Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen IbOr từ khoai lang (Impomea batatas L.) tham gia vào sự tích lũy carotenoid

Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 341-347, 2017 
341 
TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN IbOr TỪ KHOAI 
LANG (IMPOMEA BATATAS L.) THAM GIA VÀO SỰ TÍCH LŨY CAROTENOID 
Hồ Thị Hương, Nguyễn Thùy Ninh, Nguyễn Đức Thành* 
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
* Người chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail: nguyenducthanh_pcg@ibt.ac.vn 
Ngày nhận bài: 01.11.2016 
Ngày nhận đăng: 20.6.2017 
TÓM TẮT 
Gen Orange (Or) được biết đến là gen mã hóa cho protein giàu DnaJ Zinc finger domain cysteine. Protein 
Or tham gia vào cấu trúc tăng cường tích lũy carotenoid và giúp cây chống lại điều kiện môi trường bất lợi. 
Với nỗ lực cải thiện chất lượng dinh dưỡng và khả năng chống lại điều kiện môi trường bất lợi cho cây ngô, 
trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả tách dòng gen IbOr từ giống khoai lang Hoàng Long và thiết kế 
hai vector chuyển gen mang gen IbOr được điều khiển bởi promoter Ubiquitin hoặc Globulin 1 (Glo1). Gen 
IbOr tách dòng có kích thước 942 bp, tương đồng tới 100% so với gen IbOr đã công bố trên Ngân hàng Gen có 
mã số HQ828087.1 và đã được đăng ký trên Ngân hàng Gen với mã số KX792094.1. Protein suy diễn gồm 313 
amino acid có vùng bảo thủ “ngón tay kẽm” (Zinc finger) của DnaJ và HSP40. Chúng tôi cũng đã thiết kế được 
hai vector pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos và pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos. Các vector này được chuyển 
vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58. Chủng A. tumefaciens C58 mang vector chuyển gen được 
khẳng định qua kiểm tra bằng phản ứng colony PCR và cắt bằng các enzyme giới hạn phù hợp. Những kết quả 
thu được sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu chuyển gen liên quan đến thể hiện gen IbOr và tạo cây 
ngô chuyển gen giầu carotenoid. 
Từ khóa: Carotenoid, Globulin 1, gen IbOr, khoai lang Hoàng Long, Ubiquitin, vector chuyển gen 
MỞ ĐẦU 
 Ngô là cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế 
toàn cầu, nó nuôi sống 1/3 dân số thế giới và là cây 
lương thực đứng thứ ba sau lúa mì và lúa. Ở Việt 
Nam, ngô là cây lương thực đứng thứ hai sau cây 
lúa. Chất lượng dinh dưỡng trong hầu hết các giống 
ngô rất thấp vì thiếu lysine, triptophan và hàm lượng 
tiền vitamin A gồm α-carotene, β-carotene, và β-
cryptoxanthin thấp (Kurilich et al., 1999). Để cải 
thiện chất lượng dinh dưỡng của ngô đã có nhiều cố 
gắng trong việc tạo giống ngô chất lượng protein cao 
(Sofi et al., 2009) và gia tăng hàm lượng carotenoid, 
đặc biệt là các carotenoid tiền vitamin A (Wutzel et 
al., 2012). 
 Carotenoid ở thực vật được tổng hợp ở màng các 
lạp thể và dự trữ nhiều ở sắc lạp của hoa, quả và rễ 
(Howitt, Pogson, 2006). Sắc lạp có cơ chế đặc biệt 
cho dự trữ lượng lớn Carotenoid bằng việc tạo ra các 
cấu trúc được gọi là cấu trúc Carotenoid-lipoprotein 
nằm bên trong sắc lạp. Các cấu trúc này còn được 
gọi là cấu trúc cô lập Carotenoid. Các cấu trúc cô lập 
làm nhiệm vụ như chỗ chứa để cô lập các Carotenoid 
và ngăn cản các sản phẩm cuối cùng của quá trình 
tổng hợp Carotenoid làm cản trở các khâu tổng hợp 
Carotenoid ở màng sắc lạp (Al Babili et al.,1999). 
Gen Or được cho là có vai trò điều khiển quá trình 
phân hóa các lạp thể không quang hợp thành sắc lạp 
(chronoplast) để tạo chỗ dự trữ cho Carotenoid. 
 Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cải tiến 
hàm lượng carotenoid của thực vật bằng cách chuyển 
gen làm thay đổi thể hiện các gen tham gia vào quá 
trình tổng hợp carotenoid như: gạo vàng giàu β-
carotene (Oryza sativa) được tạo ra bằng chuyển gen 
phytoene synthase (PSY) và carotenoid desaturase 
(crtI) từ Erwinia uredovora (Paine et al., 2005). Sự 
làm câm gen CHY-b trong trái cây màu cam cũng 
làm tăng đáng kể nồng độ β-carotene (Pons et al., 
2014). Các gen CrtB, CrtI và CrtY từ vi khuẩn đã 
được chuyển vào khoai tây và cây khoai tây chuyển 
gen có củ màu vàng với hàm lượng β-carotene lên 
tới 47 µg/g khối lượng khô (Diretto et al., 2007, 
Hồ Thị Hương et al. 
342 
2010). Siêu thể hiện gen CrtI dưới sự điều khiển của 
CaMV 35S promoter đã gia tăng đáng kể β-carotene 
và xanthophyll. Cây ngô chuyển gen CrtB và CrtI 
dưới sự điều khiển của promoter γ-zein cho hàm 
lượng Carotenoid đã tăng 34 lần so với cây ngô 
không chuyển gen (Romer et al., 2000). 
 Áp dụng công nghệ gen dựa trên các gen mã hóa 
cho các enzyme tham gia vào các quá trình tổng hợp 
cũng như các quá trình trước và sau tổng hợp là rất 
khó khăn. Một cách tiếp cận mới và hiệu quả là tăng 
cường các chất trao đổi chất bằng cách tăng cơ quan 
dự trữ trong thực vật. Gen Orange (Or) không tham 
gia vào con đường tổng hợp carotenoid đã được tách 
từ cây súp lơ đột biến màu vàng cam (Brassica 
oleracea var. botrytis). Gen này mã hóa protein giàu 
DnaJ cysteine có vai trò làm tăng tích lũy β-carotene 
ở các mô khác nhau (Lu et al., 2006). Gen Or từ cây 
súp-lơ đã được chuyển vào khoai tây (Solanum 
tuberosum L. cv Désirée) và kết quả cho thấy gen Or 
không chỉ duy trì mức độ β-carotene mà còn thúc 
đẩy dự trữ β-carotene tới 5 tháng trong điều kiện bảo 
quản lạnh (Li et al., 2012, Lopez et al., 2008). Sự 
biểu hiện cao gen Or tách từ Arabidopsis (AtOr) làm 
tăng hàm lượng carotenoid của mô sẹo lúa chuyển 
gen (Bai et al., 2014). Bên cạnh đó, sự biểu hiện của 
gen Or tách từ khoai lang (IbOr) không chỉ làm tăng 
hàm lượng β-carotene trong mô sẹo chuyển gen mà 
còn làm tăng đáng kể α-carotene, lutein, β-
crytoxanthin với hàm lượng α-carotene, lutein và 
carotenoid tổng số cao hơn 10,6 đến 14 lần so với 
mô khoai lang trắng đồng thời cây chuyển gen IbOr 
còn làm tăng hoạt động chống oxy hóa và khả năng 
chịu mặn (Kim et al., 2013). Trong bài báo này, 
chúng tôi trình bày kết quả tách dòng gen Orange từ 
giống khoai lang Hoàng Long (IbOr) và thiết kế 
vector chuyển gen mang gen IbOr dưới sự điều khiển 
của promoter Ubiquitin hoặc Globulin 1 (Glo1) với 
mục đích tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu chuyển 
gen liên quan đến sự biểu hiện của gen IbOr cũng 
như tạo cây ngô chuyển gen giầu carotenoid. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
Vật liệu nghiên cứu 
 Giống khoai lang Hoàng Long (Ipomea batatas 
L. cv Hoang Long) được thu ở Bắc Giang. Đây là 
giống khoai lang đặc sản có thịt củ màu vàng đậm, 
ngọt bùi và có thể có hàm lượng carotenoid cao. 
Vector pJET1.2 blunt do hãng Thermo Scientific 
cung cấp, vector pCambia2300/Ubiquitin/mir 
synthetic PDS/Nos, pJET1.2 blunt/Glo1 và chủng A. 
tumefaciens C58 do phòng Di truyền tế bào thực vật, 
Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Chủng vi khuẩn 
E. coli DH5α do hãng Invitrogen cung cấp. Cặp mồi 
Ubiquitin-F: 5’-TACTGCAG GTGCAGCGTGACC 
CG-3’, Ubiquitin-R: 5’-TAGGATCCTGCAGAA 
GTAACACCAAACAA-3’ và Glo1-F: 5’-
AAGCTTGCACGGTAAGGAGAGTACGG-3’, 
Glo1-R: 5’-CTGCAGGTGATGACCAGTTTCTTC 
CG-3’ do hãng Macrogen (Hàn Quốc) cung cấp. 
 Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen IbOr bằng PCR 
do chúng tôi thiết kế bằng phần mềm primer 3 
(NCBI) và dựa trên thông tin về gen IbOr trên Ngân 
hàng Gen (GenBank) có mã số HQ828087.1 có trình 
tự mồi xuôi: IbOr-F: 5’ GCGGATCCATGGTATA 
TTCAGGTAGAATC 3‘ với điểm cắt enzyme 
BamHI và mồi ngược IbOr-R: 5’-GCGAGCTCTT 
AATCAAATGGGTCAATTC 3‘ với điểm cắt SacI 
và được hãng Macrogen (Hàn Quốc) cung cấp. 
Phương pháp nghiên cứu 
Tách dòng gen IbOr 
 Mẫu khoai lang Hoàng Long được khử trùng 
bằng dung dich 0,1% HgCl2 và đưa vào nuôi cấy in 
viro. Thân cây khoai lang nuôi cấy in vitro được sử 
dụng để tách gen IbOr. Thân được nghiền bằng Nitơ 
lỏng và RNA tổng số được tách chiết bằng phương 
pháp sử dụng Trizol Reagents (Invitrogen, Mỹ). Sản 
phẩm RNA thu được được sử dụng làm khuôn cho 
phản ứng tổng hợp cDNA bằng phản ứng RT-PCR 
với bộ kít RevertAid H Minus Reverse Transcriptase 
(Thermo Scientific) và cặp mồi đặc hiệu nhân gen 
IbOr theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm 
phản ứng RT-PCR được tinh sạch bằng GeneJETTM 
gel extraction Kit (Themo Scientific) và gắn vào 
vector tách dòng pJET1.2 blunt bằng enzyme T4-
DNA ligase theo phương pháp của (Sambrook et al., 
2001). Vector tách dòng pJET1.2 blunt mang gen 
IbOr được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 
bằng phương pháp sốc nhiệt (Cohen et al., 1972). 
Dòng vi khuẩn mang gen IbOr được chọn lọc bằng 
phương pháp colony PCR và cắt plasmid bằng 
enzyme giới hạn BamHI và SacI, sản phẩm được điện 
di trên gel agarose 1% và xác định trình tự đoạn gen 
thu được bằng phương pháp giải trình tự với cặp mồi 
pJET1.2 Forward Sequencing Primer, pJET1.2 
Reverse Sequencing Primer trên máy ABI PRIMS 
3100 Avant Genetic Analyzer tại Phòng thí nghiệm 
trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học. 
Thiết kế vector chuyển gen mang gen IbOr 
 Vector pCambia2300/Ubiquitin- mir synthetic
Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 341-347, 2017 
343 
PDS/Nos được sử dụng cho thiết kế vector chuyển 
gen cùng với gen IbOr. Để làm việc này, 
pCambia2300/Ubiquitin- mir synthetic PDS/Nos và 
pJET1.2/IbOr cùng được cắt bởi enzyme giới hạn 
BamHI và SacI. Sản phẩm cắt được tinh sạch và nối 
với nhau nhờ enzyme T4-DNA ligase để tạo vector 
tái tổ hợp pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos. Sau đó, 
vector tái tổ hợp này được biến nạp vào tế bào E. coli 
DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và nuôi trên môi 
trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc 
Kanamycin 50 µg/ml. Các dòng vi khuẩn mọc lên 
được kiểm tra sự có mặt của gen IbOr bằng phương 
pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR) với 
cặp mồi đặc hiệu cho gen IbOr (mồi ngược và mồi 
xuôi - IbOr-R/F) và bằng phản ứng cắt plasmid với 
cặp enzyme giới hạn BamHI và SacI. 
 Để kiểm tra sự biểu hiện khác nhau của 
promoter Ubiquitin (thể hiện ở cây ngũ cốc) và 
promoter Globulin 1 (thể hiện ở hạt) đối với gen 
IbOr. Vector pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos và 
pJET1.2 blunt/Glo1 được cắt bằng enzyme giới hạn 
HindIII và BamHI, sản phẩm cắt sau đó được tinh 
sạch, ghép nối để tạo vector tái tổ hợp 
pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos và biến nạp vào tế bào 
E. coli DH5α, khuẩn lạc mọc lên được kiểm tra bằng 
phương pháp colony PCR với cặp mồi đặc hiệu cho 
Glo1 (mồi ngược và mồi xuôi- Glo1-R/F) và bằng 
phản ứng cắt plasmid với cặp enzyme giới hạn 
HindIII và SacI. 
 Sau khi kiểm tra hai vector tái tổ hợp 
pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos và 
pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos trong E. coli DH5α, 
các vector này được biến nạp vào tế bào A. 
tumefaciens C58 khả biến bằng phương pháp xung 
điện. A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp sau đó 
được nuôi trên môi trường LB đặc có kháng sinh 
Kanamycin 50 µg/ml và Rifamycin 50 µg/ml. Các 
dòng tế bào thu được kiểm tra bằng phản ứng colony 
PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm colony PCR và 
sản phẩm cắt plasmid được điện di trên gel agarose 
1% và so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo 
Scientific) để kiểm tra kích thước. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Tách dòng gen IbOr 
RNA tổng số từ giống khoai lang Hoàng Long 
được sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR 
nhân dòng gen IbOr với cặp mồi đặc hiệu IbOr-R/F. 
Kết quả nhân dòng gen IbOr được trình bày ở hình 
1A cho thấy, sản phẩm RT-PCR cho 1 băng tương 
ứng với kích thước gen IbOr là khoảng gần 1 kb 
(giếng 1 và 2), hai băng 1 và 2 đều gọn, đẹp, không 
lẫn băng, vạch lạ. Mẫu đối chứng (nước cất) không 
lên băng. Như vậy, có thể kết luận bước đầu rằng 
gen IbOr đã được nhân bản thành công. 
Hình 1. A: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen IbOr. ĐC: đối chứng âm (nước cất); giếng 1, 2: sản phẩm phản 
ứng RT-PCR với RNA tổng số; M: Marker 1kb (Thermo Scientific); B: sản phẩm colony PCR. Giếng 1 – 5: các dòng khuẩn 
lạc, ĐC: đối chứng âm (E. coli DH5α); C: sản phẩm cắt vector pJET1.2 blunt/IbOr. Giếng 1-4: Plasmid của các dòng khuẩn 
lạc, giếng 5-8: các plasmid được cắt bằng enzyme giới hạn BamHI, SacI, M: marker DNA 1kb (Thermo Scientific). 
 Vector pJET1.2 blunt được lựa chọn làm vector 
tách dòng. Đây là vector mở vòng đầu bằng và chứa 
gen kháng kháng sinh Ampicilin giúp cho việc chọn 
lọc khuẩn lạc sau này. Gen IbOr sau khi phân lập 
được gắn vào vector pJET1.2 blunt nhờ T4-DNA 
ligase và biến nạp vào E. coli DH5α. 
 Hình 1B và 1C là kết quả kiểm tra 5 khuẩn lạc 
trong đó có 4 khuẩn lạc mang gen có kích thước 
đúng với kích thước của gen IbOr theo lý thuyết. 
Mẫu đối chứng không lên băng. Sau khi kiểm tra 
bằng phản ứng colony PCR, 4 khuẩn lạc này được 
nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung 
Ampicillin 100 µg/ml. Plasmid tách chiết từ các 
khuẩn lạc này được cắt bằng BamHI, SacI (hình 1C), 
kết quả cho thấy có 2 băng: 1 băng tương ứng với 
kích thước của vector tách dòng pJET1.2 blunt gần 3 
kb và 1 băng gần 1 kb tương ứng với gen IbOr. Kết 
quả này chứng tỏ vector tách dòng pJET1.2 blunt đã 
được gắn thêm gen IbOr. 
Hồ Thị Hương et al. 
344 
 Chọn 1 trong 4 khuẩn lạc mang vector pJET1.2 
blunt/IbOr giải trình tự với cặp mồi pJET1.2 
Forward Sequencing Primer và pJET1.2 Reverse 
Sequencing Primer. Kết quả giải trình tự đoạn gen 
IbOr từ dòng khoai lang Hoàng Long cho kích thước 
942 bp. Kết quả so sánh trình tự cho thấy số lượng 
nucleotide được so sánh và mức tương đồng 
nucleotide với gen IbOr có mã số HQ828087.1 trên 
GenBank tương ứng là 99% (928/942 nucleotide) và 
100%. Protein suy diễn gồm 313 amino acid. Khi so 
sánh trình tự amino acid của gen IbOr tách dòng và 
HQ828987.1 bằng phần mềm BLAST (NCBI) cho 
kết quả chỉ có ba vị trí thay đổi nucleotide dẫn đến 
thay đổi amino acid (hình 2, bảng 1). 
 Kết quả tìm vùng bảo thủ (CD search, NCBI) 
cho thấy IbOr protein suy diễn của gen tách dòng có 
vùng bảo thủ “ngón tay kẽm” (Zinc finger) của DnaJ 
và HSP40. Kết quả dự đoán vị trí khu chú của 
protein bằng phần mềm ProtComp v. 9.0 (Predict the 
sub-cellular localization for plant proteins, Softberry, 
Inc., USA) cho thấy protein này là protein ngoại bào, 
khu chú ở tế bào chất. Cũng như các protein Or khác, 
vai trò của IbOr protein được cho là liên quan đến sự 
tích lũy carotenoid ở một số cây trồng bởi vì khi thể 
hiện gen Or trong mô hoặc cây chuyển gen thì hàm 
lượng carotenoid được tăng lên đáng kể (Kim et al., 
2013; Bai et al., 2014, Park et al., 2015, Wang et al., 
2015). 
 Từ những kết quả trình bày ở trên chúng tôi kết 
luận rằng đã tách dòng thành công gen IbOr từ giống 
khoai lang Hoàng Long. Gen tách dòng đã được 
đăng ký trên Ngân hàng Gen (GenBank) với mã số 
KX792094.1. 
Thiết kế vector chuyển gen pCambia2300/IbOr 
điều khiển bởi promoter Ubiquitin (Ubi) 
 Gen IbOr tách từ giống khoai lang Hoàng Long 
được chèn vào vector pCambia2300/Ubiquitin- mir 
synthetic PDS/Nos có sẵn promoter Ubiquitin 
(Ubiquitin là một promoter được dùng để biểu hiện 
gen ở nhiều bộ phận khác nhau của cây) và gen 
kháng kháng sinh Kanamycin dùng cho chọn lọc các 
dòng khuẩn lạc. Khi chuyển gen IbOr vào vector 
pCambia2300 có sẵn promoter Ubiquitin sẽ có cấu 
trúc vector chuyển gen như hình 3. 
Hình 2. Kết quả so sánh trình tự amino acid của gen IbOr tách dòng và gen IbOr có mã số HQ828087.1 trên GenBank 
(IbOrange). 
Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 341-347, 2017 
345 
Bảng 1. Vị trí sai khác trong trình tự amino acid của gen IbOr tách dòng và gen IbOrange mã số HQ828087.1. 
STT Vị trí thay đổi nucleotide 
Nucleotide trên 
gen IbOr tách 
dòng 
Nucleotide 
trên gen 
IbOrange 
Amino acid của gen 
IbOr tách dòng 
Amino acid của gen 
IbOrange 
1 181 T G S (Serine) A (Alanine 
2 368 T A I (Isoleucine) N (Asparagine) 
3 391 G A E (Glutamic acid) K (Lysine) 
Hình 3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCambia2300/Ubiquitin-IbOr-Nos. 
 Vector chuyển gen pCambia2300/Ubiquitin/ 
IbOr/Nos sau đó được chuyển vào chủng E. coli 
DH5α. Kết quả kiểm tra bằng phản ứng colony PCR 
với cặp mồi đặc hiệu IbOr-R/F với 4 khuẩn lạc mọc 
trên môi trường có kháng sinh Kanamycin cho kết 
quả dương tính và đều cho 1 băng có kích thước 
khoảng gần 1 kb phù hợp với kích thước của gen 
IbOr. Khi plasmid của các khuẩn lạc này được cắt 
bằng BamHI và SacI cho 2 băng: 1 băng tương ứng 
với kích thước của vector pCambia2300 là khoảng 
10 kb và 1 băng gần 1 kb tương ứng với gen IbOr. 
Như vậy, từ kết quả kiểm tra bằng colony PCR và
bằng cắt enzyme giới hạn, chúng tôi kết luận rằng 
vector chuyển gen pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos 
đã được thiết kế và chuyển thành công vào vi khuẩn 
E. coli DH5α. 
Thiết kế vector chuyển gen pCambia2300/IbOr 
điều khiển bởi promoter Globulin 1 (Glo1) 
 Globulin 1 (Glo1) là một promoter đặc hiệu ở 
hạt được tách từ dòng ngô CML161 và được chèn 
vào vector pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos bằng 
cách thay Ubiquitin bằng promoter Glo1 với mục 
đích cho việc thể hiện gen ở hạt (Hình 4). 
Hình 4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos. 
 Vector pCambia2300/Ubiqutin/IbOr/Nos và 
pJET1.2 blunt/Glo1 cùng được cắt bằng HindIII và 
BamHI sau đó Glo1 được gắn vào vector 
pCambia2300/.../IbOr/Nos nhờ enzyme T4 DNA 
ligase để tạo vector chuyển gen 
pCambia230/Glo1/IbOr/Nos. Vector pCambia230/ 
Glo1/IbOr/Nos được chuyển vào chủng E. coli 
DH5α. Kết quả được kiểm tra bằng phản ứng colony 
PCR với cặp mồi đặc hiệu Glo1- R/F và cắt bằng 
enzyme giới hạn HindIII và SacI để kiểm tra cả hai 
gen Glo1 và IbOr trong vector chuyển gen. 
Hồ Thị Hương et al. 
346 
 Kết quả phản ứng colony PCR với cặp mồi 
Glo1- R/F cho kết quả dương tính với kích thước gần 
1 kb tương ứng với gen Glo1 và khi cắt plasmid 
bằng enzyme giới hạn HindIII và SacI cho 1 băng 
gần 2 kb tương ứng với tổng kích thước của 
promoter Glo1 và gen IbOr. Như vậy có thể kết luận 
rằng vector pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos đã được 
thiết kế thành công. 
Tạo vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển 
gen 
 Các vector chuyển gen pCambia2300/Ubiquitin/ 
IbOr/Nos và pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos được 
biến nạp vào A. tumefaciens C58 bằng phương pháp 
xung điện ở điện thế 2,38 kv. Sản phẩm của quá 
trình biến nạp được nuôi trên môi trường LB đặc có 
bổ sung kháng sinh Rifamycin 50 µg/ml + 
Kanamycin 50 µg/ml, các dòng khuẩn lạc được kiểm 
tra bằng phản ứng colony PCR với các cặp mồi đặc 
hiệu IbOr-R/F, Ubiquitin-R/F và Glo1-R/F. Kết quả 
nhận được cho thấy đã có 3 khuẩn lạc cho kết quả 
dương tính với 2 cặp mồi IbOr-R/F và Ubiquitin-R/F 
với kích thước 1 kb tương ứng với gen IbOr và 2 kb 
tương ứng với gen Ubiquitin. Và 2 khuẩn lạc dương 
tính với cặp mồi IbOr-R/F và Glo1-R/F với kích 
thước tương ứng là 1 kb. Kết quả này chứng tỏ các 
dòng khuẩn A. tumefaciens C58 được biến nạp đã 
mang vector chuyển gen 
pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos và 
pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos. Những dòng A. 
tumefaciens này đã được lưu trữ trong glycerol ở -
80oC để phục vụ cho chuyển gen liên quan đến thể 
hiện gen IbOr và tạo cây ngô chuyển gen giầu 
carotenoid. 
KẾT LUẬN 
 Chúng tôi đã tách dòng thành công gen IbOr từ 
giống khoai lang Hoàng Long và đã thiết kế thành 
công hai vector chuyển gen là 
pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos và 
pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos. Các vector chuyển 
gen đã được biến nạp vào chủng vi khuẩn A. 
tumefaciens C58 cho mục đích chuyển gen trong 
tương lai. Những kết quả thu được sẽ cung cấp 
nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu chuyển gen liên 
quan đến thể hiện gen IbOr và tạo cây ngô chuyển 
gen giầu carotenoid. 
Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện trong khuôn 
khổ của đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công 
nghệ Việt Nam “Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen 
giàu Carotenoid” Mã số: VAST02.03/16-17. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Al Babili S, Hartung W, Kleinig H, Beyer P (1999) CPTA 
modulates levels of carotenogenic proteins and their 
mRNAs and affects carotenoid and ABA content as well as 
chromoplast structure in Narcissus pseudonarcissus 
flowers. Plant Biol 1: 607- 612 
Bai C, Rivera SM, Medina V, Alves R, Vilaprinyo E, 
Sorribas A, Canela R, Capell T, Sandmann G, Christou P, 
Zhu C (2014) An in vitro system for the rapid functional 
characterization of genes involved in carotenoid 
biosynthesis and accumulation. Plant J 77: 464-475 
Cohen SN, Chang AC, Hersu L (1972) Nonchromosomal 
antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of 
Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci 
USA 69: 2110-2114 
Diretto G, Al-Babili S, Tavazza R, Papacchioli V, Beyer P, 
Giuliano G (2007) Metabolic engineering of potato 
carotenoid content through tuber-specific overexpression 
of a bacterial mini-pathway. PLOS ONE 2:e350 
Diretto G, Al-Babili S, Tavazza R (2010) Transcriptional-
metabolic networks in β-carotene-enriched potato tubers: 
the long and winding road to the golden phenotype. Plant 
Physiol 154: 899-912 
Howitt CA, Pogson BJ (2006) Carotenoid accumulation 
and function in seeds and non-green tissues. Plant Cell 
Environ 29: 435-445 
Kim SH, Ahn YO, Ahn MJ, Jeong JC, Lee HS, Kwak SS 
(2013) Cloning and characterization of an Orange gene 
that increases carotenoid accumulation and salt stress 
tolerance in transgenic sweet potato cultures. Plant Physiol 
Biochemist 70: 445-454 
Kurilich AC, Juvik JA (1999) Quantification of carotenoid 
and tocopherol antioxidants in Zea mays. J Agric Food 
Chem 47:1948-55 
Li L, Yang Y, Xu Q, Owsiany K, Welsch 
R, Chitchumroonchokchai C, Lu S, Van Eck J, Deng 
XX, Failla M, Thannhauser TW (2012) The Or gene 
enhances carotenoid accumulation and stability during 
post-harvest storage of potato tubers. Mol Plant 5(2): 339-
352 
Lopez AB, Van Eck J, Conlin BJ, Paolillo DJ, O'Neill J, Li 
L (2008) Effect of the cauliflower Or transgene on 
carotenoid accumulation and chromoplast formation in 
transgenic potato tuber. J Exp Bot 59: 213-223 
Lu S, Eck Van J, Zhou X, Lopez AB, O’Halloran DM, 
Cosman KM, Conlin BJ, Paolillo DJ, Garvin DF, Vrebalov 
J, Kochian LV, Kupper H, Earle ED, Cao J, Li L (2006) 
The cauliflower Or gene encodes a DnaJ cysteine-rich 
domain containing protein that mediates high levels of 
beta-carotene accumulation. Plant Cell 18: 3594-3605 
Paine JA, Shipton CA, Chaggar S, Howells RM, Kennedy 
Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 341-347, 2017 
347 
MJ, Vernon G, Wright SY, Hinchliffe E, Adams JL, 
Silverstone AL, Drake R (2005) Improving the nutritional 
value of Golden Rice through increased pro-vitamin A 
content. Nat Biotechnol 23: 482-487 
Park SC, Kim SH, Park S, Lee HU, Lee JS, Park WS, Ahn 
MJ, Kim YH, Jeong JC, Lee HS, Kwak SS (2015) 
Enhanced accumulation of carotenoids in sweetpotato 
plants overexpressing IbOr-Ins gene in purple-fleshed 
sweetpotato cultivar. Plant Physiol Biochem 86: 82-90 
Pons E, Alquézar B, Rodríguez A, Martorell P, Genovés S, 
Ramón D, Rodrigo MJ, Zacarías L, Pena L (2014) 
Metabolic engineering of β-carotene in orange fruit 
increases its in vivo antioxidant properties. Plant 
Biotechnol 12: 17-27 
Romer S, Fraser PD, Kiano JW, Shipton CA, Misawa N, 
Schuch W, Bramley PM (2000) Elevation of the 
provitamin A content of transgenic tomato plants. Nat
Biotechnol 18: 666-669 
Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular cloning a 
laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 
New York 
Sofi PA, Wani SA, Rather AG and Wani SH (2009) 
Review article: Quality protein maize (QPM): Genetic 
manipulation for the nutritional fortification of maize. J 
Plant Breed Crop Sci 1(6): 244-253 
Wang Z, Ke Q, Kim MD, Kim SH, Chang, Ji CY, Jeong 
JC, Lee HS, Park WS, Ahn MJ, Li H, Deng BXX, Lee SH, 
Lim YP, Kwak SS (2015) Transgenic alfalfa plants 
expressing the sweetpotato Orange gene exhibit enhanced 
abiotic stress tolerance. PlOS ONE 
doi.org/10.1371/journal.pone.0126050 
Wurtzel TE, Cuttriss A, Vallabhaneni R (2012) Maize 
provitamin A carotenoids, current resources, and future 
metabolic engineering challenges. Fronties Plant Sci 3: 1-12. 
CLONING AND CONSTRUCTING TRANSFORMATION VECTOR CARRYING IbOr 
FROM THE SWEETPOTATO (IMPOMEA BATATAS L.) INVOLVED IN 
ACCUMULATION OF CAROTENOIDS 
Ho Thi Huong, Nguyen Thuy Ninh, Nguyen Duc Thanh 
Instute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology 
SUMMARY 
 The Orange gene (Or gene) is known as a gene encoding the protein containing a cysteine-rich Zinc finger 
domain. The Or protein is an important component of the structure that involes in accumulation of carotenoids 
and enhancing the resistant ability of plant to enviromental stresses. In an attempt to improve the nutritional 
quality and resistance to adverse environmental conditions of maize, in this article, we present the results on 
cloning IbOr gene from the sweetpotato cultivar Hoang Long and constructing transformation vectors carrying 
cloned IbOr gene under control of Ubiquitin (Ubi) or Globulin 1 (Glo1) promoter. The cloned IbOr gene was 
942 bp in size and had similarity level of 100% comparing to the IbOr gene that was deposited in GenBank 
with Accession number HQ828087.1. The IbOr gene from sweedpotato Hoang Long was registered in 
GenBank under Accession number KX792094.1. The deduced protein consisted of 313 amino acids having Zin 
finger domain of DnaJ and HSP40 proteins. We have also constructed two transformation vectors 
pCambia2300/Ubiquitin/IbOr/Nos and pCambia2300/Glo1/IbOr/Nos. These vectors were transformed 
successfully into Agrobacterium tumefaciens strain C58. The presence of the target gene (IbOr) and promoter 
(Ubi or Glo1) in the A. tumefaciens strains were confirmed by colony-PCR amplification with respective 
specific primer pairs and digested by suitable restriction enzymes. These vectors will provide important 
materials for further gene transfer research for the expression of IbOr gene and production of transgenic maize 
with ability to accumulate high carotenoids. 
Keywords: Carotenoids, Globulin1, IbOr gene, transformation vector, sweetpotato Hoang Long, Ubiquitin