Thẩm định phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để ứng dụng trong đánh giá độ ổn định của capsaicin

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 5 
THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG BẰNG 
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỂ ỨNG DỤNG 
TRONG ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAPSAICIN 
Nguyễn Đức Cường1; Nguyễn Chí Đức Anh2; Đỗ Thị Phương Chi2 
 Nguyễn Tiến Đạt2; Đào Minh Hạnh2; Đỗ Quyên2 
 Nguyễn Thanh Bình2; Nguyễn Thạch Tùng2 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: thẩm định phương pháp định lượng capsaicin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, 
qua đó ứng dụng trong nghiên cứu đánh giá độ ổn định của capsaicin. Phương pháp: thẩm định 
các chỉ tiêu khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. 
Đánh giá sự phân hủy oxy hóa của capsaicin trong dung dịch hydroperoxid 3% có hay không có 
các chất chống oxy hóa trong những khoảng thời gian khác nhau bằng phương pháp sắc ký 
lỏng hiệu năng cao đã được thẩm định. Natri edetat, natri metabisulfit, D,L-methionin, natri 
hydrosulfit, hydroxytoluen butylat được sử dụng làm các chất chống oxy hóa trong nghiên cứu. 
Kết quả: các chỉ tiêu khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu 
năng cao đã được thẩm định. Capsaicin bị phân hủy mạnh trong dung dịch hydroperoxid 3%. 
Trong số các chất chống oxy hóa được thử nghiệm, hydroxytoluen butylat là chất chống oxy 
hóa hiệu quả nhất trong việc bảo vệ capsaicin. Kết luận: đã thẩm định được phương pháp định 
lượng capsaicin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Lựa chọn được chất chống oxy hóa có tác 
dụng tốt nhất trong bảo vệ dược chất là hydroxytoluen butylat. 
* Từ khóa: Capsaicin; Độ ổn định; Oxy hóa; Hydroxytoluen butylat. 
A High Performance Liquid Chromatography Quantification 
Method of Capsaicin for Applying in Stability Assessment 
Summary 
Objectives: To validate methodology for the determination of capsaicin content by high 
performance liquid chromatography and apply in stability assessment. Methods: High performance 
liquid chromatography method was applied to validate linearity, repeatability, accuracy and to 
evaluate the oxidative degradation of capsaicin in 3% hydroperoxide solution with/without 
antioxidants after different periods. Sodium edetate, sodium metabisulfite, D,L-methionin, 
sodium hydrosulfite, butylate hydroxytoluene were used as the antioxidants. Results: The linearity, 
repeatability, accuracy were validated. Capsaicin was strongly degraded in 3% hydroperoxide solution. 
1. Học viện Quân y 
2. Trường Đại học Dược Hà Nội 
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thạch Tùng (nguyenthachtung@hup.edu.vn) 
Ngày nhận bài: 04/04/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/05/2019 
 Ngày bài báo được đăng: 30/05/2019 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 6 
Among the antioxidants, butylate hydroxytoluene proved to be the most effective antioxidant in 
protection of capsaicin. Conclusions: High performance liquid chromatography method for 
the determination of capsaicin content was validated. Butylate hydroxytoluene was selected as 
the best antioxidant in protection of capsaicin. 
* Keywords: Capsaicin; Stability; Oxidation; Butylate hydroxytoluene. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Capsaicinoid là hỗn hợp các alcaloid 
được chiết từ quả Ớt (Capsicum spp.). 
Trong đó, capsaicin (CAP) là thành phần 
chính có nhiều tác dụng sinh học, một 
trong những tác dụng đó là giảm đau tại 
chỗ nên được sử dụng trong điều trị một 
số chứng như đau cơ, đau đầu, đau sau 
phẫu thuật [2, 6]. Gần đây, với việc phát 
hiện ra CAP là chất kích thích thụ thể 
transient receptor potential vanilloid 1 
(TRPV1) đã chứng minh CAP ngoài tác 
dụng giảm đau còn có tác dụng chống 
viêm [6]. Bên cạnh đó, CAP còn được 
chứng minh có vai trò trong ức chế tế bào 
ung thư in vitro, tác dụng bảo vệ dạ dày 
[3, 6]. Tuy nhiên, trong cấu trúc của CAP 
có chứa nhóm chức có khả năng bị oxy 
hóa là nhóm -OH phenol, hơn nữa trong 
mạch nhánh của phân tử còn có một 
nhóm amid dễ bị tấn công bởi các gốc tự 
do, nên CAP kém ổn định. Do đó, việc sử 
dụng các biện pháp chống oxy hóa cho 
CAP ứng dụng trong bào chế chế phẩm 
là cần thiết [4]. Hiện nay, có ít nghiên cứu 
về độ ổn định của CAP. S. Alankar và CS 
tiến hành nghiên cứu độ ổn định của 
CAP, định lượng bằng phương pháp 
HPLC, nhưng chưa đánh giá ảnh hưởng 
của các chất chống oxy hóa đến độ ổn 
định của CAP [8]. Vì vậy, nghiên cứu này 
được tiến hành nhằm: Thẩm định phương 
pháp định lượng CAP bằng HPLC để 
ứng dụng trong đánh giá ảnh hưởng của 
các chất chống oxy hóa đến độ ổn định 
của CAP. 
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG 
PHÁP NGHIÊN CỨU 
1. Nguyên vật liệu và thiết bị. 
Chuẩn thứ cấp CAP (Fluca, hàm lượng 
61,1% CAP, lô: LRAA2843), nonivamid 
(hàm lượng 99,1%, lô: Y0000670) (Sigma 
Aldrich, Đức). 
Các dung môi, hóa chất sử dụng trong 
nghiên cứu đạt tiêu chuẩn HPLC, tiêu 
chuẩn phân tích được Merck (Đức) hoặc 
Sigma Aldrich (Đức) cung cấp. 
Hệ thống HPLC (Agilent, Mỹ) gồm bơm 
1260 Quat Pump VL; detector 1260 DAD VL; 
bộ phận ổn nhiệt 1260 TCC; hệ thống 
tiêm mẫu thủ công. Cột sắc ký: InertSustain 
Phenylhexyl silica gel (250 mm x 4,6 mm; 
5 μm). 
2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 
* Điều kiện sắc ký: 
Capsaicinoid chiết từ Ớt ngoài CAP là 
thành phần có hoạt tính sinh học đáng 
quan tâm, còn chứa một thành phần có 
độc tính là nonivamid. Các phương pháp 
sắc ký thông thường sử dụng cột sắc ký C18 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 7 
đều không có khả năng tách 2 píc CAP và 
nonivamid [1], hơn nữa trong Dược điển 
Việt Nam chưa có chuyên luận về Ớt. 
Nhóm nghiên cứu đánh giá khả năng 
tách 2 píc CAP và nonivamid với điều 
kiện sắc ký như sau [5]: cột InerSustain 
Phenylhexyl silica gel (25 cm x 6,4 mm x 
5 m); detector DAD bước sóng 225 nm. 
Pha động là axít phosphoric 0,1% - acetonitril 
(60:40, v/v). Tốc độ dòng 1,2 ml/phút. 
Nhiệt độ cột 30oC. Thể tích mẫu tiêm 
20 μl. 
Chuẩn bị dung dịch chứa CAP nồng 
độ 0,10 mg/ml và nonivamid nồng độ 
0,02 mg/ml. Quan sát sắc ký đồ để đánh 
giá khả năng tách của 2 chất. 
- Thẩm định phương pháp định lượng 
CAP: theo hướng dẫn của ICH với các 
tiêu chí về khoảng tuyến tính, độ lặp lại, 
độ đúng. 
* Phương pháp đánh giá ảnh hưởng 
của các chất chống oxy hóa đến độ ổn 
định của CAP: 
- Đánh giá ảnh hưởng của chất oxy 
hóa đến độ ổn định của CAP: 
Chuẩn bị dung dịch chuẩn CAP (A) 
nồng độ 1,0 mg/ml trong methanol. 
Chuẩn bị dung dịch thử chứa H2O2 3% 
(B): phối hợp dung dịch chuẩn ở trên với 
dung dịch H2O2 3% vào bình định mức. 
- Đánh giá ảnh hưởng của các chất 
chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP: 
Chuẩn bị 5 mẫu dung dịch thử: ban 
đầu tất cả mẫu được phối hợp dung dịch 
chuẩn A với dung dịch H2O2 3%. Sau đó 
thêm vào mẫu M1 chất hiệp đồng chống 
oxy hóa natri edetat (NaEDTA) 0,5%. 
Mẫu M2, M3, M4 thêm các chất chống 
oxy hóa bản chất thân nước: natri 
metabisulfit 0,5%, D,L-methionin 0,5%, 
natri hydrosulfit 0,5%. Mẫu M5 thêm chất 
chống oxy hóa bản chất thân dầu butylated 
hydroxytoluen (BHT) 0,5%. 
Tất cả dung dịch thử được để ở nhiệt 
độ phòng [7], tránh ánh sáng. Sau những 
khoảng thời gian thích hợp: đối với dung 
dịch B là 0, 7, 14, 21, 28, 42 ngày, đối với 
5 mẫu đánh giá ảnh hưởng của chất 
chống oxy hóa là 0, 14, 28, 42, 56 ngày; 
hút mẫu bổ sung thể tích bằng methanol 
để thu được dung dịch thử chứa 0,2 mg/ml 
CAP, H2O2 0,6%, các chất chống oxy hóa 
và hiệp đồng chống oxy hóa 0,1%. Định 
lượng hàm lượng dược chất còn lại trong 
mẫu bằng phương pháp HPLC. 
* Xử lý số liệu và tính toán kết quả: 
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 
2013. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 
BÀN LUẬN 
1. Kết quả thẩm định phƣơng pháp 
định lƣợng CAP bằng HPLC. 
* Kết quả của phương pháp đánh giá 
khả năng tách 2 píc CAP và nonivamid: 
Tiến hành chạy sắc ký với điều kiện ở 
trên với 2 mẫu: mẫu 1 là dung dịch chuẩn 
CAP nồng độ 0,10 mg/ml; mẫu 2 là dung 
dịch chứa CAP nồng độ 0,10 mg/ml và 
nonivamid nồng độ 0,02 mg/ml, thu được 
hình ảnh 2 sắc ký đồ như sau: 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 8 
Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn CAP. 
Hình 2: Sắc ký đồ của mẫu chứa CAP và nonivamid. 
Từ sắc ký đồ của mẫu 1 và mẫu 2, với điều kiện sắc ký như trên CAP và nonivamid 
tách ra khỏi nhau. Do đó, có thể ứng dụng điều kiện sắc ký trên làm phương pháp định 
lượng CAP. 
* Kết quả thẩm định phương pháp định lượng CAP bằng HPLC: 
Kết quả đánh giá các chỉ tiêu khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng như sau: 
- Khoảng tuyến tính: 
Tiến hành tiêm lần lượt 5 mẫu dung dịch chuẩn nồng độ từ 50 - 250 μg/ml. 
1 
1 
1: CAP fluca 
2 
1: Nonivamid 
2: CAP fluca 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 9 
y = 11.875x + 42.74
R = 0.9997
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 50 100 150 200 250 300
Nồng độ (μg/ml)
Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ CAP. 
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 50 - 250 μg/ml, đường biểu diễn mối 
tương quan giữa diện tích píc và nồng độ CAP là một đường tuyến tính có phương 
trình hồi quy y = 11,875x + 42,74; hệ số tương quan R = 0,9997 > 0,995. Như vậy, 
trong khoảng nồng độ này, diện tích píc phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ CAP. 
- Độ lặp lại: thẩm định độ lặp lại của phương pháp trên ở nồng độ 150 μg/ml. Tiến hành 
tiêm lặp lại 6 mẫu với nồng độ này. 
Bảng 1: Độ lặp lại của phương pháp HPLC. 
Thứ tự 1 2 3 4 5 6 RSD 
Diện tích píc (mAU.s) 1831,5 1842,1 1840,5 1843,1 1872,2 1847,7 0,75% 
Kết quả cho thấy RSD < 2% đáp ứng được yêu cầu của phương pháp phân tích. 
- Độ đúng: thẩm định độ đúng của phương pháp trên ở 3 nồng độ 50, 150, 250 μg/ml, 
mỗi nồng độ tiêm lặp lại 3 lần. 
Bảng 2: Độ đúng của phương pháp HPLC. 
Nồng độ ban đầu Nồng độ phát hiện Độ đúng 
50 49,7 ± 0,7 99,4% 
150 151,5 ± 0,6 101,0% 
250 247,8 ± 0,4 99,1% 
Phương pháp có độ đúng trong khoảng từ 99,1 - 101,0%, đáp ứng yêu cầu của 
phương pháp phân tích. 
Sau khi tiến hành định lượng CAP bằng HPLC cho thấy độ tin cậy của phương 
pháp khi đánh giá 3 chỉ tiêu khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Do đó, có thể áp 
dụng phương pháp này để định lượng CAP trong các mẫu thử. 
D
iệ
n
 t
íc
h
 p
ic
 (
m
A
U
.s
) 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 10 
2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định 
của CAP. 
- Ảnh hưởng của chất oxy hóa đến độ ổn định của CAP: 
Sau khi định lượng CAP còn lại trong dung dịch chứa H2O2 3% theo thời gian, kết 
quả như sau: 
Bảng 3: Tỷ lệ (%) CAP còn lại theo thời gian (n = 3). 
Thời gian (ngày) 0 7 14 21 28 42 
Hàm lượng (%) 100 76,5 ± 3,4 64,2 ± 3,0 50,9 ± 2,7 48,8 ± 2,0 36,5 ± 3,5 
Hình 4: Phần trăm CAP còn lại trong dung dịch H2O2 3% theo thời gian. 
Kết quả cho thấy hàm lượng CAP 
trong dung dịch H2O2 3% giảm nhanh sau 
mỗi khoảng thời gian định lượng. Sau 42 
ngày, lượng CAP trong mẫu chỉ còn 
36,5%. Như vậy, có thể kết luận CAP là 
dược chất dễ bị oxy hóa khi đưa vào 
dạng bào chế, cần bổ sung thêm các chất 
chống oxy hóa thích hợp. 
Tốc độ phản ứng oxy hóa thường phụ 
thuộc vào nồng độ tác nhân oxy hóa trong 
môi trường, do vậy, muốn kết luận về bậc 
của phản ứng oxy hóa CAP bởi H2O2, cần 
thêm dữ liệu nồng độ H2O2 còn lại trong 
môi trường tại các thời điểm. 
Dựa vào cấu trúc phân tử dược chất 
có thể giải thích nguyên nhân CAP bị oxy 
hóa là do trong phân tử có chứa nhóm -
OH phenol dễ bị oxy hóa, ngoài ra trong 
mạch nhánh của phân tử có chứa một 
nhóm amid, là nơi dế bị các gốc tự do tấn 
công [4]. 
- Ảnh hưởng của các loại chất chống 
oxy hóa và hiệp đồng chống oxy hóa đến 
độ ổn định của CAP: 
Các tá dược khảo sát bao gồm natri 
edetat (chất hiệp đồng chống oxy hóa), 
natri metabisulfit, D,L-methionin, natri 
hydrosulfit (các chất chống oxy hóa thân 
nước), BHT (chất chống oxy hóa thân 
dầu). Khi sử dụng đơn độc các chất này 
ở nồng độ 0,1%, chúng ảnh hưởng đến 
độ ổn định của CAP (bảng 3 và hình 5): 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 11 
Bảng 3: Tỷ lệ (%) CAP còn lại theo thời gian trong dung dịch H2O2 chứa các chất 
chống oxy hóa, hiệp đồng chống oxy hóa (n = 3). 
Thời gian 
(ngày) 
Tỷ lệ (%) CAP còn lại theo thời gian 
M1 M2 M3 M4 M5 
0 100 100 100 100 100 
14 81,1 ± 3,5 67,5 ± 6,3 77,3 ± 3,7 59,6 ± 3,6 93,37 ± 2,1 
28 77,5 ± 2,6 50,9 ± 4,6 77,4 ± 4,6 46,3 ± 3,7 91,2 ± 1,1 
42 73,6 ± 3,4 38,7 ± 4,3 77,9 ± 4,0 37,6 ± 2,7 91,5 ± 0,5 
56 72,8 ± 4,0 25,8 ± 4,3 76,2 ± 3,9 30,2 ± 5,1 91,4 ± 1,6 
Hình 5: Ảnh hưởng của chất chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP. 
Như vậy, khi dùng đơn độc ở nồng độ 
0,1%, BHT có tác dụng chống oxy hóa 
tốt nhất. Có thể giải thích: do cấu trúc 
phân tử của BHT cũng có nhóm -OH 
phenol tương tự dược chất nên dễ bị 
oxy hóa, BHT sẽ thay thế dược chất 
tham gia vào quá trình oxy hóa tốt hơn 
các chất chống oxy hóa còn lại [4]. 
Trong khi đó, NaEDTA chỉ là chất hiệp 
đồng chống oxy hóa nhờ khóa ion kim 
loại trong môi trường - tác nhân xúc tác 
cho quá trình oxy hóa. Mặt khác, CAP 
kém bền trong môi trường axít, khá bền 
trong môi trường kiềm [8], do đó natri 
metabisulfit và natri hydrosulfit có tính 
axít sẽ làm giảm khả năng bảo vệ dược 
chất, còn D,L-methionin là axít amin có 
nhóm amin hơi kiềm nên dù bảo vệ dược 
chất không bằng BHT, nhưng vẫn tốt hơn 
2 muối chứa lưu huỳnh còn lại. 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2019 
 12 
KẾT LUẬN 
Nghiên cứu đã thẩm định được 
phương pháp định lượng CAP để ứng 
dụng đánh giá độ ổn định của dược chất. 
Đã áp dụng phương pháp thẩm được để 
xác định hàm lượng dược chất còn lại 
trong dung dịch hydroperoxyd 3% có hay 
không có các chất chống oxy hóa, từ đó 
lựa chọn BHT là chất chống oxy hóa có 
tác dụng tốt nhất trong bảo vệ CAP. 
LỜI CẢM ƠN 
Nghiên cứu này được tài trợ bởi chương 
trình “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển 
công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và 
chăm sóc sức khỏe cộng đồng” trong đề 
tài “Nghiên cứu bào chế cream, miếng dán 
giảm đau tại chỗ chứa capsaicinoid từ Ớt 
(Capsicum spp.). Mã số KC.10.35/16-20. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Phương Cao Hà. Định lượng capsaicinoid 
trong quả Ớt Việt Nam bằng HPLC. Luận văn 
Thạc sỹ Dược học. Trường Đại học Dược 
Hà Nội. 2018, tr.27-36. 
2. Bokhari Iram, Tahir Qurratulain. Comparison 
of usefulness of topical capsicum ointment 
with diclofenac gel in the treatment of mastalgia. 
Journal of Surgery Pakistan (International). 
2015, 20, p.4. 
3. Hayman Mark, Kam Peter C.A. 
Capsaicin: A review of its pharmacology and 
clinical applications. Current Anaesthesia & 
Critical Care. 2008, 19 (5-6), pp.338-343. 
4. Henderson David E, Slickman Adam M 
et al. Quantitative HPLC determination of the 
antioxidant activity of capsaicin on the 
formation of lipid hydroperoxides of linoleic 
acid: A comparative study against BHT and 
melatonin. Journal of Agricultural and Food 
Chemistry. 1999, 47 (7), pp.2563-2570. 
5. Pharmacopoeia EU. Pharmacopoeia 
European 8.0, European, NF1859, NF2529. 
2014. 
6. Reyes-Escogido Maria, Gonzalez-
Mondragon Edith G et al. Chemical and 
pharmacological aspects of capsaicin. 
Molecules. 2011, 16 (2), pp.1253-1270. 
7. Sengupta Pinaki, Chatterjee Bappaditya 
et al. Current regulatory requirements and 
practical approaches for stability analysis of 
pharmaceutical products: A comprehensive 
review. International Journal of Pharmaceutics. 
2018, pp.17-21. 
8. Shrivastava Alankar, Saxena Prachi. 
Stability indicating reverse phase high 
performance liquid chromatography method 
for the estimation of capsaicin. Pharmaceutical 
Methods. 2011, 2 (2), pp.135-142.