Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chẩn đoán bacillus anthracis

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 17 
THIẾT KẾ CHỨNG NỘI TẠI TÁI TỔ HỢP TRONG PHẢN ỨNG 
MULTIPLEX PCR CHẨN ĐOÁN BACILLUS ANTHRACIS 
 Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn** 
 Đoàn Trọng Tuyên***; Nghiêm Ngọc Minh**** 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng multiplex PCR chẩn đoán Bacillus 
anthracis gây bệnh. Vật liệu và phương pháp: canh khuẩn 0,5 McFarland chủng B. anthacis Ba1 
gây bệnh lƣu giữ tại Học viện Quân y đƣợc bất hoạt ở 121°C/20 phút trƣớc khi tách chiết ADN 
tổng số. Phân lập chính xác một đoạn gen lef (IC1) để tạo dòng phụ pJET1.2-IC1. Qua các công 
đoạn tái tổ hợp, IC1 đƣợc gắn vào vector pJET1.2-capA (sau khi cả hai đƣợc cắt bằng enzym 
hạn chế BamHI và NdeI) trong phản ứng lai. Chứng nội tại plasmid tái tổ hợp pJET1.2-capA-
IC1 đƣợc khuếch đại đồng thời trong phản ứng mPCR (chứa ba cặp mồi vrrAF1/R1, 
pagAF1/R1 và capAF1/R1) chẩn đoán B. anthracis gây bệnh. Kết quả và kết luận: đã thiết kế 
thành công một chứng nội tại tái tổ hợp trong phản ứng mPCR chẩn đoán chính xác B. anthracis. 
Bổ sung chứng nội tại này vào các mẫu kiểm tra trƣớc lúc tách chiết ADN để xác minh kết quả 
chẩn đoán, loại bỏ hiện tƣợng âm tính giả. 
* Từ khóa: Bacillus anthracis; Âm tính giả; Chứng nội tại; PCR chẩn đoán; PCR đa mồi; 
Tái tổ hợp. 
Development of a Recombinant Internal Amplification Control in 
Multiplex PCR Assay for Diagnosis of Pathogenic Bacillus anthracis 
Summary 
Objective: To design and develop a recombinant internal amplification control in multiplex PCR 
assay for diagnosis of pathogenic B. anthracis. Materials and methods: Pathogenic B. anthracis 
Ba1 strain was inactivated at 121
0
C/20 minutes before extracted genomic DNA. Lef gene (IC1) was 
high fidelity amplified, cloned in pJET1.2-blunt. Using recombinant DNA techniques, gel purified 
IC1 gene and pJET1.2-capA vector products were simultaneously digested by restriction enzymes 
BamHI and NdeI, and then they were ligated using T4 DNA ligase to create an amplicon 1,000 
bp larger than the diagnostic amplicons. Internal amplification control pJET1.2-capA-IC1 was 
simultaneously amplified in a multiplex PCR assay with three primer pairs including vrrAF1/R1, 
pagAF1/R1 and capAF1/R1 for diagnosis of pathogenic B. anthracis. Results and conclusion: 
* Học viện Quân y 
** Bệnh viện Quân y 103 
*** Viện Y học Dự phòng Quân đội 
**** Viện Nghiên cứu Hệ Gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng ([email protected]) 
Ngày nhận bài: 07/04/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/06/2015 
 Ngày bài báo được đăng: 13/07/2015 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 18 
We designed and developed successfully a recombinant internal amplification control in a 
multiplex PCR assay for accurate diagnosis of B. anthracis. This internal amplification control 
was added in the samples before DNA extraction to exclude false negative results. 
* 
Key words: Bacillus anthracis; False negative; Diagnostic PCR; Internal amplification control; 
Multiplex PCR; Recombinant. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Chẩn đoán phân tử, đặc biệt là các 
phƣơng pháp dựa trên PCR đã đƣợc ứng 
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ y 
học, môi trƣờng hay khoa học hình sự... 
Tuy nhiên, một nhƣợc điểm lớn trong hầu 
hết các công bố đều ít đề cập đến chứng 
nội tại (internal amplification control - IC) 
[6] - thành phần cần thiết và gần nhƣ bắt 
buộc trong các phản ứng PCR chẩn đoán. 
Chứng nội tại là một đoạn axÝt nucleic 
tinh khiết (có thể là plasmid chứa ADN 
hay sản phẩm PCR tinh sạch) có trình tự 
khác biệt với gen đích, đƣợc khuếch đại 
đồng thời cùng với ADN mẫu trong một 
ống phản ứng. Mục đích của chứng nội 
tại là xác minh kết quả chẩn đoán, tránh 
hiện tƣợng âm tính giả, gây sai sót trong 
chẩn đoán [2, 5]. Do đƣợc bổ sung vào 
mẫu từ quá trình tách chiết axÝt nucleic 
hay trong thực hiện PCR nên chứng nội 
tại có thể kiểm soát đƣợc toàn bộ quá 
trình chuẩn bị mẫu và thực hiện PCR 
(thiết bị luân nhiệt, các thành phần trong 
master mix PCR hay các chất ức chế có 
trong từng mẫu cụ thể) tùy thuộc vào thời 
điểm bổ sung chứng nội tại [7]. 
 Trong chẩn đoán vi sinh phân tử, các 
mẫu bệnh phẩm, thực phẩm hay môi 
trƣờng có nhiều thành phần, yếu tố cạnh 
tranh với vi sinh vật ảnh hƣởng đến hiệu 
quả quá trình tách chiết cũng nhƣ PCR, 
đặc biệt là giảm giới hạn phát hiện và gây 
hiện tƣợng âm tính giả. Các chất ức chế 
PCR có thể đƣợc tìm thấy trong dịch cơ 
thể ngƣời, từ đất, tế bào vi khuẩn và ADN 
khác không phải là ADN đích [2]. Nhƣ vậy, 
sự có mặt của chứng nội tại biểu hiện 
bằng band có kích thƣớc xác định xuất 
hiện ở tất cả các mẫu trên bản gel điện di, 
nhất là trong trƣờng hợp mẫu âm (khi 
không xuất hiện band đích của gen chẩn 
đoán), cho phép phân biệt kết quả âm 
tính thật và âm tính giả. Chứng nội tại có 
thể đƣợc chia thành hai loại dựa vào nhu 
cầu sử dụng mồi, đó là chứng nội tại cạnh 
tranh (competitive IC - sử dụng chung với 
cặp mồi chẩn đoán) và chứng nội tại 
không cạnh tranh (noncompetitively IC - 
sử dụng cặp mồi riêng rẽ, khác biệt với 
mồi chẩn đoán). Trong đó, hƣớng thiết kế 
chứng nội tại cạnh tranh có nhiều ƣu điểm 
hơn, nhất là trong phản ứng mutiplex PCR 
(mPCR - PCR đa mồi) đƣợc khuyến cáo 
sử dụng [6]. Điều này đƣợc lý giải do 
trong phản ứng mPCR đã có sự tham gia 
của nhiều cặp mồi, khi thiết kế bổ sung 
một cặp mồi IC (theo hƣớng chứng nội tại 
không cạnh tranh) có thể sẽ ảnh hƣởng 
đến các cặp mồi chẩn đoán. Mặt khác, 
việc tối ƣu thêm một cặp mồi mới trong 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 19 
phản ứng mPCR sẽ phải thực hiện lại 
các công đoạn, đòi hỏi nhiều thời gian và 
tốn kém. 
Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng 
để thiết kế chứng nội tại cạnh tranh cho 
PCR là tái tổ hợp gen, tạo plasmid chứa 
đoạn gen xác định cho sản phẩm PCR có 
kích thƣớc phân biệt với band đích chẩn 
đoán [2]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi 
thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp để ứng 
dụng trong chẩn đoán chính xác Bacillus 
anthacis (B. anthacis) gây bệnh ở Việt Nam 
bằng kỹ thuật mPCR. Chứng nội tại cạnh 
tranh đƣợc thiết kế theo hƣớng tăng kích 
thƣớc sản phẩm đích mà vẫn sử dụng 
chung một trong các cặp mồi chẩn đoán 
[2, 6]. Nhƣ vậy, không phải thiết kế thêm 
cặp mồi mới cho IC và rút ngắn công 
đoạn tối ƣu. Chiến lƣợc thiết kế chứng 
nội tại trong nghiên cứu này cũng có thể 
đƣợc áp dụng trong chẩn đoán chính xác 
các tác nhân vi sinh khác dựa trên PCR. 
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Vật liệu nghiên cứu. 
- Chủng vi khuẩn: chủng B. anthacis Ba1 
lƣu giữ tại “Ngân hàng Chủng và Gen” 
của Học viện Quân y đƣợc xác định có 
đầy đủ độc lực bằng PCR và thử nghiệm 
trên động vật (chuột nhắt trắng) sau khi 
định danh bằng card Api 50CH (BioMérieux). 
Sử dụng chủng Bacillus cereus Bc1 
(B. cereus, Hãng Microbiologics - Mỹ) kiểm 
tra phản ứng chéo với B. anthacis trong 
phản ứng mPCR. 
- Vector: sử dụng plasmid pJET1.2-blunt 
(Hãng Thermo Scientific) tạo dòng phụ 
cũng nhƣ tạo dòng chứng nội tại. Vector 
tái tổ hợp pJET1.2-capA chứa toàn bộ 
gen capA (thuộc plasmid độc lực pXO2) 
chủng B. anthacis Ba1 đã đƣợc thiết lập 
trong nghiên cứu trƣớc đây. 
2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 
Tách chiết ADN và PCR: bất hoạt chủng 
vi khuẩn ở điều kiện 121oC/20 phút, sau 
đó tách ADN tổng số theo quy trình của 
nhà sản xuất (QIAamp ADN mini kit). Cặp 
mồi tách dòng một đoạn gen lef với đầu 5’ 
có trình tự nhận biết của enzym hạn chế 
BamHI và NdeI (đƣợc thiết kế dựa trên 
trình tự gen lef trên Genbank kết hợp với 
kết quả giải trình tự gen lef chủng B. anthacis 
Ba1 - dữ liệu không trình bày) và đƣợc 
tổng hợp bởi IDT (Mỹ) (IC1F-BamHI/R-
NdeI) (bảng 1). Phản ứng tổng hợp ADN 
có độ chính xác cao, thực hiện trên máy 
PCR Eppendorf Mastercycler proS (Đức) 
sử dụng hóa chất PCR high fidelity (Hãng 
Thermo Scientific). Thành phần PCR: Phusion 
Master kết hợp HF Buffer 1X; 0,25 μM 
mồi xuôi, mồi ngƣợc, ~ 10 ng ADN khuôn, 
điều chỉnh H2O đủ thể tích 20 μl. Chu 
trình nhiệt: biến tính 98oC trong 30 giây, 
khuếch đại 30 chu kỳ (98oC, 8 giây; 58oC, 
20 giây; 72oC, 20 giây), sau đó hoàn 
thành kéo dài chuỗi ở 72º trong 6 phút. 
Sản phẩm PCR tinh sạch IC1 (GeneJet 
PCR purification kit, Hãng Thermo Scientific) 
đƣợc sử dụng để tạo dòng phụ cho thiết 
lập chứng nội tại. 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 20 
Thiết lập chứng nội tại tái tổ hợp: thông 
qua các giai đoạn tái tổ hợp, chứng nội tại 
đƣợc thiết kế qua các bƣớc tóm tắt nhƣ 
sau: tạo dòng phụ sản phẩm PCR tinh sạch 
IC1 trong vector pJET1.2/blunt (Hãng 
Thermo Scientific) tạo plasmid pJET1.2-IC1. 
Các công đoạn thực hiện quá trình tách 
dòng đƣợc trình bày chi tiết trong nghiên 
cứu trƣớc của tác giả [1]. Thu hồi sản 
phẩm IC1 bằng tinh sạch gel (Genejet gel 
extraction kit, Hãng Thermo Scientific) 
(sau khi cắt plasmid pJET1.2-IC1 bằng 
cặp enzym hạn chế BamHI và NdeI), gắn 
vào plasmid pJET1.2-capA (sau khi đƣợc 
cắt mở vòng cũng bằng cặp enzym hạn 
chế này). Qua quá trình tách dòng, plasmid 
pJET1.2-capA-IC1 tạo ra đƣợc nhân bản 
với số lƣợng lớn trong tế bào E. coli 
DH5α (One Shot Max Efficiency DH5α - 
Invitrogen). Kiểm tra plasmid tái tổ hợp 
bằng PCR khuẩn lạc, cắt bằng enzym 
hạn chế và giải trình tự. Toàn bộ quá trình 
tạo dòng chứng nội tại tái tổ hợp đƣợc 
mô tả trong hình 1. 
Multiplex PCR chứa chứng nội tại: 
phản ứng mPCR chứa chứng nội tại với 
ba cặp mồi xác định các gen vrrA, pagA, 
capA chẩn đoán chính xác B. anthracis gây 
bệnh có thành phần nhƣ sau: 1X Dream 
Taq Buffer; 2,0 U Dream Taq Polymerases; 
dNTPs 0,25 mM mỗi loại; 0,5 - 0,6 μM 
mồi xuôi, mồi ngƣợc mỗi loại, khoảng 
10 ng ADN khuôn, điều chỉnh H2O đủ thể 
tích 25 μl (Hãng Thermo Scientific). Chu 
trình mPCR: biến tính 94oC/4 phút, tiếp theo 
là 30 chu kỳ (94oC/45 giây; 56oC/40 giây; 
72oC/40 giây), sau đó hoàn thành kéo dài 
chuỗi ở 72º trong 6 phút. Sản phẩm mPCR 
đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 
1,5% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromid 
và chụp ảnh dƣới ánh sáng tử ngoại 
(máy UVP Eppendorf). 
Bảng 1: Các mồi sử dụng trong nghiên cứu. 
TÊN MỒI TRÌNH TỰ (5’ - 3’) KÍCH THƢỚC (bp) 
Tách dòng 
IC1F/BamHI 
IC1R/NdeI 
GTGGATCCTATCTTGCCAGCATCCGT 
TCCATATGAAAGAGGCAGCAGAAAAGC 
654 
mPCR 
vrrAF1 
vrrAR1 
CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA 
CCTCGCGCACTTCTTTTTCT 
222 
pagAF1 
pagAR1 
AAATGGAGCACGGCTTCTGA 
AGCCTGTATCCACCCTCACT 
751 
capAF1 
capAR1 
TGACGATGACGATGGTTGGT 
GCTTCCTGTCTAGGACTCGG 
610 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 21 
Hình 1: Sơ đồ quá trình tạo dòng chứng nội tại 
 plasmid tái tổ hợp pJET1.2-capA-IC1. 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 22 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
1. Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp. 
Quá trình tạo dòng phụ pJET1.2-IC1 là bƣớc đầu tiên để chuẩn bị nguyên liệu cho 
tạo dòng chứng nội tại tái tổ hợp. Kết quả phân lập một đoạn gen lef (IC1) và kiểm tra 
vector pJET1.2-IC1 tái tổ hợp đƣợc minh họa ở hình 2. 
Hình 2: Quá trình tạo dòng phụ trong vector pJET1.2-IC1. 
A) Kiểm tra sản phẩm tổng hợp gen lef (IC1) bằng Phusion ADN polymerase trên gel agrose 
1,2 %. M: thang ADN chuẩn 100 bp (Hãng Thermo Scientific); 1: sản phẩm tổng hợp một phần 
gen lef chủng B. anthracis Ba1 bằng cặp mồi IC1F/BamHI và IC1R/NdeI. 
B) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1,2%, M: thang ADN 
chuẩn 1 kb (Hãng Thermo Scientific); 1 - 3: các dòng khuẩn lạc 1 - 3 chứa vector tái tổ hợp 
pJET1.2-IC1. 
Bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI trong 
phản ứng High Fidelity PCR đã khuếch 
đại sản phẩm đặc hiệu thể hiện bằng một 
band có kích thƣớc khoảng 0,65 kb, đúng 
với tính toán lý thuyết (654 bp) (hình 1A). 
Kiểm tra sự có mặt sản phẩm IC1 này 
trong vector tái tổ hợp pJET1.2-IC1 bằng 
PCR từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi trên 
vector là pJET1.2F/R. Theo dự tính, nếu 
đoạn IC1 gắn đƣợc vào vector thì sản 
phẩm PCR từ khuẩn lạc có kích thƣớc 
756 bp (gồm kích thƣớc của IC1 và đoạn 
ADN hai đầu trình tự trên vector có tổng 
kích thƣớc 118 bp). Kết quả PCR cả ba 
dòng khuẩn lạc đều cho sản phẩm có kích 
thƣớc theo tính toán (hình 2B). Nhƣ vậy, 
quá trình tạo dòng phụ trong vector 
pJET1.2-IC1 đã thành công, sẵn sàng 
cho các bƣớc tạo dòng chứng nội tại tái 
tổ hợp tiếp theo. 
 Sử dụng cặp enzym hạn chế là BamHI 
và NdeI để cắt các vector tái tổ hợp 
pJET1.2-IC1 và pJET1.2-capA. Đoạn IC1 
(kích thƣớc 0,65 kb từ vector pJET1.2-
IC1) và phần còn lại của vector pJET1.2-
capA (kích thƣớc khoảng 4 kb) đã đƣợc 
tinh sạch trên gel (hình 3A) và nối ghép tạo 
thể tái tổ hợp pJET1.2-capA-IC1. Cắt kiểm 
tra plasmid tái tổ hợp này bằng enzym 
hạn chế cho các sản phẩm đƣợc minh 
họa ở hình 3B. 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 23 
Hình 3: Quá trình tạo dòng trong vector pJET1.2-capA-IC1. 
A) Các sản phẩm cắt vector bằng cặp enzym hạn chế BamHI và NdeI trên bản điện di gel 
agrose 1,2%. M: thang ADN chuẩn 1 kb (Hãng Thermo Scientific); 1: vector tái tổ hợp pJET1.2-IC1; 
2: vector tái tổ hợp pJET1.2-capA. 
B) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET1.2-capA-IC1 bằng enzym hạn chế, M: thang ADN 
chuẩn 1 kb (Hãng Thermo Scientific); 1 - 3: sản phẩm cắt trên các dòng khuẩn lạc 1 - 3 bằng 
cặp enzym hạn chế NdeI và BamHI; 4 - 6: sản phẩm cắt trên các dòng khuẩn lạc 1 - 3 bằng 
enzym hạn chế BglII. 
Các plasmid từ ba dòng khuẩn lạc đƣợc 
cắt bằng BamHI và NdeI đều cho hai band 
có kích thƣớc tƣơng ứng 0,65 và 4 kb 
(đúng theo thiết kế). Với enzym hạn chế 
BglII, có hai trình tự nhận biết trên vùng 
đa điểm cắt của vector pJET1.2/blunt và 
một điểm cắt trong đoạn gen IC1, theo 
tính toán lý thuyết nếu plasmid tái tổ hợp 
pJET1.2-capA-IC1 đƣợc thiết kế thành 
công sẽ đƣợc enzym này cắt tạo ba sản 
phẩm có kích thƣớc 851, 858 và 2.900 bp 
(trƣờng hợp gắn xuôi chiều), ở trƣờng hợp 
gắn ngƣợc chiều, sản phẩm cắt sẽ có kích 
thƣớc 702, 1.007 và 2.900 bp. Trong trƣờng 
hợp này, khi sử dụng enzym hạn chế là 
BglII đã cho hai band có kích thƣớc 
khoảng 0,85 (trên lý thuyết là hai band 
kích thƣớc 851, 858 bp, chỉ sai khác vài 
nucleotid nên không thể tách biệt trên bản 
điện di mà chỉ thể hiện bằng một band 
kích thƣớc khoảng 0,85 kb và 2,9 kb, 
ngoài ra không có band phụ). Nhƣ vậy, 
có thể khẳng định, đã thiết kế thành công 
plasmid chứng nội tại pJET1.2-capA-IC1. 
Kết quả giải trình tự plasmid tái tổ 
hợp pJET1.2-capA-IC1 sử dụng cặp mồi 
pJET1.2F/R đã khẳng định đúng trình tự 
nhƣ thiết kế ban đầu (dữ liệu không trình 
bày). Plasmid tái tổ hợp này chứa trình 
tự nhận biết của cặp mồi chẩn đoán 
B. anthracis là capAF1/R1, cho sản phẩm 
khuếch đại kích thƣớc 1.000 bp. 
2. Xác định B. anthracis gây bệnh 
bằng mPCR chứa chứng nội tại tái 
tổ hợp. 
Chứng nội tại pJET1.2-capA-IC1 đƣợc 
sử dụng trong chẩn đoán B. anthracis gây 
bệnh bằng mPCR. Phản ứng mPCR đƣợc 
thiết kế với ba cặp mồi là vrrAF1/R1, 
pagAF1/R1 và capAF1/R1 để xác định sự 
có mặt của các gen tƣơng ứng đặc trƣng 
cho B. anthracis gây bệnh. Sản phẩm 
mPCR có kích thƣớc lần lƣợt là 222, 751 và 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 24 
610 bp xác định các gen tƣơng ứng vrrA, 
pagA và capA cùng với sản phẩm khuếch 
đại chứng nội tại tái tổ hợp (sử dụng 
chung cặp mồi capAF1/R1, cho sản phẩm 
có kích thƣớc 1.000 bp) dễ dàng phân 
biệt trên bản điện di agarose 1,5% (hình 4). 
Hình 4: Xác định vi khuẩn B. anthracis 
gây bệnh bằng mPCR chứa chứng nội 
tại tái tổ hợp. 
M: marker 100 bp (Hãng Thermo 
Scientific); ĐC (+): đối chứng dƣơng sử 
dụng plasmid tái tổ hợp chứa các gen 
pagA, capA và vrrA; ĐC (-): đối chứng âm 
sử dụng chủng B. cereus Bc1; Ba1: mẫu 
kiểm tra. 
BÀN LUẬN 
Trong chẩn đoán phân tử, chứng nội 
tại rất cần thiết và gần nhƣ bắt buộc để 
loại trừ hiện tƣợng âm tính giả [2]. Chứng 
nội tại đã khắc phục đƣợc những hạn chế 
của chứng ngoại (external control) - vẫn 
đƣợc dùng phổ biến. Do chứng ngoại 
đƣợc bổ sung vào một ống phản ứng 
tách biệt (mẫu đối chứng), khuếch đại 
song song với mẫu chẩn đoán trong cùng 
điều kiện nên không thể kiểm soát đƣợc 
hiện tƣợng âm tính giả trên các mẫu khác 
nhau [4, 7]. Nói cách khác, ngoài khả 
năng kiểm soát đƣợc thiết bị luân nhiệt và 
thành phần trong master mix (nhƣ chứng 
ngoại) thì chứng nội tại còn có thể kiểm 
soát đƣợc quá trình tách chiết axit nucleic 
và những chất ức chế ảnh hƣởng trong 
phản ứng PCR trên từng mẫu cụ thể. 
Để thiết kế chứng nội tại cạnh tranh, 
một số phƣơng pháp đã đƣợc công bố sử 
dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp. Bao gồm: 
đƣa trình tự gen đích vào trong vector và 
loại bỏ hoặc chèn một trình tự xác định 
giữa hai đầu trình tự của mồi chẩn đoán 
[3]; sử dụng phƣơng pháp thiết kế mồi 
overlapping [2, 9, 10]... để tạo các sản 
phẩm khuếch đại khác nhau khi sử dụng 
chung một cặp mồi. Nhƣ vậy, chứng nội 
tại có thể có kích thƣớc bé hơn hoặc lớn 
hơn sản phẩm gen đích. Tham khảo các 
nghiên cứu trƣớc đó, chúng tôi đã thiết kế 
IC theo cách tăng kích thƣớc sản phẩm 
đích. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu không 
sử dụng theo phƣơng pháp overlapping 
thƣờng dùng. Theo cách này, cần phải 
thiết kế mồi dài có đầu 5’ nhô ra (over 
hanging ends) chính là trình tự mồi chẩn 
đoán, trong khi đó, đầu 3’ bổ sung với trình 
tự ADN xác định (trên plasmid pUC19) 
[2]. Trong nghiên cứu này, IC đƣợc thiết 
kế sử dụng cặp mồi capAF1/R1. Trên cơ 
sở có sẵn plasmid pJET1.2-capA (chứa 
trình tự nhận biết của cặp mồi capAF1/R1), 
loại bỏ một đoạn ADN giữa hai đầu trình 
tự của mồi chẩn đoán (264 bp) và thay 
bằng một đoạn ADN khác có kích thƣớc 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 25 
lớn hơn (chính là đoạn gen lef-IC1-654 bp) 
tạo chứng nội tại là plasmid tái tổ hợp có 
tên pJET1.2-capA-IC1. 
Quá trình tạo dòng phụ vector pJET1.2-
IC1 (hình 2) với mục đích thu đƣợc sản 
phẩm gen lef với số lƣợng lớn và độ thuần 
nhất cao. Enzym sử dụng để phân lập gen 
lef là phusion high-fidelity ADN polymerase 
(khác biệt với Taq polymerase vẫn thƣờng 
đƣợc sử dụng). Đây là enzym có hiệu 
suất khuếch đại lớn với độ chính xác và 
tốc độ cao đảm bảo sản phẩm phân lập 
có trình tự nhƣ mong muốn. Một điểm 
quan trọng nữa là cặp mồi phân lập gen 
lef đƣợc thiết kế có chứa trình tự nhận 
biết của cặp enzym hạn chế BamHI và 
NdeI ở đầu 5’. Hai enzym cắt hạn chế này 
đƣợc lựa chọn theo các tiêu chí sau: mỗi 
enzym chỉ có một điểm cắt trên plasmid 
pJET1.2-IC1 (nhờ thiết kế cặp mồi IC1F-
BamHI/R-NdeI) cũng nhƣ pJET1.2-capA, 
đặc biệt với pJET1.2-capA, vị trí nhận biết 
của các enzym này nằm ở giữa hai đầu 
trình tự mồi chẩn đoán capAF1/R1 (hình 1). 
Khi thao tác với cặp enzym này sẽ tạo ra 
các sản phẩm ADN đầu dính, thuận lợi 
cho quá trình kiểm tra thể biến nạp và nối 
ghép gen. 
Trong phản ứng mPCR chẩn đoán B. 
anthracis gây bệnh, chúng tôi sử dụng ba 
cặp mồi đặc hiệu chỉ thị cho vi khuẩn than 
gây bệnh với gen đích trên nhiễm sắc thể 
là vrrA (gen thƣờng đƣợc dùng trong 
chẩn đoán) kết hợp với gen pagA, capA 
để kiểm tra sự có mặt của các plasmid 
độc lực pXO1, pXO2 tƣơng ứng. Đồng 
thời, sự có mặt của chứng nội tại tái tổ 
hợp đƣợc bổ sung vào lúc tách chiết ADN 
với lƣợng tối thiểu vừa đủ để kiểm soát 
quá trình tách chiết cũng nhƣ mPCR, loại 
bỏ hiện tƣợng âm tính giả. Sử dụng đối 
chứng âm là vi khuẩn chủng B. cereus 
Bc1 để kiểm tra phản ứng chéo. B. cereus 
là vi khuẩn phân bố nhiều trong môi trƣờng, 
cùng chi Bacillus, nhóm “B. cereus”. Trên 
bản điện di, ở tất cả các mẫu đối chứng 
và mẫu kiểm tra đều xuất hiện band 
chứng nội tại có kích thƣớc đúng nhƣ tính 
toán lý thuyết, điều này chứng tỏ quá 
trình tách chiết và mPCR đảm bảo, theo 
đó các kết quả xác định sau đây là đáng 
tin cậy. Ở mẫu đối chứng (-), ngoài band IC, 
chỉ xuất hiện band có kích thƣớc 222 bp - 
tƣơng ứng với gen vrrA, ngoài ra không 
xuất hiện thêm band nào khác. Điều này 
là phù hợp vì đối chứng âm sử dụng là 
một chủng B. cereus, gen vrrA cũng có 
mặt trong các loài thuộc nhóm “B. 
cereus”. Trong khi đó, mẫu đối chứng (+) 
xuất hiện cả ba gen đích là vrrA, pagA và 
capA, chỉ những chủng có đầy đủ ba gen 
này mới có đầy đủ độc lực. Mẫu kiểm tra 
là Ba1 chủng B. anthracis Ba1 xuất hiện 
đầy đủ ba band đích có kích thƣớc đúng 
với mẫu đối chứng (+), đƣợc xác định là 
mẫu B. anthracis gây bệnh [3]. Một đặc 
điểm khi thiết kế chứng nội tại cho phản 
ứng mPCR đó là, ngoài các thông số cần 
lƣu ý với các cặp mồi chẩn đoán (nhƣ Tm, 
thành phần base, tránh cấu trúc bậc 2...), 
kích thƣớc sản phẩm khuếch đại chứng 
nội tại cũng rất quan trọng. Với những 
sản phẩm khuếch đại kích thƣớc bé sẽ 
đƣợc ƣu tiên và tổng hợp hiệu quả hơn 
so với kích thƣớc lớn [5]. Trong nghiên 
cứu này, chứng nội tại đƣợc thiết kế 
theo hƣớng tăng kích thƣớc. Chứng nội tại 
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 
 26 
pJET1.2-capA-IC1 khi đƣợc khuếch đại 
đồng thời trong phản ứng mPCR có kích 
thƣớc 1.000 bp, lớn hơn ba sản phẩm 
khuếch đại gen chẩn đoán pagA, capA và 
vrrA tƣơng ứng 751, 610 và 222 bp. Đặc 
điểm này có vai trò quan trọng trong phản 
ứng mPCR, khi quá trình khuếch đại đồng 
thời diễn ra, các sản phẩm có kích thƣớc 
bé hơn của gen chẩn đoán sẽ đƣợc ƣu 
tiên tạo thành [5, 8]. Đây là ƣu điểm nổi 
bật của chứng nội tại đƣợc thiết kế trong 
công trình này. 
KẾT LUẬN 
Đã thiết kế thành công chứng nội tại 
dƣới dạng plasmid tái tổ hợp pJET1.2-
capA-IC1 trong phản ứng mPCR chẩn 
đoán B. anthracis gây bệnh. Chứng nội 
tại này đƣợc bổ sung vào mẫu trƣớc lúc 
tách chiết ADN và khuếch đại trong phản 
ứng mPCR có kích thƣớc 1.000 bp cho 
phép xác minh kết quả chẩn đoán, tránh 
hiện tƣợng âm tính giả. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn. 
Nghiên cứu toàn bộ trình tự gen pagA trên 
một số chủng Bacillus anthracis phân lập ở 
miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y - Dƣợc học 
Quân sự. 2015, 40 (3), tr.135-143. 
2. Abdulmawjood A, Roth S, Bulte M. Two 
methods for construction of internal amplification 
controls for the detection of Escherichia coli 
O157 by polymerase chain reaction. Mol Cell 
Probes. 2002, 16 (5), pp.335-339. 
3. Brightwell G, Pearce M, Leslie D. 
Development of internal controls for PCR 
detection of Bacillus anthracis. Mol Cell Probes. 
1998, 12 (6), pp.367-377. 
4. Brunstein J. Process controls: internal 
and external. MLO Med Lab Obs. 2013, 45 (11), 
pp.42-43. 
5. Hartman LJ, Coyne SR, Norwood DA. 
Development of a novel internal positive control 
for Taqman based assays. Mol Cell Probes. 
2005, 19 (1), pp.51-59. 
6. Hoorfar J, Malorny B, Abdulmawjood A 
et al. Practical considerations in design of 
internal amplification controls for diagnostic 
PCR assays. J Clin Microbiol. 2004, 42 (5), 
pp.1863-1868. 
7. Kalle E, Gulevich A, Rensing C. External 
and semi-internal controls for PCR amplification 
of homologous sequences in mixed templates. 
J Microbiol Methods. 2013, 95 (2), pp.285-294. 
8. Maaroufi Y, de Bruyne JM, Duchateau V 
et al. Development of a multiple internal control 
for clinical diagnostic real-time amplification 
assays. FEMS Immunol Med Microbiol. 2006, 
48 (2), pp.183-191. 
9. Muller FM, Schnitzler N, Cloot O et al. 
The rationale and method for constructing 
internal control DNA used in pertussis 
polymerase chain reaction. Diagn Microbiol 
Infect Dis. 1998, 31 (4), pp.517-523. 
10. Sachadyn P, Kur J. The construction 
and use of a PCR internal control. Mol Cell 
Probes. 1998, 12 (5), pp.259-262.