Thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR chẩn đoán đồng thời vi khuẩn than và vi khuẩn dịch hạch

TAÏP CHÍ Y DÖÔÏC THÖÏC HAØNH 175 - SOÁ 3 - 9/2015
48
TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu này tiến hành thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR 
sử dụng 6 cặp mồi khuếch đại các gen đích VrrA, pagA, capA và ypo2088, pla, caf1 chẩn 
đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis trên các chủng đã xác định có đầy đủ plasmid 
độc. Đây là cơ sở cho việc chế tạo kit multiplex PCR chẩn đoán đồng thời B. anthracis 
và Y. pestis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và môi trường.
Đối tượng và phương pháp: Chủng vi khuẩn than và dịch hạch được lưu giữ tại 
Học viện Quân y đã được xác định là có đủ các plasmid chứa các gen độc của hai vi 
khuẩn. Các cặp mồi sử dụng để phát hiện các gen VrrA, capA, pagA của B. anthracis và 
các gen ypo 2088, pla, caf1 của Y. pestis được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được công 
bố trên Genbank. Chủng vi khuẩn sau khi được bất hoạt bằng nhiệt, tiến hành tách triết 
theo thường qui của bộ kit QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Đức). Tối ưu hóa phản 
ứng multiplex PCR để đảm bảo phát hiện được đồng thời các gen đích quan tâm bằng 
cách tối ưu hóa thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng.
Kết quả và kết luận: Thiết kế và tối ưu hóa thành công phản ứng multiplex PCR 
chẩn đoán đồng thời vi khuẩn than và dịch hạch sử dụng 6 cặp mồi được thiết kế để 
khuếch đại 6 gen đích của 2 vi khuẩn trong đó 2 gen trên chromosome (VrrA, ypo2088) 
và 4 gen trên plasmid (capA, pagA, pla, caf1). 
*Từ khóa: Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR
ESTABLISHING A NOVEL MULTIPLEX PCR TO DETECT 
SIMULTANEOUSLY BACILLUS ANTHRACIS AND YERSINIA PESTIS
SUMMARY 
Objective: The study aimed to establish a novel multiplex PCR by using six new 
specific primer pairs targeting to the VrrA, pagA, capA and ypo2088, pla, caf1 genes of 
THIẾT KẾ VÀ TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX PCR CHẨN 
ĐOÁN ĐỒNG THỜI VI KHUẨN THAN VÀ VI KHUẨN DỊCH HẠCH
Nguyễn Thái Sơn1, Nguyễn Văn An 1
(1) Học viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn An ([email protected])
Ngày nhận bài: 24/3/2015; Ngày phản biện đánh giá: 23/4/2015
TAÏP CHÍ Y DÖÔÏC THÖÏC HAØNH 175 - SOÁ 3 - 9/2015
49
B. anthracis and Y. pestis. The assay then was used to develop a multiplex PCR kit for 
simultaneously detecting B. anthracis and Y. pestis which carried toxic plasmid genes 
from clinical and environment samples.
Method: B. anthracis and Y. pestis strains determined to carry plasmid toxic genes 
were used. Six specific primer pairs were designed by using Prime3 software basing 
on reference sequences retrieved from GenBank. After heat inactivation, DNA from 
bacteria was extracted by using QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany) following 
the manufacturer’s instructions, subsequently stored at -80°C until use. The PCR 
components and temperature cycle were optimized to ensure the simultaneous detection 
of target genes.
Findings and conclusion: We succeeded to establish a novel multiplex PCR 
simultaneously detecting B. anthracis and Y. pestis. Six specific primer pairs were able to 
amplify target genes of two bacteria including two chromosome genes (VrrA, ypo2088) 
and four plasmid genes (capA, pagA, pla, caf1).
*Key words: Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ
Khủng bố sinh học đã được đặt ở mức 
quan tâm hàng đầu của an ninh thế giới, đặc 
biệt từ sau vụ khủng bố bằng vi khuẩn than 
(Bacillus anthracis) tại Mỹ năm 2001, tiếp 
theo là việc xác định được vi khuẩn dịch 
hạch (Yersina pestis) trên hai người tại Mỹ 
năm 2002 [5], [9]. Trong một vụ tấn công 
nghi ngờ có khủng bố sinh học, việc phát 
hiện nhanh tác nhân sinh học là một trong 
những yếu tố quyết định đến an ninh quốc 
gia. Việc sàng lọc nhanh những mẫu nghi 
ngờ sẽ giúp kiểm soát sự lây lan và đảm 
bảo điều trị chính xác mầm bệnh. Hiện 
nay, trong các phương pháp chẩn đoán B. 
anthracis và Y. pestis thì PCR (polymerase 
chain reaction) là phương pháp có độ 
nhậy, độ đặc hiệu cao và thời gian cho kết 
quả nhanh [6], [7]. Các nghiên cứu trước 
đây ở trong nước chủ yếu tập trung thiết 
kế phản ứng PCR chẩn đoán từng loại vi 
khuẩn than hoặc vi khuẩn dịch hạch [1], 
[2], [3], điều này đẫn đến mất nhiều thời 
gian và tốn kém mới có thể xác định được 
mầm bệnh vì phải tiến hành nhiều phản 
ứng PCR. Xuất phát từ những vấn đề trên 
chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm 
thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex 
PCR chẩn đoán nhanh, chính xác đồng 
thời cả hai vi khuẩn than và dịch hạch. 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU
1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu: Các 
chủng vi khuẩn Bacillus anthracis và 
Yersina pestis được lưu giữ tại Học viện 
Quân y đã được xác định có đủ các plasmid 
chứa các gen độc và chủng vi khuẩn đối 
chứng (Echerichia coli, Bacillus cereus) 
được đặt mua tại công ty Microbiologics 
(Mỹ).
2. Các cặp mồi: Các cặp mồi sử dụng 
để phát hiện các gen VrrA, capA, pagA của 
B. anthracis và các gen ypo 2088, pla, caf1 
của Y. pestis được thiết kế dựa trên trình 
tự gen đã được công bố trên Genbank, các 
cặp mồi có trình tự như sau:
TAÏP CHÍ Y DÖÔÏC THÖÏC HAØNH 175 - SOÁ 3 - 9/2015
50
Bảng 1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Gen đích Vi trí gen Mồi Trình tự Sản phẩm 
(bp)
VrrA
Chromosome
 vi khuẩn than
F
R
5’ CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA 
3’
5’ CCTCGCGCACTTCTTTTTCT 3’
222
pagA
Plasmid pOX1 vi 
khuẩn than
F
R
5’ AAATGGAGCACGGCTTCTGA 
3’
5’ AGCCTGTATCCACCCTCACT 3’
751
capA
Plasmid pOX2 vi 
khuẩn than
F
R
5’ TGACGATGACGATGGTTGGT 
3’
5’ GCTTCCTGTCTAGGACTCGG 3’
610
ypo2088
Chromosome
vi khuẩn dịch 
hạch
F
R
5’ GGATGAGATAACGCGGGTGT 
3’
5’ AGAGAATCGTGATGCCGTCC 
3’
103
pla
Plasmid pPCP1
vi khuẩn dịch 
hạch
F
R
5’ CGGGATGCTGAGTGGAAAGT 
3’
5’ ATTACCCGCACTCCTTTCGG 3’
438
caf1
Plasmid pMT1
vi khuẩn dịch 
hạch
F
R
5’ CGCTTACTCTTGGCGGCTAT 3’
5’ GCTGCAAGTTTACCGCCTTT 3’ 271
3. Tách chiết DNA
Vi khuẩn B. anthracis và Y. pestis 
được thu hoạch trong nước muối sinh lý, 
nồng độ vi khuẩn đạt 106 vk/ml. Tiến hành 
bất hoạt vi khuẩn bằng nhiệt ướt ở 1210C x 
15 phút để đảm bảo tất cả thể dinh dưỡng 
và bào tử (đối với B. anthracis) đều bị tiêu 
diệt [8]. Sau đó dung dịch canh khuẩn được 
tiến hành tách chiết theo thường qui của 
bộ kít QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, 
Đức). Toàn bộ qui trình này được thực 
hiện trong phòng an toàn sinh học cấp 2 và 
cấp 3 của Học viện Quân y.
Thiết kế và tối ưu hóa phản ứng 
multiplex PCR khuếch đại đồng thời 6 
gen đích của B. anthracis và Y. pestis
Phản ứng multiplex PCR được thiết 
kế dựa trên phản ứng PCR tiêu chuẩn 
(tổng thể tích 25µl, trong đó các thành 
phần cơ bản gồm: Buffer nồng độ là 1X, 
dNTPs nồng độ là 200µM/mỗi loại, MgCl-
2 nồng độ khoảng 1-4mM, primer nồng 
độ khoảng 0,04-0,6µM/mỗi loại, Taq 
polymerase nồng độ khoảng 1-2U/25µl, 
DNA template nồng độ là 150ng/25µl) 
[4]. Tuy nhiên, trong phản ứng multiplex 
PCR có bổ sung thêm các cặp mồi để phát 
hiện đồng thời các gen khác nhau, việc bổ 
sung này làm cho nồng độ của các thành 
phần thay đổi so với phản ứng PCR tiêu 
chuẩn, đồng thời có thể xảy ra hiện tượng 
các cặp mồi ức chế, bắt cặp chéo lẫn nhau 
dẫn tới không phát hiện được các các gen 
đích quan tâm. Chính vì vậy tiến hành tối 
ưu hóa thành phần và chu trình nhiệt của 
phản ứng multiplex PCR để đảm bảo phản 
ứng phát hiện được đồng thời các gen đích 
quan tâm. Các nội dung tối ưu hóa bao 
gồm:
Tối ưu hóa nồng độ mồi và lượng 
TAÏP CHÍ Y DÖÔÏC THÖÏC HAØNH 175 - SOÁ 3 - 9/2015
51
DNA mẫu bằng cách tiến hành phản ứng 
PCR với nồng độ các mồi và lượng DNA 
mẫu khác nhau của 2 vi khuẩn, sau đó căn 
cứ vào kết quả điện di để lựa chọn nồng độ 
các mồi và lượng DNA thích hợp của từng 
loại vi khuẩn.
Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi bằng 
cách chạy gradient nhiệt độ gắn mồi, nhiệt 
độ trung gian được chia tự động trên máy 
iCyler từ 540C đến 580C. Thời gian gắn 
mồi áp dụng là 45 giây, số chu kì phản ứng 
áp dụng là 32. 
Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 bằng cách 
cố định nồng độ dNTP và chọn dải nồng 
độ MgCl2 từ 2 - 3 - 4 - 5mM. Tối ưu hóa 
nồng độ dNTP bằng cách cố định nồng độ 
MgCl2 đã tối ưu và chọn dải nồng độ dNTP 
từ 0,25 - 0,4 - 0,8mM.
Phản ứng PCR được tiến hành trên 
máy GeneAmp PCR System 9700 và 
iCyler. 
Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên 
gel Agarose 2% trong dung dịch đệm TBE 
0,5X (100V/50 phút), sau đó nhuộm trong 
Ethidium bromide 15 phút và chụp ảnh 
gel.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN 
LUẬN
1. Tối ưu hàm lượng DNA và nồng 
độ mồi của B. anthracis và Y. pestis 
Tối ưu hàm lượng DNA và nồng độ 
mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng 
cách tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần thực 
hiện 16 phản ứng multiplex PCR giống 
nhau về các thành phần chỉ khác về tỉ lệ 
hàm lượng DNA của Y. pestis/B. anthracis 
và nồng độ các cặp mồi sử dụng. Trong 
đó tỉ lệ hàm lượng DNA của Y. pestis/B. 
anthracis thay đổi theo các tỉ lệ 1/2, 1/4, 
1/8, 1/10, với mỗi tỉ lệ trên tiến hành 4 
phản ứng với nồng các cặp mồi sử dụng 
chẩn đoán Y. pestis và B. anthracis lần lượt 
là (0,1; 0,6 µM), (0,2; 0,5 µM), (0,3; 0,4 
µM), (0,4; 0,3 µM). 
Hình 1. Tối ưu lượng DNA và nồng độ mồi của của B. anthracis và Y. pestis trong 
phản ứng multiplex PCR. 
Kết quả thể hiện trên hình 1 cho thấy 
khi tỉ lệ hàm lượng DNA của Y. pestis/B. 
anthracis trong phản ứng bằng 1/10 và 
nồng độ của các cặp mồi sử dụng chẩn 
đoán Y. pestis là 0,1 µM; B. anthracis là 
0,6 µM thì sản phẩm xuất hiện cả 6 băng 
đặc hiệu tương ứng với 6 gen đích và 
không có băng phụ. 
 500bp
222bp
100bp
751bp
610bp
438bp
271bp
103bp
M: Marker 100 bp
1: tỉ lệ DNA của Y. pestis/B. 
anthracis là 1/10
2: tỉ lệ DNA của Y. pestis/B. 
anthracis là 1/8
3: tỉ lệ DNA của Y. pestis/B. 
anthracis là 1/4
4: tỉ lệ DNA của Y. pestis/B. 
anthracis là 1/2
TAÏP CHÍ Y DÖÔÏC THÖÏC HAØNH 175 - SOÁ 3 - 9/2015
52
3. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
Để tối ưu nhiệt độ gắn mồi, tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần 4 phản ứng multiplex 
PCR giống nhau về các thành phần, chỉ khác nhau về nhiệt độ gắn mồi (540C, 560C, 
570C, 580C).
Kết quả trên hình 3 cho thấy ở nồng độ MgCl2 là 3mM thì sản phẩm xuất hiện cả 6 
băng đặc hiệu tương ứng với 6 gen đích và không có băng phụ. 
M: Marker 100 bp
1: nhiệt độ gắn mồi là 54°C
2: nhiệt độ gắn mồi là 56°C
3: nhiệt độ gắn mồi là 57°C
4: nhiệt độ gắn mồi là 58°C
751bp
610bp
438bp
271bp
103bp
500bp
222bp
100bp
Kết quả trên hình 2 cho thấy ở nhiệt độ gắn mồi là 560C thì sản phẩm xuất hiện cả 
6 băng đặc hiệu tương ứng với 6 gen đích và không có băng phụ.
2. Tối ưu nồng độ MgCl
2
Để tối ưu nồng độ MgCl2, tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần thực hiện 4 phản ứng 
multiplex PCR giống nhau về các thành phần, chỉ khác nhau về nồng độ MgCl2 (2mM, 
3mM, 4mM, 5mM).
751bp
610bp
438bp
271bp
 222bp
103bp
500bp
300bp
100bp
M: Marker 100 bp
1: nồng độ MgCl2 là 2mM
2: nồng độ MgCl2 là 3mM
3: nồng độ MgCl2 là 4mM
4: nồng độ MgCl2 là 5mM
Hình 2. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR
Hình 3. Tối ưu nồng độ MgCl
2
 cho phản ứng multiplex PCR
TAÏP CHÍ Y DÖÔÏC THÖÏC HAØNH 175 - SOÁ 3 - 9/2015
53
5. Tối ưu nồng độ dNTP 
Để tối ưu nồng độ dNTP, tiến hành 
lặp lại 3 lần, mỗi lần thực hiện 3 phản ứng 
multiplex PCR giống nhau về các thành 
phần, chỉ khác nhau về nồng độ của dNTP. 
 Kết quả thực hiện phản ứng multiplex 
PCR với thành phần và chu kỳ nhiệt đã 
tối ưu được thể hiện trên hình 5 cho thấy: 
Xuất hiện cả 6 băng đặc hiệu tương ứng 
với 6 gen đích của B. anthacis, Y. pestis và 
không có băng phụ.
KẾT LUẬN
Thiết kế và tối ưu hóa thành công 
phản ứng multiplex PCR chẩn đoán đồng 
thời vi khuẩn than và dịch hạch sử dụng 
6 cặp mồi được thiết kế để khuếch đại 6 
gen đích trong đó 2 gen trên chromosome 
(VrrA, ypo2088) và 4 gen trên plasmid 
751bp
 610bp
438bp
 271bp
103bp
 500bp
222bp
100bp
M: Marker 100 bp
1: nồng độ dNTP là 0,2 mM
2: nồng độ dNTP là 0,4mM
3: nồng độ dNTP là 0,8mM
Hình 4. Tối ưu nồng độ dNTP cho phản ứng multiplex PCR
Kết quả trên hình 4 cho thấy ở nồng độ dNTP là 0,25mM thì sản phẩm xuất hiện cả 
6 băng đặc hiệu tương ứng với 6 gen đích và không có băng phụ. 
4. Phản ứng multiplex PCR với thành phần và chu kỳ nhiệt đã tối ưu
Tiến hành thực hiện lặp lại 3 lần phản ứng PCR với thành phần và chu kỳ nhiệt đã 
tối ưu, kết quả thu được như hình sau. 
Hình 5. Phản ứng multiplex PCR sau khi đã tối ưu
751bp
610bp
438bp
271bp
103bp
 500bp
222bp
100bp
M: Marker 100 bp
TAÏP CHÍ Y DÖÔÏC THÖÏC HAØNH 175 - SOÁ 3 - 9/2015
54
(capA, pagA, pla, caf1). Chu trình nhiệt 
là: 940C: 4 phút - (940C: 1 phút, 560C: 45 
giây, 720C: 50 giây) x 32 chu kỳ - 720C: 10 
phút. Các thành phần của phản ứng gồm: 
Dream buffer nồng độ là 1,2X, dNTP nồng 
độ là 0,25mM, MgCl2 nồng độ là 3mM, 
Dream Taq DNA polymerase nồng độ là 
2,5U, primer (VrrA, pagA, capA) nồng 
độ là 0,6µM, primer (ypo2088, pla, caf1) 
nồng độ là 0,1µM, tỉ lệ DNA template của 
Y. pestis/B. anthacis là 1/10.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hoàng Thị Thu Hà và Cs (2012). 
PCR chẩn đoán nhanh, chính xác vi khuẩn 
Bacillus anthracis trực tiếp từ bệnh phẩm 
lâm sàng và môi trường, Y học dự phòng, 
số 8, tr.155-163.
2. Nguyễn Thái Sơn và Cs (2011). 
Nghiên cứu một số biện pháp ứng phó tình 
huống bị tấn công bởi tác nhân sinh học 
trực khuẩn than (Bacillus anthracis), Báo 
cáo tổng kết nhiệm vụ cấp Bộ QP, dự án 
A037.
3. Nguyễn Thái Sơn và Cs (2011). 
Nghiên cứu một số biện pháp ứng phó tình 
huống bị tấn công bởi tác nhân sinh học vi 
khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis), Báo cáo 
tổng kết nhiệm vụ cấp Bộ QP, dự án A037.
4. Henegariu O., Heerema N. A., 
Dlouhy S. R. et al. (1997), “Multiplex 
PCR: critical parameters and step-by-step 
protocol”, Biotechniques, 23(3), pp. 504-
11.
5. Leggiadro R. J. Bioterrorism: a 
clinical reality, Pediatr Ann. 2007, 36(6), 
pp. 352-8.
6. Matero P., Pasanen T., Laukkanen 
R. et al (2009). Real-time multiplex PCR 
assay for detection of Yersinia pestis and 
Yersinia pseudotuberculosis, APMIS, 
117(1), pp. 34-44.
7. Safari Foroshani N., Karami A., 
Pourali F (2013). Simultaneous and Rapid 
Detection of Salmonella typhi, Bacillus 
anthracis, and Yersinia pestis by Using 
Multiplex Polymerase Chain Reaction 
(PCR), Iran Red Crescent Med J., 15(11), 
pp. e9208.
8. Spotts Whitney E. A., Beatty M. E., 
Taylor T. H., Jr. et al. (2003) Inactivation 
of Bacillus anthracis spores, Emerg Infect 
Dis, 9(6), pp. 623-7.
9. Stewart A., Satterfield B., Cohen M. 
et al. (2008) A quadruplex real-time PCR 
assay for the detection of Yersinia pestis 
and its plasmid, J Med Microbiol. 57(Pt 
3), pp. 324-31.