Tác nhân gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi ở miền Trung Việt Nam

THÓNG BÁO KHOA HỌC
TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỮA Ở TÔM HÙM NUÔI
ở MIỀN TRUNG VIỆT NAM
MILKY DISEASE - CAUSING AGENTS IN CAGE CULTURED LOBSTERS
IN CENTER AREA OF VIETNAM
PGS. TS. Đỗ Thị Hòa1, KS. Nguyễn Tử Cương2, TS. Nguyễn Hữu Dũng1, KS. Nguyễn Thị Thùy Giang1, ThS. Phan Văn út1, KS. Nguyễn Thị Nguyệt Huệ1, KS. Đồng Thanh Hà1
1 Trường Đại học Nha Trang
2 Bộ Nông nghiệp vá Phát triển nông thôn
TÓM TẮT
Để xác định tác nhăn chính gây bệnh sữa cho tôm hùm nuôi lồng tại miền Trung Việt Nam, một nghiên cứu thực nghiệm đã được triển khai: TN1: 0,l-0,3ml hemolymph cửa tôm bệnh, pha loãng trong BPS được lọc qua màng lọc 0,2 pm, rồi tiêm trực tiếp cho mỗi con tôm khỏe; TN2: 0,1-0,3ml hemolymph tôm bệnh đã pha loãng với nước muối sinh lý (1/3), rồi tiêm cho mỗi con tôm khỏe. Có 2 lô đối chứng cho thí nghiệm này: 0,1-0,3 ml BPS pha loãng (ĐC1) và cũng với liêu như vậy nhưng là nước muối sinh lý được tiêm cho tôm khỏe (ĐC2). Kết quả thí nghiệm đã cho phép kết luận rằng, tác nhân gây bệnh sữa ở tôm hùm là một loại vi khuẩn lạ, có dạng hình que, cong nhiều, dài 1,5-2,5 pm, ký sinh nội bào ở mô liên kết của gan tụy, mang và tồn tại tự do trong hemolymph của tôm ở giai đoạn cuối của bệnh. Loại vi khuẩn này nuôi cấy không thành công trên các môi trưởng tổng hợp giàu dinh dưỡng và đã được định danh là loại vi khuẩn thuộc họ Rickettsiacae, một loại vi khuẩn tựa như Rickettsia (Rickettsia Like Bacterium-RLB). Nghiên cứu này cũng cho phép kết luận rằng, loại virus có thể vùi (inclusion body) dạng hình cầu, nằm ngoài nhân tế bào của mô liên kết và mang, đã được tìm thấy ở tôm hùm bệnh và tôm hùm khỏe không phải là tác nhân gây ra bệnh sữa cho tôm hùm.
Từ khóa: tác nhân, vi khuẩn, tôm hùm
ABTTRACT
An experimental research was carried out to detect main agent causing milky disease in cultured lobsters in Vietnam: In trail tank 1: 0,1-0,3 ml hemolymph of diseased lobster had diluted in BPS, filterated 0,2pm bacterial filters, after that injected every healthy lobster. In trial tank 2: 0,1 -0,3 ml hemolymph of milky diseased lobsters was diluted in physiological salt water (1/3) had injected every healthy lobster. There ware two controls trail tanks for the experiment: in control 1, healthy lobsters ware injected 0,1-0,3 ml diluted BPS and the same but with physiological salt water in control 2. From the results of the research, some conclusions were given out: agent that cause milky disease in cultured lobsters in Vietnam is a strange bacteria. Characteristics of the bacteria is rod, cuver, 1.5-2.5 pm, is intracellular bacterium in connective tissue of hepatopancreas and gill tissue in milky diseased lobsters, in late phase of the diasease, the bacterium ware free in hemolymph of diseased lobsters and can not to culture in synthetic nutrient mediums. The agent was classified in family Rickettsiaceae, was Rickettsia like Bacterium (RLB). From the results we can assert that, the virus that had spheral inclusion bodies ware outside of nuclei, in connective tissue of hepatopancreas and gill tissue was not agent of milky disease in cultured lobsters.
ĐẶTVẤNĐỂ
Một loại vi khuẩn lạ có dạng hình que, cong như vành trăng khuyết, Gram âm, dài khoảng 1,5-2,5 ụm đã được phát hiện, chúng cảm nhiễm nội bào trong cơ thể của tôm hùm bị bệnh sữa và tồn tại tự do ở hemolymph của tôm hùm bị bệnh nặng với tỷ lệ và cường độ nhiễm rất cao (100% với n= 60), làm máu của tôm đục như sữa. VI khuẩn này không thể nuôi cấy trên các loại môi trường tồng hợp giàu dinh dưỡng. Ngoài ra, một loại virus có thề vùi (inclusion body) hình cầu, nằm ngoài nhân tế bào ở mang và mô liên kết của gan tụy tôm, bắt mầu tím của hematoxylin (khi nhuộm với H & E) cũng đã được phát hiện cũng ở mô liên kết của gan tụy và ở mang. Thể vùi dạng này không chỉ gặp ở tôm hùm bị bệnh sữa, mà còn gặp ỗ cả những con tôm hùm còn khỏe mạnh với tần số gặp cao. Một vấn đề đặt ra ỗ đây là trong 2 loại tác nhân là vi khuẩn và virus đã được phát hiên, loại nào chính là tác nhân chính gây bệnh sữa ở tôm hùm (Panulirrus spp) nuôi ở miền Trung Việt Nam. Bài báo này đề cập tới một số nghiên cứu nhằm trả lời câu hỏi này.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
Tôm hùm với các dấu hiệu đặc thù của bệnh sữa được thu từ các lổng nuôi trên biển ỗ Khánh Hòa. Tôm khỏe có khối lượng trung bình từ 250 - 400g với biểu hiện máu còn trong, hemolymph không bị nhiễm loại vi khuắn có dạng hình que, cong như vành trăng khuyết, gram âm như đã được thu và được nuôi dưỡng trong các bề dạng tròn làm bằng compozite, có thề tích 1m3 trong thời gian 1 tuần trước khi thí nghiệm.
Để xác định loại tác nhân nào gây bệnh sữa ở tôm hùm, các thí nghiệm đã được tiến hành như sau: máu đục như sữa của tôm bệnh được rút ra bằng một xilanh 3ml tại gốc chân bò hoặc từ tim của tôm bệnh, được pha loãng trong dung dịch Buffer Phosphate Saline (BPS) với tỷ lệ 1/10 vể thề tích. Hỗn hợp này được đưa qua màng lọc có kích thước 0,2 ụm. Dịch thu được dưới màng lọc này được dùng để tiêm vào gốc chân bò cho tôm hùm khỏe với liều 0,1ml /con tôm ở đợt thí nghiệm 1 và 0,3ml/con tôm ở đợt 2 và 3. Một thí nghiệm khác đã dùng máu của tôm hùm bị bệnh sữa, ly tâm 3000v/phút đề các tế bào máu lắng xuống đáy ống nghiệm, nhưng vi khuẩn làm máu đục vẫn tồn tại trong dịch hemolymph, dịch này được pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1/3, rồi cũng tiêm vào gốc chân bò của tôm khỏe với liều 0,1ml/con ở đợt 1 và 0,3ml/con ở đợt 2 và 3. Có 2 lô đối chứng (ĐC) đã được bố trí, ở ĐC1 tôm khỏe được tiêm nước muối sinh lý (0,85%) với liều 0,1 ml/con (0,3 ml ở đợt 2 và 3) và ở lô ĐC2, tôm khỏe được tiêm 0,1 ml/con BPS đã pha loãng (0,3 ml/con ở đợt 2 và 3). Mỗi bể thí nghiệm có 5 con tôm hùm được sục khí 24h trong ngày. Tôm thí nghiệm được cho ăn bằng thịt của hầu tươi cấp đông và dọn sạch thức ăn thừa sau mỗi bữa cho ăn. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và thực hiện theo hình 1.
Tôm hùm bông khỏe mạnh, 250-400g/con, máu không bị đục, được thuần dưỡng trong 7ngày trước khi thí nghiệm
LÔTN1
Tiêm dịch máu tôm bệnh trong BPS qua màng lọc 0,2 pm
LÔTN2
Tiêm dịch náu tôm bệnh pha loãng với NaCI sinh lý, tỷ lệ 1/3
LÔĐC1
Tiêm dung dịch BPS pha loãng
Lô ĐC2 Tiêm nước muối sinh lý
(0,85%)
V
Ỷ
Ỷ
i
Thí nghiệm được lặp lại trong 3 lần
Có 5 con tôm/ mỗi lô TN hoặc đối chứng
Cho tôm ăn bằng thịt hầu đông lạnh
Sục khí liên tục 24h/ngày
Thay nước đồng loạt khi thấy cần thiết
Xifon đáy hàng ngày để loại thức ăn thừa
Theo dõi các yếu tố: nhiệt độ, độ mặn và pH
Theo dõi tình trạng sức khỏe của tôm
Theo dõi sự xuất hiện của bệnh sữa trong 15-20 ngày
Hình 1: Mô hình thí nghiệm để đánh giá vai trò của virus
đốivđi bệnh sữa ở tôm hùm
KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
Một số hình ảnh của 2 loại tác nhân (vi khuẩn và virus) đã phát hiện được từ tôm hùm bị bệnh sữa ỗ miền Trung Việt Nam
Loại vi khuẩn lạ phát hiện được trong hemolymph và ký sinh nội bào ở mô liên kết
Hình 2: Một số hình ảnh của tôm hùm bị bệnh sữa và loại vi khuẩn lạ đã phát hiên đưực ở các mẫu tôm hùm bị bệnh
Máu đục trắng như sữa được rứt ra từ tìm của tôm hùm bị bệnh sữa
Mặt bụng của tôm hàm bị bệnh sữa bộc lộ các đốt bụng chuyển sang màu trắng đục như sữa
Sự biến đổi mô bệnh học đặc thù ở tổ chức gan tụy của tôm hùm bị bệnh sữa, thể hiện các khuẩn lạc cảa vi khuẩn ký sinh nội bào, bao vây xung quanh mạch máu của gan tụy tôm bệnh (mũi tên xanh), Độ phóng đại 400 lần
Dạng hình que, cong, dài 1,5 - 2,0pm, gram (-) tồn tại tự do trong hemolymph và ký sinh nội bào ở mổ liên kết của gan tụy ở tôm bị bệnh sữa. Độ phóng đại 1000 lần
3.1.2. Một dạng thể vùi của virus tồn tại ngoài nhân của tế bào đã được phát hiện ở tôm hùm
Hình 3: Một dạng thể vùi (inclusion body) nằm ngoài nhân của tế bào đã đưực phát hiện ở mang và gan tụy tôm hùm bị bệnh sữa bằng phương pháp mô bệnh học
Cức thề vùi nằm ngoài nhân của các tế bào biểu mô cửa gan tụy (mũi tên xanh)
Các thể vài nằm ở tơ mang sơ cấp (mũi tên xanh), bên cạnh các khuẩn lạc của loại vi khuẩn ký sinh nội bào (mũi tên trắng).
Thề vài nằm ngoài nhân tế bào của tơ mang thứ cấp (mũi tên xanh).
Thề vài nằm ở vùng phân bố mô liên kết của tổ chức mang
Từ những hình ảnh ã hình 2, 3 và kết quả nghiên cứu cho thấy, 100% (n=60) những con tôm hùm bị bệnh sữa đã bị nhiễm một loại vi khuẩn lạ, cong, gram (-), dài từ 1,5 - 2,0ụm, vi khuẩn này có thể tồn tại tự do ở hemolymph của tôm bệnh với cường độ cao và ký sinh nội bào ở mô liên kết của gan tụy và mang tôm bệnh (hình 2). ồ nhóm tôm còn khỏe, không có con tôm nào nhiễm dạng vi khuẩn này ở hemolymph (0% với n=35) và cũng có gần 70% số tôm khỏe đã không bị nhiễm dạng vi khuắn này ở gan tụy và mang (Đỗ Thị Hòa & CTV, 2007). Ngoài ra, trên tôm bị bệnh sữa và tôm khỏe, một loại thể VÙI của virus có dạng tròn, nằm ngoài nhân tế bào đã được phát hiện bằng kỹ thuật mô bệnh học. Các thề vùi này đã được tìm thấy ở 36 trong tổng số 60 con bị bệnh sữa, chiếm 58,7% và gặp với tần số 15/35, chiếm 42,9% ở nhóm tôm khỏe. Loại thể vùi như đã mô tả ở tôm hùm nuôi ở Việt Nam hoàn toàn khác với dạng thể vùi của vius PaV1 đã được phát hiện gây bệnh ở tôm hùm gai - Panulirus argus ở Florida [Shields J.D, D.c. Behringer (2004); Li Caiwen & cộng sự (2006, 2007)]
3.2. Kết quả cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vào tôm hùm khỏe dịch hemolymph của tôm bệnh lọc qua màng 0,2pm và hemolymph của tôm bệnh đã pha loãng trong nước muối sinh lý.
Thí nghiệm này đã được thực hiện lặp lại 3 đợt, kết quả thí nghiệm trình bày ở bảng 1
Bảng 1: số tôm hùm bị chết và tỷ lệ tôm chết sau thí nghiệm
Đợt TN
Tỷ lệ chết â các lã thí nghiệm (%)
Lô tiêm dỊch lọc hemolymph trong BPS qua màng lọc 0,2pm
Lô tiêm dỊch hemolymph pha loãng vđl nưđc muối sinh lý
Lô ĐC1 tiêm BPS pha loãng
Lô ĐC2 tiêm nước muấl sinh lý
Số tôm chết
%
Số tôm chết
%
Số tôm chết
%
Số tôm chết
%
1
0
0
5
100
0
0
0
0
(15 ngày)
1
20
5
100
1
20
0
0
II
1/15
6,7
15/15
100
2/15
13,4
0/15
0
(20 ngày)
0
0
5
100
0
0
0
0
III
(20 ngày)
0
0
5
100
1
20
0
0
Tống chuna
1/15
6,7
15/15
100
2/15
13,4
0/15
0
Thảo luận:
Kết quả nghiên cứu ở bảng 1 cho thấy, khi dùng máu của tôm hùm bị bệnh sữa lọc qua màng 0,2 ụm rồi tiêm cho tôm hùm khỏe, hầu như không gây ra sự cố bất thường nào cho sức khỏe của tôm thí nghiệm, sau 15-20 ngày tiêm, chỉ có 1 con tôm bị chết (6,7%) ở đợt thí nghiệm 1, nhưng con tôm chết này không bộc lộ dấu hiệu của bệnh sữa như đã gặp ngoài tự nhiên và số tôm còn lạl của lô này ở đợt thí nghiệm 1 và 2 đợt thí nghiệm lặp lạl đềukhỏe mạnh bình thường cho đến khi kết thúc. Kết quả ở lô thí nghiệm này đã chứng minh rằng, loại virus có thề vùi như mô tả, đã nhiễm ở tôm hùm (Panulirrus spp) nuôi lồng ở miền Trung Việt Nam không phải là tác nhân gây bệnh sữa.
Ngoài ra, cũng có thề nhận định rằng, độc lực của virus này thấp, vì dịch lọc 0,2 hầu như không gây chết tôm sau 15-20 ngày tiêm. Mặt khác, dạng thề vùi loại virus này đã gặp ở cả nhóm tôm bệnh sữa và nhóm tôm khỏe với tỷ lệ gần tương đương nhau (58,7% và 42,9%). Như vậy, có thề kết luận rằng: virus không phải là tác nhân trực tiếp gây bệnh sữa ở tôm hùm.
Ngược lại, ở lô thí nghiệm tiêm trực tiếp hemolymph của tôm bị bệnh sữa cho tôm khỏe, dù đã được pha loãng với nước muối sinh lý (1/3) nhưng vẫn làm chết 100% tôm ở cả 3 đợt thí nghiệm. Sau khi tiêm 2 ngày, tôm đã bỏ ăn, yếu dẩn, hemolymph chuyền dẩn sang đục và sau 12-14 ngày kề từ khi tiêm, tôm ở lô này đã bộc lộ rất rõ ràng các dấu hiệu của bệnh sữa: mặt bụng của tôm có mẩu trắng đục, máu rút ra từ tim hoặc từ gốc chân bò thứ 5 đểu trắng đục như sữa, gan tụy chuyển màu trắng nhợt, khi mở giáp đấu ngực, nhiều dịch đục như sữa lắng đọng ỗ phía trong giáp đầu ngực (hình 2). Một số lượng rất lớn của loại vl khuẩn cong, Gram âm đã quan sát được trong các tiêu bản phết máu của tôm hùm bị bệnh sữa trong cảm nhiễm nhân tạo, tuy nhiên có sự khác biệt với tôm bị bệnh tự nhiên ở chỗ các tế bào vi khuẩn này không phân tán đểu trong hemolymph của máu mà khu trú thành từng đám (hình 4).
- ở 2 lô tôm đối chứng (ĐC1 & ĐC2), tôm khỏe mạnh sau 15-20 ngày thí nghiệm. Không có tôm chết ở lô ĐC2 (tiêm nước muối sinh lý), chỉ có 2 con chết (13,3%) ở lô tiêm buffer Phosphate (BPS) đã được pha loãng, nhưng không bộc lộ dấu hiệu của bệnh sữa.
Hình 4: sự khác nhau về phân bế của vi khuẩn trong hemolymph của tôm bị bênh sữa ngoài tự nhiên và tôm bị bệnh sữa trong cảm nhiễm nhân tạo (tiêu bản phết máu của tôm bệnh và nhuộm Gram)
a. Cấc tế bào vi khuẩn tổn tại tự do, nhưng lại khu trú thành từng đấm trong hemolymph căa tôm bị bệnh do cảm nhiễm nhãn tạo trong điều kiện
thí nghiệm.
b. Các tế bào vi khuẩn tồn tại tự do và phân bố đồng đều trong hemolymph của tôm bị bệnh sữa ở các lồng nuôi trên biển
Kết quả của thí nghiệm này là cơ sở khoa học để kết luận rằng, loại vi khuẩn lạ, cong, Gram âm, kích thước 1,5-2,5 ụm tồn tại với mật độ rất cao trong hemolymph của tôm hùm bị bệnh sữa, ký sinh nội bào ỏ mô Hên kết của tồ chức gan tụy và mang là tác nhân chính gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi lồng tại miền Trung Việt Nam.
Dựa vào một số đặc điềm của loại vi khuẩn này như không thề nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng tổng hợp, ký sinh nôi bào ở mô liên kết của gan tụy và mang, tạo nên các khuẩn lạc bắt màu tím của hematoxylin tương tự như loại vi khuẩn Rickettsia đã được phát hiện ký sinh nội bào trong biểu mô hình ống của gan tụy, gây bệnh hoại tử gan ở tôm he (Penaeus spp) [D.v. Lightner, 1996], chỉ khác ở chỗ, vi khuẩn gây bệnh ở tôm hùm lạl tấn công vào mô Hên kết của gan tụy và ở glal đoạn cuối của bệnh, vi khuẩn này có thể xâm nhập vào các mạch máu của tôm bệnh và tồn tại tự do trong hemolymph làm cho máu tôm bệnh trắng đục như sữa và mất khả năng đông của máu tôm bệnh (hình 5).
Hình 5: Biến đổi đặc thù ồ mô gan tụy của tôm hùm bị bệnh sữa ĩ. Khuẩn lạc cửa vỉ khuẩn RLB kỹ sinh nộỉ bào ở mô liên kết của gan tụy, bao vây xung quanh các mạch máu nhỏ, lúc này tôm hùm đã nhiễm vi khuẩn nhưng hemolymph chưa bị đục, đây là bệnh lý ở giai đoạn sớm của bệnh
2.Các vỉ khuẩn này đã tràn vào trong mạch mấu, tồn tại tự do trong hemolymph của tôm bệnh làm mấu chuyển đục như sữa, đây là bệnh lý ở giai đoạn cuối của bệnh.)
Bệnh sữa ở tôm hùm nuôi tại miền Trung có dấu hiệu bệnh lý gần giống với bệnh sữa đã được phát hiện ở loài cua (Carcinus maenas) nuôi ở Châu Âu và loài vi khuẩn gây bệnh sữa ở tôm hùm Việt Nam cũng có đặc điểm gần gống như một loại vl khuẩn được xác định là gây bệnh sữa ở cua Châu Âu: như vi khuẩn này không nuôi cấy được trên các môi trường tổng hợp và ký sinh nội bào ỏ mô liên kết của gan tụy và tồn tại tự do trong hemolymph của cua bị bệnh, thuộc nhóm vi khuẩn ký sinh nộl bào bắt buộc và cũng đã được các tác glả phát hiện ra nó đặt tên là loại vl khuẩn tựa như Rickettsia - Rickettsia like Bacterium-RLB [F. Eddy & cộng sự, 2007 ]. Tuy vậy, loại vi khuẩn gây bệnh sữa ở tôm hùm Việt Nam cũng có đặc điểm khác với loại vi khuẩn đã được phát hiện gây bệnh sữa ở cua Châu Âu ở chỗ, cũng có dạng hình que nhưng lạl cong như vành trăng khuyết, có vách tế bào rất mỏng.
Nunan L. M. & cộng sự (2003) đã thông báo về một dạng bệnh sữa đã được phát hiện ở tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Madagasca và ở vùng Đông Phi, có dấu hiệu bệnh rất giống với bệnh sữa của tôm hùm ở Việt Nam và tác nhân gây bệnh này đã được xác định là loại vi khuẩn ký sinh nội bào tựa như giống Rickettsia (RLB). Kỹ thuật phát hiện loại vi khuẩn này bằng phương pháp ứng dụng sinh học phân tử đã được phát triển. Tuy nhiên vi khuần phát hiện ở tại Madagasca không cong nhiều như vi khuẩn đã phát hiện ở tôm hùm bị bệnh sữa ở Việt Nam.
KẾT LUẬN
Tác nhân gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi lồng tại các tỉnh Nam Trung bộ là một loại vi khuẩn lạ, dạng hình que, cong nhiều, kích thước từ 1,5 - 2,5 ụm, không nuôi cấy được trên các môi trường tổng hợp giàu dinh dưỡng, ký sinh nội bào ở mô liên kết của tổ chức gan tụy và mang, ở glal đoạn cuối của bệnh, vi khuẩn này tồn tại tự do trong hemolymph của tôm bệnh làm máu tôm đục như sữa và mất khả năng đông. Dựa vào tính chất ký sinh nội bào, dựa vào những biến đổi bệnh lý đặc thù của mô ở cơ quan đích và tính chất khó nuôi cấy trên các môi trường tổng hợp giàu dinh dưỡng, chúng tôi đã xếp loại vi khuẩn này thuộc giống Rickettsia, tạm đặt tên là: Rickettsia Like Bacterium-RLB.
Loại virus có thề VÙI (Inclusion body) dạng hình cầu, nằm ngoài nhân của tế bào ở mô liên kết ở gan tụy và mang tôm hùm bị bệnh sữa và tôm hùm khỏe mạnh đã được xác nhận rằng, chúng không liên quan tới bệnh sữa ở tôm hùm nuôi ở miền Trung.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ và Đồng Thanh Hà và CTV(2007): Báo cáo kết quả phân tích mẫu tôm hùm bị bệnh sữa ở miền Trung Việt Nam. Báo cáo nghiệm thu của tổ công tác giải quyết bệnh sữa ở tôm hùm nuôi tại miền Trung. 44 trang
Eddy F, A. Powell, s. Gregory, L. M. Nunan, D. V. Lightner, p. J. Dyson, A. F. Rowley and R. J. Shields (2007): A novel bacterial disease of the European shore crab, Carcius maenas-molecular pathology and epidemiology. In Microbiology, No 152. p 2839-2849.
Nunan L.M.(2003). Molocular detection methods developped for a systemic Rickettsia like bacterium (RLB) in Penaeus monodon (Decapoda: Crustacea). In Diseases of Aquatic Organisms. Vol 53. p 15-23.
Li c., J. D. Shields, H. J. Smalll, K. s. Reece, c. L. Hartwig, R. A. Cooper, R. E. Ratzlaff (2006): Detection of Panulirus argus Virus (PaVl) in the Caribbean spiny lobster using fluorescence in situ hybridization (FISH).In Diseases of aquatic organisms. Vol. 72: 185-192, 2006.
Li c. and J. D. Shields (2007): Primary culture of hemocytes from the Caribbean spiny lobster, Panulirus argus, and their susceptibility to Panulirus argus Virus 1 (PaVl). In Journal of Invertebrate Pathology 94 (2007) 48-55.
Shieldsl J. D. and D. c. Behringer Jr2 (2004): A new pathogenic virus in the Caribbean spiny lobster Panulirus argus from the Florida Keys. In Diseases of aquatic organisms. Vol. 59: 109-118, 2004.