatechin. Hoạt tính của rCsLAR1 thu được chứng tỏ 
CsLAR1 có thể xúc tác cơ chất khác ở chè ngoài leucocyanidins. 
Từ khóa: chè Trung Du xanh, leucoanthocyanidin reductase, catechins, catechin, gallocatechin, 
CsLAR1 tái tổ hợp, leucocyanidins 
Ngày nhận bài: 26/4/2019; Ngày hoàn thiện: 30/5/2019; Ngày đăng: 16/6/2019 
OPTIMIZATION OF RECOMBINANT CsLAR1 EXPRESSION 
IN E. COLI ROSETTA AND ACTIVITY ANALYSIS 
Hoang Thi Thu Yen
1*
, NguyenThi Yen
1
, Huynh Thi Thu Hue
2
, Nguyen Hai Dang
3,4 
1University of Sciences – TNU, 2Institute of genome research – VAST, 
3Advanced Center for Bioorganic Chemistry, Institute of Marine Biochemistry – VAST, 
4University of Science and Technology of Hanoi - VAST 
ABSTRACT 
CsLAR1 gene isolated from the TrungDuxanh tea has grown in Thai Nguyen, It was ligated to 
pET32a(+) vector and expressed in E. coli Rosetta bacteria. This study presents the optimal 
results of expression and activity analysis of recombinant CsLAR1 (rCsLAR1). E. coli strain 
containing pET32a(+)_CsLAR1 produces a large amount of rCsLAR1 when cultured in an LB 
supplemented with ethanol at 16 
o
C, after inducing 24 hours. rCsLAR1 is incubated in an extract 
solution from fresh tea leaves that alters the content of some substances compared to the control 
but not catechin, gallocatechin or epicatechin. The rCsLAR1 activity was obtained, demonstrating 
that CsLAR1 can catalyze other substrate in tea in addition to leucocyanidins. 
Key words: TrungDuxanh tea, Leucoanthocyanidin reductase, catechins, catechin, gallocatechin, 
recombinant CsLAR1, leucocyanidins 
Received: 26/4/2019; Revised: 30/5/2019; Published: 16/6/2019 
* Corresponding author. Email: yenhtt@tnus.edu.vn
Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 38 
1. Mở đầu 
Catechins có nhiều lợi ích sức khỏe cho con 
người như khả năng chống oxi hóa [1], các 
hoạt tính phòng ngừa ung thư tuyến tiền liệt 
và buồng trứng [2]; [3], chống ung thư và 
bệnh tiểu đường [4-6], ngăn chặn bệnh tim 
mạch [6]; [7]; đặc biệt catechins có thể cũng 
đóng vai trò trong chống lại tác nhân gây 
bệnh [8]. Thành phần catechins bao gồm 
Epicatechin (EC), Epicatechin gallate (ECG), 
Epigallocatechin (EGC), Epigallocatechin 
gallate (EGCG), catechin (C) và 
Gallocatechin (GC) [9]. Catechins được chiết 
xuất từ chồi, lá, thân và rễ non của cây chè 
được xác định bằng phương pháp HPLC. Kết 
quả cho thấy hàm lượng EGCG, ECG, EGC 
và EC cao hơn nhiều so với C và GC. EGCG 
và ECG chiếm ưu thế trong lá. Sự tích lũy 
catechins ở chồi và lá non lớn hơn so với lá 
trưởng thành, thân và rễ. Tuy nhiên, chỉ EC 
được phát hiện ở rễ [10]. Các nghiên cứu gần 
đây chỉ ra rằng cả thành phần và sự tích lũy 
catechins có tương quan cao với mức độ biểu 
hiện của các gen [11-14]. Catechins của chè 
được tổng hợp theo 4 nhánh với sự xúc tác 
trực tiếp của 2 enzyme leucoanthocyanidin 
reductase (LAR) và anthocyanidin reductase 
(ANR). ANR có hai isoform được kí hiệu là 
CsANR1 và CsANR2 xúc tác anthocyanin để 
tạo thành epicatechins (EC và EGC). Chức 
năng của các LAR ở chè vẫn chưa được sáng 
tỏ hoàn toàn. CsLAR (Camellia sinenis LAR 
– CsLAR) ở chè mã hóa bởi ba locus gen 
được đặt tên là CsLAR1, CsLAR2, CsLAR3 
(còn được gọi là CsLARa, CsLARb và 
CsLARc). Bằng kỹ thuật Real time PCR định 
lượng (qRT-PCR) đã xác định CsLAR1 và 
CsLAR2 có mức độ phiên mã giống nhau và 
biểu hiện nhiều ở chồi non và lá, biểu hiện ít 
trong thân và rễ. CsLAR3 biểu hiện chủ yếu ở 
rễ, biểu hiện vừa phải ở lá và thân; mức độ 
biểu hiện của nó ở rễ là gấp đôi so với ở lá. 
Mức độ phiên mã của ba CsLAR trong lá 
trưởng thành là thấp nhất trong số tất cả các 
cơ quan lá [15]. 
Cho đến nay, các gen mã hóa LAR từ các loài 
thực vật được nghiên cứu in vitro và biểu hiện 
chức năng xúc tác các loại leucocyanidin tạo 
ra các sản phẩm như afzelechin (AFZ), C và 
GC [16-19]. Tuy nhiên, thực vật biến đổi gen 
có LAR biểu hiện quá mức dẫn đến tạo ra các 
sản phẩm khác nhau, điều này cho thấy LAR 
có chức năng phức tạp. Gen MtLAR 
(Medicago truncatula LAR), DuLAR 
(Desmodium uncinatum LAR) được biểu hiện 
ở cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây cỏ 
ba lá trắng (Trifolium repens) nhưng không 
phát hiện được sản phẩm C [17]; [19]. Tuy 
nhiên, cây thuốc lá chuyển gen TcLAR 
(Theobroma cacao LAR) tạo ra cả EC và C 
[20]. Các CsLAR được biểu hiện ở E. coli và 
có chức năng chuyển hóa các leucocyanidin 
tạo ra AFZ, C và GC [8]; [15]. Trong khi đó, 
CsLAR biểu hiện quá mức ở cây cỏ 
Arabidopsis thaliana nhưng không phát được 
sự xuất hiện C. Mặt khác, sự biểu hiện quá 
mức của CsLAR trong thuốc lá lại thu được 
EC là sản phẩm chính và C tồn tại với lượng 
nhỏ [15]. Do đó, nhóm nghiên cứu giả thuyết 
rằng các cơ chất khác của LAR có thể tồn tại 
trong thuốc lá ngoài các hợp chất 
leucocyanidin. Giả thuyết này phù hợp với 
nghiên cứu của Dixon và đồng nghiệp chứng 
minh, MtLAR có thể xúc tác cơ chất mới (4β-
(S-cysteinyl)-epicatechin) tạo thành EC in 
vitro [21]. 
Gen mã hóa CsLAR1 phân lập từ chè Trung 
Du xanh đã được tạo dòng và nghiên cứu biểu 
hiện trong vi khuẩn E. coli [22]; [23]. Tuy 
nhiên, protein rCsLAR1 thu được hầu hết 
biểu hiện ở dạng không tan, chỉ một lượng 
nhỏ ở dạng tan. Trong nghiên cứu này, chúng 
tôi tiếp tục tiến hành tối ưu các điều kiện 
nhiệt độ, thời gian và môi trường cảm ứng 
biểu hiện để thu lượng lớn rCsLAR1 ở pha 
tan phục vụ phân tích hoạt tính sinh học. 
2. Nguyên liệu và phương pháp 
2.1. Nguyên liệu 
Chủng E.coli Rosetta1 và Rosetta2 chứa 
vector biểu hiện pET32a(+)_CsLAR1 được 
lưu giữ tại Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, 
Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 39 
Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa 
học và Công nghệ Việt Nam. 
2.2. Phương pháp 
2.2.1. Tối ưu biểu hiện rCsLAR1 
Dịch nuôi chủng E. coli Rosetta1 và Rosetta2 
chứa cấu trúc biểu hiện gen mã hóa CsLAR1 
trong vector pET32a(+) được phục hồi và cấy 
trải trên đĩa LB có bổ sung kháng sinh 
ampicillin (50 mg/L), nuôi qua đêm ở điều 
kiện 37 oC. Tiếp theo, chọn một khuẩn lạc 
đơn E. coli Rosetta1/ pET32a(+)_CsLAR1 
trên đĩa biến nạp nuôi lắc trong môi trường 
LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin 
(50 mg/L) qua đêm. Dịch khuẩn nuôi qua 
đêm được làm mới trong 8 ml LBA (OD600 = 
0,1). Sau 2h nuôi lắc ở 37 oC, dịch khuẩn đạt 
giá trị từ OD600 = 0,6 sẽ được cảm ứng biểu 
hiện với IPTG 1mM và tiếp tục nuôi ở các 
điều kiện như sau: 16oC-24 h và 48 h, 23 oC-8 
h, 30 
o
C-6 h và 37 
o
C-5h [24]. Thí nghiệm 
được thực hiện cùng đối chứng E. coli 
Rosetta chứa pET32a(+)_CsLAR1 không cảm 
ứng IPTG. 
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường LB có 
bổ sung thêm ethanol để cảm ứng biểu hiện gen 
CsLAR1 theo Chhetri và đtg (2015) [25], dịch 
nuôi E. coli Rosetta1/pET32a(+)_CsLAR1 và 
Rossetta2/pET32a(+)_CsLAR1 đạt OD600 = 0,6, 
sau đó bổ sung ngay ethanol (ethanol 1%, 2% 
và 3%) vào môi trường trước khi cảm ứng biểu 
hiện ở điều kiện 16 oC, 24 h và IPTG 1 mM. 
Trong cả 2 trường hợp, cặn tế bào sau cảm 
ứng được thu và hòa với đệm PBS 1x, pH 7,4 
sao cho OD600 của các mẫu đưa về giá trị 10. 
Dịch này được siêu âm phá tế bào để thu 
protein tổng số và thực hiện ly tâm thu 
protein pha tan và pha tủa (Novagen). Kết quả 
được kiểm tra bằng điện di trên gel SDS-
PAGE 12,6% (25µl/giếng). 
2.2.2. Chuẩn bị mẫu rCsLAR1 để sắc ký 
Nuôi chủng vi khuẩn E. coli 
Rosetta1/pET32a(+)_CsLAR1 với lượng nhỏ 
trong môi trường LB có bổ sung Amplicillin 
(50 mg/L) qua đêm. Nuôi mới lại dịch khuẩn 
trong môi trường LBA mới, nuôi lắc 200 v/p 
ở 37 oC đến khi OD600 đạt 0,6. Tiếp theo bổ 
sung ethanol 1% và cảm ứng biểu hiện 
CsLAR1 với IPTG 1mM ở 16 oC, nuôi lắc 
200 v/p. Sau 24h nuôi cấy, rCsLAR1 ở pha 
tan được thu nhận bằng siêu âm phá vỡ tế bào 
và ly tâm. Chuyển dung dịch chứa rCsLAR1 
vào ống falcol 50 (20 mL/ống). Làm tương tự 
với vi khuẩn không được cảm ứng biểu hiện. 
Tiếp theo, bổ sung vào dung dịch glycerol 
10% (w/v), 100 mM KPi (pH 7,0), 4 mM 
dithiothreitol (DTT), 0,5 mM NADPH và 500 
uL dịch chiết lá chè tươi (3 g/25 mL, 6 g/25 
mL). Lắc đều và ủ ở 30 oC. Sau 4 h ủ, ly tâm 
4000 v/p, 15 phút thu dịch nuôi cấy để kiểm 
tra hoạt tính của enzyme bằng HPLC. 
2.2.3. Phương pháp sắc ký 
Phương pháp sắc ký được thực hiện như mô 
tả của Hoàng Thị Thu Yến và đtg (2018) [23]. 
Pha động sử dụng hệ dung môi kênh A H2O 
(acetic 1%) – kênh B ACN được thiết lập 
gradient biến thiên từ tỉ lệ 95/5 đến tỉ lệ 5/95 
trong 45 phút; Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút; 
Lượng bơm mẫu: 20 µL; thời gian phân tích: 
45 phút; Nhiệt độ cột: 25oC; Bước sóng lựa 
chọn: 280 nm. Hệ thống LC-MS được kết nối 
với phần mềm Agilent OpenLAB Control 
Panel. Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 
L/phút, áp suất đầu phun đạt 40 psi, nhiệt độ 
làm khô đạt 250oC. Chế độ bắn mảnh phổ 
khối lựa chọn ESI ở mode negative với 
khoảng phổ quét từ 250 đến 400 nm. 
3. Kết quả và thảo luận 
3.1. Tối ưu điều kiện nhiệt độ và thời gian 
để thu rCsLAR1 ở pha tan 
Gen mã hóa CsLAR1 từ giống chè Trung Du 
xanh trồng tại Thái Nguyên đã được phân lập 
có kích thước 1,029 kb, mã hóa 342 amino 
acid. CsLAR1 có tính bảo thủ ở các amino 
acid liên kết với cơ chất, trong khi vùng liên 
kết với NADP tất cả các mẫu công bố đều là 
S, còn mẫu chè Trung Du xanh là C. Motif 
RFLP và THD có tính bảo thủ cao, trong khi 
motif ICCN của CsLAR1 từ chè Trung Du 
xanh có 1 vị trí amino acid khác biệt so với 
Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 40 
các trình tự còn lại I153T. Motif ICCN nằm 
gần vị trí liên kết cơ chất, cho thấy đột biến 
này có thể có tầm quan trọng đối với hoạt 
động của CsLAR1 [22]. Vector tái tổ hợp 
pET32a(+) mang gen CsLAR1 được biến nạp 
vào 2 chủng tế bào biểu hiện là E. coli 
Rosetta1 và E. coli Rosetta2. Protein tái tổ 
hợp thu được có kích thước lý thuyết khoảng 
54,04 kDa bao gồm CsLAR1 theo tính toán lý 
thuyết là khoảng 37,62 kDa cùng với đoạn 
trình tự TrxA mã hoá cho protein thioredoxin 
(11,8 kDa), His-Taq (1,68 kDa), S-Taq (1,7 
kDa), thrombin (0,63 kDa) và enterkinase 
(0,61 kDa). Trong nghiên cứu công bố trước 
đây, protein rCsLAR1 ở cả 2 chủng hầu hết 
biểu hiện ở dạng không tan, chỉ một lượng 
nhỏ ở dạng tan [23]. Để thu rCsLAR1với 
lượng lớn ở pha tan, chúng tôi tiến hành 
nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời 
gian biểu hiện. 
Theo Schein và đtg (1988) [26], E. coli sinh 
trưởng và phát triển tốt ở 37 oC. Tuy nhiên, 
cảm ứng biểu hiện ở 37 °C, protein ngoại lai 
được tạo ra thường tích lũy ở pha tủa (thể 
vùi). Trong khi cảm ứng ở 23 – 30 °C, 30-
90% protein tái tổ hợp thu được ở pha tan. 
Tăng trưởng và cảm ứng ở 25 °C hoặc 30 °C 
có thể là tối ưu nếu sử dụng trình tự peptide 
tín hiệu của một số vector pET (Novagen). 
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành tối ưu 
nhiệt độ biểu hiện rCsLAR1, kết quả nghiên 
cứu trình bày ở hình 1. 
Hình 1. Tối ưu điều kiện nhiệt độ và thời gian để 
thu enzyme tái tổ hợp ở pha tan 
w/o IPTG: Đối chứng không cảm ứng IPTG, TS: 
protein tổng số, S: protein pha tan, P: protein pha 
tủa, M: thang chuẩn protein 
Kết quả trên hình 1 cho thấy lượng protein 
ngoại lai có kích thước khoảng 54,04 kDa 
biểu hiện khá nhiều ở nhiệt độ 37 oC, 30 oC và 
23 
oC. Đó chính là kích thước của rCsLAR1 
theo tính toán lý thuyết. Tuy nhiên, hầu hết 
lượng protein CsLAR1 thu được đều biểu 
hiện ở pha tủa. Trong một số trường hợp, cảm 
ứng kéo dài (qua đêm) ở nhiệt độ thấp (15 – 
20 °C) đã được chứng minh là nhiệt độ tối ưu 
thu nhận protein pha tan (Novagen). Cảm ứng 
biểu hiện khi giảm nhiệt độ cũng được chứng 
minh khi nghiên cứu biểu hiện gen mô hình 
GFP [24]. Do đó, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 
16
oC để cảm ứng biểu hiện và thu rCsLAR1 
sau 24 và 48 giờ cảm ứng. Kết quả điện di 
kiểm tra rCsLAR1 thu được trình bày ở hình 2. 
Hình 2. Tối ưu điều kiện nhiệt độ và thời gian để 
thu enzyme tái tổ hợp ở pha tan 
w/o IPTG: Đối chứng không cảm ứng IPTG, TS: 
protein tổng số, S: protein pha tan, P: protein pha 
tủa, M: thang chuẩn protein 
Kết quả ở hình 2 cho thấy, CsLAR1 biểu hiện 
chủ yếu ở pha tủa và biểu hiện ít hơn ở điều 
kiện 16 oC, 48 h. Vì vậy, trong nghiên cứu tiếp 
theo chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 16oC và sau 24 
giờ cảm ứng để thu CsLAR1 ở pha tan. 
3.2. Tăng cường biểu hiện rCsLAR1 ở pha 
tan trên nền môi trường LB có bổ sung 
ethanol 
Nghiên cứu của Chhetri và đtg (2015) chỉ ra 
proein tái tổ hợp ở pha tan được biểu hiện 
tăng khi bổ sung ethanol vì ethanol là một 
phân tử lưỡng cực và có thể ảnh hưởng đến 
Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 41 
môi trường, hoạt động của màng tế bào làm 
tăng cường tổng hợp DNA. Do đó, ethanol 
được nhóm nghiên cứu cho rằng có vai trò 
tăng cường tổng hợp protein. Hơn nữa, 
ethanol có thể giúp tăng cường khả năng hòa 
tan của protein tái tổ hợp và ổn định trạng thái 
tự nhiên của protein. Tuy nhiên, cơ chế phân 
tử ethanol tăng cường biểu hiện protein tái tổ 
hợp ở E. coli vẫn chưa đước sáng tỏ [27]. 
Trên cơ sở đó, để thu nhận CsLAR1 ở pha tan 
chúng tôi bổ sung ethanol vào môi trường 
nuôi ngay trước lúc cảm ứng đối với chủng 
biểu hiện. Kết quả nghiên cứu được trình bày 
trên hình 3. 
Hình 3. Điện di sản phẩm biểu hiện rCsLAR1 khi 
cảm ứng bổ sung EtOH 
ĐC: đối chứng không cảm ứng, 1-3: pha tan chủng 
E. coli Rosetta1/pET32a(+)_CsLAR1 có bổ sung 
lần lượt 1%-2%-3% EtOH, 4-6: pha tan chủng E. 
coli Rosetta2/pET32a(+)_CsLAR1 có bổ sung lần 
lượt 1%-2%-3% EtOH, M: Thang chuẩn protein 
Kết quả ở hình 3 cho thấy, chủng E. coli 
Rosetta2/pET32a(+)_CsLAR1 không thu được 
protein đích biểu hiện ở pha tan. Tuy nhiên, 
đối với chủng E. coli 
Rosetta1/pET32a(+)_CsLAR1, protein 
CsLAR1 đã biểu hiện trong pha tan với lượng 
khá lớn. Như vậy, chúng tôi đã tối ưu biểu 
hiện CsLAR1 ở pha tan thành công. 
Phân tích hoạt tính CsLAR1 tái tổ hợp 
Các loại leucocyanidin là cơ chất trực tiếp của 
CsLAR1, không bền và không có sẵn trên thị 
trường. Do đó, chúng tôi không thể trực tiếp 
phát hiện hoạt tính xúc tác của rCsLAR1. 
Chúng tôi đã sử dụng rCsLAR1 ở pha tan trộn 
với dịch chiết của lá chè tươi và tiến hành phản 
ứng ở nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính sinh học 
của rCsLAR1 được phân tích và kiểm tra trên 
hệ thống LC-MS, kết quả thể hiện ở hình 4. 
Kết quả hình 4 cho thấy sắc ký đồ của mẫu 
đối chứng, các chất số 1, 2, 3, 4 có hàm lượng 
thấp hoặc không có. Tuy nhiên, ở mẫu sau khi 
ủ với dịch rCsLAR1 thì hàm lượng 4 hợp chất 
này tăng lên rõ rệt. Sắc ký đồ của 4 chất với 
hàm lượng không khác nhau khi tăng hàm 
lượng rCsLAR1 trong phản ứng, điều này có 
thể giải thích do nguồn cơ chất CsLAR1 xúc 
tác giống nhau. Như vậy, bước đầu có thể xác 
định CsLAR1 có hoạt tính sinh học và hoạt 
động tốt. 
Hình 4. Sắc kí đồ UV 280nm phân tích hoạt tính của rCsLAR1 
DC LAR: Sắc ký đồ mẫu đối chứng không chứa rCsLAR1; LAR1 và LAR2: Sắc ký đồ hoạt tính của 
rCsLAR1 với hàm lượng tương ứng 3 g/25 mL và 6 g/25 mL 
Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 42 
Hình 5. Phổ ESI-MS negative của 4 chất thay đổi khi phân tích hoạt tính của CsLAR1 trong dịch chiết lá 
chè lươi A (chất 1), B (chất 2), C (chất 3), D (chất 4) 
Theo nghiên cứu của Pang và đtg (2013); 
Wang và đtg (2018), CsLAR1 xúc tác các cơ 
chất có thể cho các sản phẩm catechin (m/z 
289), epicatechin (m/z 290) hoặc 
gallocatechin (m/z 306) [8]; [15]. Trên hệ 
thống LC, pic tín hiệu của các chất 1, 2, 3 và 
4 được phát hiện lần lượt tại thời gian lưu 5,5 
phút, 5,8 phút, 6,8 và 10,5 phút (Hình 4). 
Đồng thời, hệ thống MS phát hiện được pic 
ion phân tử tại m/z 257,0 [M-H]-, 260,0 [M-
H]
-
, 345,0 [M-H]
-
 và 345,0 [M-H]
-
 tương ứng 
với các thời gian lưu trên (Hình 5). Như vậy, 
các chất thay đổi thu được có pic ion phân tử 
không phải là catechin, epicatechin hoặc 
gallocatechin như chức năng của CsLAR1 đã 
công bố. Do đó, cần có nghiên cứu thêm để 
xác định rõ các hợp chất này. Hoạt tính của 
rCsLAR1 thu được chứng tỏ CsLAR1 có thể 
xúc tác cơ chất khác ở chè ngoài nhóm chất 
leucocyanidin. 
4. Kết luận 
Chủng E. coli Rosetta1 chứa 
pET32a(+)_CsLAR1 được nuôi trong môi 
trường LB có bổ sung ethanol ở nhiệt độ 
16
oC, cảm ứng sau 24 giờ tạo rCsLAR1 lượng 
lớn ở pha tan. Bằng kỹ thuật HPLC đã phát 
hiện rCsLAR1 pha tan có hoạt động xúc tác 
làm thay đổi hàm lượng của một số chất so 
với đối chứng mà không phải là catechin, 
gallocatechin hoặc epicatechin khi được ủ 
trong dịch chiết chè. 
Lời cảm ơn 
Công trình thực hiện được hỗ trợ kinh phí từ 
đề tài cấp Bộ Giáo dục và Đào tạo, mã số 
B2016-TNA-24. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1]. A. Luximon-Ramma, V. S. Neergheen, T. 
Bahorun, A. Crozier, V. Zbarsky, K. P. Datla, D. 
T. Dexter & O. I. Aruoma, "Assessment of the 
polyphenolic composition of the organic extracts 
of Mauritian black teas: a potential contributor to 
their antioxidant functions", Biofactors, Vol. 27, 
No. 1-4, pp. 79-91, 2006. 
[2]. D. L. Bemis, A. E. Katz & R. Buttyan, 
"Clinical trials of natural products as 
chemopreventive agents for prostate cancer", 
A 
E D 
B 
1
m/z 257 
[M-H]
- 
2
m/z 260 
[M-H]
- 
3
m/z 345 
[M-H]
- 
4
m/z 345 
[M-H]
- 
Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 43 
Expert Opin Investig Drugs, Vol. 15, No. 10, pp. 
1191-1200, 2006. 
[3]. M. H. Ravindranath, T. S. Saravanan, C. C. 
Monteclaro, N. Presser, X. Ye, S. R. Selvan & S. 
Brosman, "Epicatechins Purified from Green Tea 
(Camellia sinensis) Differentially Suppress 
Growth of Gender-Dependent Human Cancer Cell 
Lines", Evid. Based Complement Alternat Med., 
Vol. 3, No. 2, pp. 237-247, 2006. 
[4]. Y. H. Kao, H. H. Chang, M. J. Lee & C. L. 
Chen, "Tea, obesity, and diabetes", Mol. Nutr. 
Food Res., Vol. 50, No. 2, pp. 188-210, 2006. 
[5]. S. Wolfram, Y. Wang & F. Thielecke, "Anti-
obesity effects of green tea: from bedside to 
bench", Mol. Nutr. Food Res., Vol. 50, No. 2, pp. 
176-187, 2006. 
[6]. T. T. Yang & M. W. Koo, "Inhibitory effect of 
Chinese green tea on endothelial cell-induced 
LDL oxidation", Atherosclerosis, Vol. 148, No. 1, 
pp. 67-73, 2000. 
[7]. A. Bordoni, S. Hrelia, C. Angeloni, E. 
Giordano, C. Guarnieri, C. M. Caldarera & P. L. 
Biagi, "Green tea protection of 
hypoxia/reoxygenation injury in cultured cardiac 
cells", J. Nutr. Biochem., Vol. 13, No. 2, pp. 103-
111, 2002. 
[8]. Y. Pang, I. S. Abeysinghe, J. He, X. He, D. 
Huhman, K. M. Mewan, L. W. Sumner, J. Yun & 
R. A. Dixon, "Functional characterization of 
proanthocyanidin pathway enzymes from tea and 
their application for metabolic engineering", Plant 
Physiol, Vol. 161, No. 3, pp. 1103-1116, 2013. 
[9]. Y. S. Zhen, Z. M. Chen, S. J. Cheng & M. L. 
Chen, Tea: bioactivity and therapeutic potential, 
Taylor & Francis, London, 2002. 
[10]. L. Cui, S. Yao, X. Dai, Q. Yin, Y. Liu, X. 
Jiang, Y. Wu, Y. Qian, Y. Pang, L. Gao & T. Xia, 
"Identification of UDP-glycosyltransferases 
involved in the biosynthesis of astringent taste 
compounds in tea (Camellia sinensis)", J. Exp. 
Bot., Vol. 67, No. 8, pp. 2285-2297, 2016. 
[11]. X. Jiang, Y. Liu, W. Li, L. Zhao, F. Meng, 
Y. Wang, H. Tan, H. Yang, C. Wei, X. Wan, L. 
Gao & T. Xia, "Tissue-specific, development-
dependent phenolic compounds accumulation 
profile and gene expression pattern in tea plant 
(Camellia sinensis)", PLoS One, Vol. 8, No. 4, pp. 
62315-62329, 2013. 
[12]. A. Rani, K. Singh, P. S. Ahuja & S. Kumar, 
"Molecular regulation of catechins biosynthesis in 
tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]", Gene, 
Vol. 495, No. 2, pp. 205-210, 2012. 
[13]. K. Wei, L. Wang, C. Zhang, L. Wu, H. Li, F. 
Zhang & H. Cheng, "Transcriptome Analysis 
Reveals Key Flavonoid 3'-Hydroxylase and 
Flavonoid 3',5'-Hydroxylase Genes in Affecting 
the Ratio of Dihydroxylated to Trihydroxylated 
Catechins in Camellia sinensis", PLoS One, Vol. 
10, No. 9, 137925-137937, 2015. 
[14]. L. Xiong, J. Li, Y. Li, L. Yuan, S. Liu, J. 
Huang & Z. Liu, "Dynamic changes in catechin 
levels and catechin biosynthesis-related gene 
expression in albino tea plants (Camellia sinensis 
L.)", Plant Physiol Biochem, Vol. 71, pp. 132-143, 
2013. 
[15]. P. Wang, L. Zhang, X. Jiang, X. Dai, L. Xu, 
T. Li, D. Xing, Y. Li, M. Li, L. Gao & T. Xia, 
"Evolutionary and functional characterization of 
leucoanthocyanidin reductases from Camellia 
sinensis", Planta, Vol. 247, pp. 139–154 2018. 
[16]. K. N. Kristiansen, "Conversion of (+)-
dihydroquercetin to (+)-2,3-trans-3,4-cis-
leucocyanidin and (+)-catechin with an enzyme 
extract from maturing grains of barley", Carlsberg 
Res. Commun, Vol. 51, pp. 51-60, 1986. 
[17]. Y. Pang, G. J. Peel, E. Wright, Z. Wang & R. 
A. Dixon, "Early steps in proanthocyanidin 
biosynthesis in the model legume Medicago 
truncatula", Plant Physiol, Vol. 145, No. 3, pp. 
601-615, 2007. 
[18]. H. A. Stafford & H. H. Lester, "Flavan-3-ol 
Biosynthesis: The Conversion of (+)-
Dihydroquercetin and Flavan-3,4-cis-Diol 
(Leucocyanidin) to (+)-Catechin by Reductases 
Extracted from Cell Suspension Cultures of 
Douglas Fir", Plant Physiol, Vol. 76, No. 1, pp. 
184-186, 1984. 
[19]. G. J. Tanner, K. T. Francki, S. Abrahams, J. 
M. Watson, P. J. Larkin & A. R. Ashton, 
"Proanthocyanidin biosynthesis in plants. 
Purification of legume leucoanthocyanidin 
reductase and molecular cloning of its cDNA", J. 
Biol. Chem., Vol. 278, No. 34, pp. 31647-31656, 
2003. 
[20]. Y. Liu, Z. Shi, S. Maximova, M. J. Payne & 
M. J. Guiltinan, "Proanthocyanidin synthesis in 
Theobroma cacao: genes encoding anthocyanidin 
synthase, anthocyanidin reductase, and 
leucoanthocyanidin reductase", BMC Plant Biol., 
Vol. 13, pp. 202, 2013. 
[21]. C. Liu, X. Wang, V. Shulaev & R. A. Dixon, 
"A role for leucoanthocyanidin reductase in the 
extension of proanthocyanidins", Nat. Plants, Vol. 
2, pp. 16182, 2016. 
[22]. Hoàng Thị Thu Yến, Dương Trung Thành, 
Phạm Thị Hằng, Dương Trung Dũng & Huỳnh 
Thị Thu Huệ, "Phân lập và mô tả trình tự các gen 
mã hóa leucoanthocyanidin reductase và 
anthocyanidin reductase từ chè Trung du xanh 
Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 202(09): 37 - 44 
 Email: jst@tnu.edu.vn 44 
Thái Nguyên (Camellia sinensis)", Công nghệ 
Sinh học, T. 16, S. 3, tr. 234-242, 2018. 
[23]. Hoàng Thị Thu Yến & Huỳnh Thị Thu Huệ, 
"Biểu hiện gen mã hóa leucoanthocyanidin 
reductase phân lập từ chè trung du xanh (Camellia 
sinensis var. macrophylla) trong vi khuẩn E. coli", 
Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái 
Nguyên, T. 187, S. 11, tr. 129-135, 2018. 
[24]. X. Jiang, H. Zhang, J.Yang, M. Liu, H. Feng, 
X. Liu, Y. Cao, D. Feng & M. Xian, "Induction of 
gene expression in bacteria at optimal growth 
temperatures", Appl. Microbiol Biotechnol, Vol. 
97, No. 12, pp. 5423-5431, 2013. 
[25]. G. Chhetri, P. Kalita & T. Tripathi, "An 
efficient protocol to enhance recombinant protein 
expression using ethanol in Escherichia coli", 
MethodsX, Vol. 2, pp. 385-391, 2015. 
[26]. C. H. Schein & M. H. M. Noteborn, 
"Formation of Soluble Recombinant Proteins in 
Escherichia Coli is Favored by Lower Growth 
Temperature", Bio/Technology, Vol. 6, pp. 291–
294, 1988. 
[27]. G. Chhetri, P. Kalita & T. Tripathi, "An 
efficient protocol to enhance recombinant protein 
expression using ethanol in Escherichia coli", 
MethodsX, Vol. 2, pp. 385-391, 2015.