Nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào TCD8 ở bệnh nhân ung thư dạ dày

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
1TCNCYH 123 (7) - 2019
Tác giả liên hệ: Lê Văn Toàn, 
Trường Đại học Y Hà Nội
Email: [email protected]
Ngày nhận: 07/08/2019
Ngày được chấp nhận: 09/09/2019
NUÔI CẤY HOẠT HÓA, TĂNG SINH TẾ BÀO TCD8 Ở 
BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY
Lê Văn Toàn, Vũ Văn Quý, Nguyễn Quý Linh, Tạ Thành Đạt, 
Nguyễn Quý Hoài, Ngô Vinh Hạnh, Trần Khánh Chi, 
Trần Vân Khánh, Nguyễn Thanh Bình, 
Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn
Trường Đại học Y Hà Nội
Liệu pháp miễn dịch trong ung thư những năm gần đây đã đạt được những bước tiến đáng ghi nhận, 
và nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong đó, liệu pháp tế bào miễn dịch sử 
dụng tế bào lympho tự thân là một trong những phương pháp điều trị khá an toàn và hiệu quả cho nhiều 
loại ung thư trong đó có ung thư dạ dày. Liệu pháp này giúp nâng cao chất lượng cuộc sống và kéo dài 
thời gian sống thêm cho bệnh nhân. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm hoàn thiện quy trình tách chiết 
nuôi cấy và đánh giá chất lượng của quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy. 8 bệnh nhân ung thư dạ dày 
được lựa chọn vào nghiên cứu, mỗi bệnh nhân được lấy 15ml máu ngoại vi, tiến hành tách chiết nuôi cấy 
hoạt hóa tăng sinh và đánh giá chất lượng sau nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng bạch cầu 
đơn nhân thu được từ 15ml máu của bệnh nhân là 6,51 ± 2,35 x 106 tế bào. Đánh giá chất lượng mẫu sau 
14 ngày nuôi cấy cho thấy: Số lượng tế bào thu được sau nuôi cấy là 6,90 ± 2,58 x 109 tế bào số lượng 
tế bào tổng số sau khi đã nhân với thể tích nuôi cấy, số lần nhân lên của tế bào trung bình là 1076,8 ± 
251,55, với tỷ lệ sống trung bình đạt 92,79 ± 3,04%, trong đó tỷ lệ quần thể tế bào lympho chiếm 92,88 ± 
7,02%, TCD8 chiếm 67,75 ± 11,83%, không phát hiện thấy sự có mặt của vi khuẩn, mycoplasma và endotoxin.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày (UTDD) là một trong những 
loại ung thư phổ biến trên thế giới. Theo thống 
kê của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế 
IARC (GLOBOCAN 2018 UTDD đứng thứ 5 về 
tỷ lệ mắc mới và đứng hàng thứ 3 về tỷ lệ tử 
vong [1]. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn 
đoán và điều trị tuy nhiên UTDD vẫn là một 
trong những ung thư có tiên lượng xấu với tỷ lệ 
sống thêm sau 5 năm khoảng 10 - 30% [2]. Do 
đó việc phát triển các phương pháp điều trị mới 
kết hợp với các phương pháp điều trị truyền 
thống nhằm nâng cao chất lượng cuộc sống và 
kéo dài thời gian sống thêm cho bệnh nhân là 
hết sức cần thiết.
Miễn dịch trị liệu trong ung thư đã được 
nghiên cứu trong những năm đầu thế kỉ 19 [3]. 
Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về 
mối liên quan giữa miễn dịch và ung thư, một 
số liệu pháp đã bắt đầu được sử dụng và cho 
những kết quả khả quan. Dù chưa được xem là 
một phương pháp điều trị tiêu chuẩn tuy nhiên 
miễn dịch trị liệu được nhìn nhận là một niềm 
hy vọng mới cho bệnh nhân ung thư, đặc biệt 
là ở các bệnh nhân ung thư di căn và không 
đáp ứng tốt với các phương pháp điều trị truyền 
thống. 
Từ khóa: Liệu pháp tế bào miễn dịch, TCD8, ung thư dạ dày.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2 TCNCYH 123 (7) - 2019
Liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân đã được 
nghiên cứu phát triển và áp dụng trong điều trị 
trên nhiều loại ung thư trong đó có ung thư dạ 
dày với những kết quả ban đầu đáng khích lệ 
[4; 5]. Trong liệu pháp này, các tế bào miễn dịch 
được tách từ máu ngoại vi của bệnh nhân, nuôi 
cấy hoạt hóa tăng sinh trong môi trường đặc 
biệt và truyền trở lại cho bệnh nhân. Có nhiều 
dòng tế bào được sử dụng trong liệu pháp 
này như tế bào lympho T (T hỗ trợ - TCD4, T 
gây độc - TCD8), tế bào diệt tự nhiên (Natural 
killer cell – NK), tế bào tua (Dendritic Cell). Các 
tế bào TCD8 được cho là đóng vai trò trung 
tâm trong đáp ứng miễn dịch chống ung thư 
bên cạnh các tế bào khác. Tế bào TCD8 hoạt 
hóa có khả năng tiết các hạt gây độc có chứa 
perforin, granzym, cytokine được tiết ra bởi các 
tế bào TCD8 hoạt hóa như IFNγ, TNFα, IL2 
có vai trò trung gian trong nhiều đáp ứng miễn 
dịch chống ung thư như ức chế tăng sinh mạch, 
tăng tính thấm tổ chức khối u, hỗ trợ tế bào B 
trong hoạt động tiết kháng thể tăng cường nhận 
diện kháng nguyên ung thư, thúc đẩy quá trình 
chết theo chương trình của các tế bào ác tính.
Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành 
nhằm xây dựng quy trình nuôi cấy, đánh giá 
hiệu quả điều trị, tính an toàn của liệu pháp. 
Tại Việt Nam chúng ta đang ở những giai đoạn 
đầu tiên tiếp cận với liệu pháp, xây dựng thành 
công quy trình nuôi cấy, bước đầu thử nghiệm 
lâm sàng. Nghiên cứu này được thực hiện 
nhằm đánh giá số lượng và chất lượng quần 
thể tế bào trước và sau nuôi cấy.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng.
8 bệnh nhân ung thư dạ dày, giai đoạn II 
(1 bệnh nhân), giai đoạn III (6 bệnh nhân), 
giai đoạn IV (1 bệnh nhân) được lựa chọn vào 
nghiên cứu. 
Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:
- Bệnh nhân ≥ 18 tuổi.
- Toàn trạng ECOG ≤ 3.
- Có chức năng các cơ quan còn phù hợp, 
với thời gian kỳ vọng sống thêm ≥ 6 tháng. 
Tiêu chuẩn loại trừ:
- Bệnh nhân mắc bệnh lý ác tính dòng 
lympho .
- Các bệnh nhân mắc bệnh tự miễn.
- Bệnh nhân đang dùng thuốc ức chế miễn 
dịch.
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên 
cứu.
2. Phương pháp
Phương pháp thu thập mẫu bệnh nhân
Các bệnh nhân được lấy máu tại Bệnh viện 
Đại học Y Hà Nội. Các mẫu máu được tiến hành 
phân tách và nội cấy tại Trung tâm Nghiên cứu 
Gen – Protein trường Đại Học Y Hà Nội.
15 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân được 
lấy vào ống chống đông heparin bảo quản ở 
nhiệt độ phòng và được tiến hành phân tách 
trong vòng 6 giờ. Mỗi bệnh nhân được lấy máu 
tách tế bào 3 lần, cách nhau 2 tuần giữa các lần 
để đánh giá.
Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu
 - Kỹ thuật phân tách tế bào lympho từ máu 
ngoại vi.
Các tế bào đơn nhân được phân tách từ 
mẫu máu ngoại vi bằng phương pháp ly tâm 
thay đổi tỷ trọng sử dụng dung dịch Ficoll 1077 
[6].
 - Kỹ thuật nuôi cấy hoạt hóa tế bào lympho.
Sau khi được phân lập, các tế bào được 
nuôi cấy trong môi trườngRPMI 1640 chứa 10% 
huyết thanh người , có bổ sung thêm IL - 2 (10 
U/L).Khi các tế bào đạt được mật độ cần thiết 
(70 – 80%) sẽ được chuyển sang môi trường 
nuôi cấy hoạt hóa và biệt hóa có bổ sung một 
số yếu tố hoạt hóa như anti - CD3/CD28. . Tổng 
thời gian nuôi cấy cho 1 chu trình là 14 ngày.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
3TCNCYH 123 (7) - 2019
III. KẾT QUẢ
1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu.
Bảng 1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu.
Thông số Số lượng
Giới
Nam 3
Nữ 5
Giai đoạn
I 0
II 1
III 6
IV 1
Nghiên cứu gồm 8 bệnh nhân gồm 3 nam, 5 nữ. Trong đó đa số bệnh nhân tham gia vào nghiên 
cứu đều phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn. 
 - Kỹ thuật đánh giá tỷ lệ tế bào sống
Sử dụng phương pháp nhuộm tế bào bằng 
dung dịch Trypan Blue, đếm trên máy đếm tế 
bào tự động Countess® II FL để đánh giá tỷ lệ 
tế bào sống chết.
 - Kỹ thuật đánh giá tỷ lệ % các quần thể tế 
bào trong mẫu nuôi cấy.
Dựa trên sự biểu hiện của các cụm biệt hóa 
(Cluster of Differentiation - CD) trên bề mặt các 
tế bào lympho. Bằng cách nhuộm với kháng thể 
kháng đặc hiệu các dấu ấn CD (CD3, CD4, CD8, 
CD19, CD56) đặc hiệu cho từng giai đoạn biệt 
hóa tế bào có đánh dấu huỳnh quang. Sử dụng 
máy đếm tế bào dòng chảy Flow - Cytometry 
BD FACS Canto II.
 - Kỹ thuật đánh giá khả năng nhiễm vi 
khuẩn vi nấm.
 + Kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường 
nuôi cấy bằng môi trường nuôi cấy tăng sinh vi 
khuẩn Thioglycollate medium
+ Kiểm tra độc tố Endotocxin trong môi 
trường nuôi cấy bằng bộ KIT E - TOXATE
+ Kiểm tra mycoplasma trong môi trường 
nuôi cấy bằng bộ KIT Mycosensor.
 - Kỹ thuật xác định tỷ lệ sống chết trong 
quần thể tế bào nuôi cấy.
Sử dụng phương pháp nhuộm tế bào bằng 
dung dịch Trypan Blue, sử dụng máy đếm 
Countess® II FL để đánh giá tỷ lệ tế bào sống 
chết.
3. Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu này thuộc đề tài cấp Bộ “Tiếp 
nhận và nghiên cứu phát triển công nghệ nền 
tế bào miễn dịch trong điều tri ung thư từ Nhật 
Bản về Việt Nam” đã được đồng ý thông qua 
giai đoạn thử nghiệm trên người khỏe mạnh 
và bệnh nhân ung thư bởi Hội đồng đạo đức 
của Trường Đại Học Y Hà Nội (Số 128/HĐĐĐ 
- ĐHYHN ngày 20/9/2017).
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
4 TCNCYH 123 (7) - 2019
Bảng 2. Sự thay đổi quần thể tế bào trước vào sau nuôi cấy
Giá trị
Thời gian nuôi cấy (ngày) 14 ngày
Số lượng tế bào trước nuôi cấy (x106 tế bào) 6,51 ± 2,35
Số lượng tế bào sau nuôi cấy (x109 tế bào) 6,90 ± 2,58
Số lần nhân lên 1076,8 ± 251,55
Tỷ lệ sống của tế bào (%) 92,79 ± 3,04
Số lượng tế bào thu được sau khi phân tách từ máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư dạ dày trung 
bình là 6,51 ± 2,35 x 106. Sau nuôi cấy 14 ngày số lượng tế bào thu được trung bình là 6,90 ± 2,58 x 
109 với tỷ lệ sống đạt 92,79 ± 3,04 %. So sánh số lượng với trước khi nuôi cấy số lượng tế bào tăng 
trung bình 1076,8 ± 251,55 lần.
Hình 1. Hình ảnh tế bào lympho tăng sinh và tạo cụm dưới kính hiển vi soi ngược.
 A: Ngày 1 (Độ phóng đại x10) B: Ngày 3 (Độ phóng đại x10) 
 C: Ngày 6 (Độ phóng đại x10) D: Ngày 14 (Độ phóng đại x40)
Bảng 3. Phần trăm tế bào lympho trước và sau nuôi cấy.
Kiểu hình
Tỷ lệ các quần thể tế bào (%)
p
Trước nuôi cấy Sau nuôi cấy
CD3+ 68,87 ± 9,38 94,64 ± 4,16 < 0,001
CD3+CD8+ 23,90 ± 5,27 72,21 ± 8,08 < 0,001
A B 
C D 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
5TCNCYH 123 (7) - 2019
Kiểu hình
Tỷ lệ các quần thể tế bào (%)
p
Trước nuôi cấy Sau nuôi cấy
CD3+CD4+ 39,74 ± 9,61 13,37 ± 8,03 < 0,001
CD3+CD4+ CD8+ 0,45 ± 0,23 0,69 ± 0,50 0,082
CD16+CD56+ 18,55± 7,05 4,98±4,08 < 0,001
CD19+ 11,99 ± 3,51 0,11 ± 0,13 < 0,001
Tỷ lệ CD8+/ CD4+ 0,66 ± 0,27 8,31 ± 6,48 < 0,001
 Sau nuôi cấy tăng sinh quần thể tế bào lympho (CD3+) và TCD8 (CD3+CD8+) tăng đáng kể với 
tỷ lệ phần trăm trong quần thể tế bào sau nuôi cấy lần lượt là 94,64 ± 4,16 % và 72,21 ± 8,08 %. 
Đặc biệt có sự thay đổi đáng kể tỷ lệ quần thể TCD8/TCD4 từ 0,66 ± 0,27 lên 8,31 ± 6,48 khác biệt 
có ý nghĩa thống kê.
Hình 2. Kết quả minh hoạ phân tích tỷ lệ tế bào miễn dịch thu được của KDD04L1 bằng 
phương pháp đếm tế bào dòng chảy trên máy FACS Canto II
A: Kết quả phân tích mẫu bệnh nhân sau tách chiết.
B: Kết quả phân tích mẫu bệnh nhân sau nuôi cấy.
77,2% 
31,63% 
39,55% 
0,32% 
5,3% 
17,06% A 
B 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
6 TCNCYH 123 (7) - 2019
IV. BÀN LUẬN
2. Đánh giá tình trạng nhiễm vi khuẩn vi nấm.
Hình 3. Kết quả kiểm tra Mycoplasma trong môi trường nuôi cấy ở mẫu bệnh nhân KDD 
bằng kĩ thuật Real time – PCR.
Trong tổng số 24 mẫu nuôi cấy của 8 bệnh nhân UTDD được lựa chọn vào nghiên cứu qua phân 
tích đánh giá không phát hiện tình trạng nhiễm vi khuẩn, mycoplasma, độc tố endotoxin.
Chứng dương 
Chứng âm Mẫu bệnh nhân 
KDD04 
Chứng dương 
Chứng âm 
Mẫu bệnh nhân 
KDD05 
Ung thư dạ dày thường được chẩn đoán 
ở giai đoạn khá muộn. Phẫu thuật là phương 
pháp điều trị chính cho ung thư dạ dày có thể 
phẫu thuật và hóa trị bổ trợ góp phần cải thiện 
kết quả điều trị cho bệnh nhân. Tuy nhiên với tỷ 
lệ tái phát cao 40 - 80% trong các trường hợp 
tiến triển [7]. Các đặc tính của tế bào lympho T 
đặc biệt là vai trò trung tâm của tế bào TCD8 
trong miễn dịch ung thư đang mở ra những cơ 
hội mới cho bệnh nhân. Nhiều nghiên cứu cho 
thấy mức độ tập trung cao của quần thể các 
tế bào TCD8+, TCD3+ trong môi trường vi mô 
khối u cho thấy mức độ ảnh hưởng đáng kể 
đến việc cải thiện chất lượng cuộc sống và thời 
gian sống thêm cho bệnh nhân (p < 0,05) [8; 9]. 
Các liệu pháp tế bào nuôi dưỡng có thể khai 
thác tiềm năng này theo nhiều phương thức 
khác nhau. Chiến lược phân lập, nuôi cấy mở 
rộng và hoạt hóa quần thể các tế bào lympho T 
từ bệnh nhân ung thư đang được các nhà khoa 
học tập trung nghiên cứu trong nhiều năm qua. 
Các tế bào lympho T có thể được phân lập từ 
máu ngoại vi, tổ chức khối u Trong đó, liệu 
pháp sử dụng tế bào lympho T tách chiết từ 
máu ngoại vi của bệnh nhân có nhiều ưu điểm 
như ít xâm lấn, đễ dàng thực hiện và ít ảnh 
hưởng đến sinh hoạt và công việc của bệnh 
nhân. Trong phương pháp này 15 ml máu tĩnh 
mạch của bệnh nhân được thu thập vào ống 
chống đông heparin, các tế bào đơn nhân được 
phân tách dựa trên nguyên lý ly tâm thay đổi tỷ 
trọng sử dụng Ficoll thu hoạch lớp tế bào đơn 
nhân giữa lớp Ficoll và huyết tương sau ly tâm 
giàu các tế bào Lympho. 
Trong quần thể tế bào sau thu hoạch, quần 
thể tế bào lympho chiếm tỷ lệ lớn với hơn 65%. 
Số lượng tế bào của mẫu sau phân tách là 6,51 
± 2,35 x 106 tế bào. 
Đa số các tế bào lympho T được tách từ máu 
ngoại vi của bênh nhân không tiếp xúc trực tiếp 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
7TCNCYH 123 (7) - 2019
với các tế bào ung thư do đó chúng có thể chưa 
được hoạt hóa và ít có khả năng nhận diện và 
tiêu diệt các tế bào ác tính cũng như không đủ 
số lượng cho việc trị liệu [10]. Vì vậy, các tế bào 
lympho sau khi được phân tách phải được nuôi 
cấy tăng sinh và hoạt hóa về mặt chức năng 
để đạt được số lượng và chất lượng cần thiết 
cho việc điều trị. Trong nghiên cứu này, chúng 
tôi sử dụng môi trường nuôi cấy có các kháng 
thể đa dòng gắn đặc hiệu với thụ thể CD3 và 
CD28 để hoạt hóa các tế bào lympho T. Việc 
gắn kết của kháng thể với thụ thể trên bề mặt tế 
bào kích thích hoạt hóa tế bào không phụ thuộc 
kháng nguyên với sự trung gian của phức hợp 
đồng kích thích/ thụ thể tế bào T thông qua con 
đường NF - ƙB. Quá trình này tạo ra các tín 
hiệu mạnh mẽ cho sự biệt hóa, tăng sinh và 
phát triển tế bào giúp chúng biệt hóa thành các 
tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Sự kết hợp 
của kháng thể kháng CD28 cùng với kháng 
thể kháng CD3 cung cấp tín hiệu cần thiết để 
các tế bào hoạt hóa và phát triển đến giai đoạn 
trưởng thành và tránh được hiện tượng chết 
theo chương trình nếu chỉ cung cấp tín hiệu 
thông qua thụ thể CD3 [11; 12]. Bên cạnh đó, 
để đạt được số lượng tế bào lympho T đủ lớn 
cho điều trị thì môi trường nuôi cấy cần bổ sung 
các cytokin như IL - 2, IL - 15, IL - 18, IL - 21. 
Trong nghiên cứu này IL - 2 được bổ sung vào 
môi trường nuôi cấy, với vai trò trong việc kích 
thích phân bào và tăng cường sống sót đồng 
thời duy trì tác dụng của các tế bào lympho T 
tại tổ chức ung thư thông qua sự tương tác với 
các thu thể α, β, γ trên bề mặt tế bào [13; 14].
Sau 14 ngày nuôi cấy tăng sinh hoạt hóa, 
số lượng tế bào thu được sau nuôi cấy là 6,90 
± 2,58 x 109 tế bào/tổng số hay trong một đơn 
vị thể tích, tỷ lệ sống trên 90% với số lần nhân 
lên trung bình là 1076,8 ± 251,55 lần. Kết quả 
này tương đương với nghiên cứu của Zhang và 
cộng sự năm 2015 [4]. Đánh giá về quẩn thể tế 
bào sau nuôi cấy cho thấy các tế bào lypho T 
chiếm ưu thế với tỷ lệ trung bình 94,64 ± 4,16%, 
trong đó quần thể các tế bào TCD8 chiếm tỷ lệ 
từ 55,81 - 83,93%. 
Đánh giá về tính an toàn của mẫu sau nuôi 
cấy bằng phương pháp kiểm tra sự có mặt của 
vi khuẩn, Mycoplasma và nội độc tố Endotoxin 
trong các mẫu môi trường sau nuôi cấy. Kết 
quả kiểm tra cho thấy không có mẫu nào cho 
kết quả dương tính với các thành phần được 
kiểm tra.
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình tách 
chiết, nuôi cấy hoạt hóa tăng sinh tế bào TCD8 
trên bệnh nhân ung thư dạ dày. Quần thể tế bào 
sau nuôi cấy đảm bảo về số lượng, chất lượng 
( đặc điểm quần thể, tỷ lệ sống, tính an toàn).
Lời cảm ơn
Nghiên cứu được hỗ trợ từ đề tài cấp Bộ 
“Tiếp nhận và nghiên cứu phát triển công nghệ 
nền tế bào miễn dịch trong điều trị ung thư từ 
Nhật Bản về Việt Nam”. Nhóm nghiên cứu xin 
chân thành cảm ơn những bệnh nhân đã đồng 
ý tham gia vào nghiên cứu của chúng tôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bray F., Ferlay J., Soerjomataram 
I. et al (2018). Global cancer statistics 2018: 
GLOBOCAN estimates of incidence and 
mortality worldwide for 36 cancers in 185 
countries. CA Cancer J Clin, 68(6), 394 – 424.
2. Parkin D.M., Bray F., Ferlay J. et al 
(2005). Global cancer statistics, 2002. CA 
Cancer J Clin, 55(2), 74 – 108.
3. Kirkwood J.M., Butterfield L.H., 
Tarhini A.A. et al (2012). Immunotherapy of 
Cancer in 2012. CA Cancer J Clin, 62(5), 309 – 
335.
4. Zhang G. - Q., Zhao H., Wu J. - Y. et 
al (2015). Prolonged overall survival in gastric 
cancer patients after adoptive immunotherapy. 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
8 TCNCYH 123 (7) - 2019
Summary
EXPANSION AND ACTIVATION OF TCD8 CELLS FROM 
GASTRIC CANCER PATIENTS 
Immunotherapy in cancer treatment has achieved remarkable progress and receives worldwide 
attention of scientists in recent years. Among different immunotherapy methods, autologus T 
lymphocyte-based immunotherapy is a safe and effective combination treatments for various 
types of cancers including gastric cancer. This method can improve the quality of life and prolongs 
overall survival in patients. This reseach was conducted to improve the cell culture protocol and to 
evaluate the cell population before and after cell culture. Eight patients with gastric cancer were 
selected; 15 ml of peripheral blood from each patient was collected, extracted, expanded and 
activated. The total number of mononuclear isolated from the patient was 6,51 ± 2,35 x 106cells. 
After 14 - day cultivation, the number of cell averaged 6,90 ± 2,58×10⁹, and the proliferation 
multiplicity obtained by calculating the difference in cell numbers before and after culture was 
1076,8 ± 251,55, in which the percentage of TCD8 cells was 67,75 ± 11,83%. The survival rate 
of effector cells was 92,88 ± 7,02%. Bacteria, mycoplasma and endotoxin were not detected.
Key words: Cellular immunotherapy, autologus T lymphocyte, TCD8 cells, gastric cancer.
World J Gastroenterol, 21(9), 2777 – 2785.
5. Kawamoto M., Onishi H., Koya N. et 
al. (2017). Stage IV gastric cancer successfully 
treated by multidisciplinary therapy including 
chemotherapy, immunotherapy, and surgery: a 
case report. Surg Case Rep, 3.
6. Dagur P.K., McCoy J.P. (2015). 
Collection, Storage, and Preparation of Human 
Blood Cells. Curr Protoc Cytom, 73, 5.1.1 - 
5.1.16.
7. Waddell T., Verheij M., Allum W. et al 
(2014). Gastric cancer: ESMO - ESSO - ESTRO 
clinical practice guidelines for diagnosis, 
treatment and follow - up. Eur J Surg Oncol, 
40(5), 584–591.
8. Badalamenti D, Fanale D et al (2018). 
Role of tumor - infiltrating lymphocytes in 
patients with solid tumors: Can a drop dig a 
stone? Cell Immunol, 103753
9. Kim KJ, Lee KS et al (2014), Prognostic 
implications of tumor - infiltrating FoxP3+ 
regulatory T cells and CD8+ cytotoxic T cells in 
microsatellite - unstable gastric cancers. Hum 
Pathol. 45(2), 285 - 93.
10. Butler M.O., Friedlander P., Milstein 
M.I. et al (2011). Establishment of anti - tumor 
memory in humans using in vitro - educated 
CD8+ T cells. Sci Transl Med, 3(80).
11. YiXin Li, Roger J.K (2010). Comparison 
of anti - CD3 and anti - CD28 - coated beads 
with soluble anti - CD3 for expanding human T 
cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype 
and responsiveness to restimulation. J Transl 
Med. 8, 104.
12. Martkamchan S, Onlamoom N et 
al (2016), The Effects of Anti - CD3/CD28 
Coated Beads and IL - 2 on Expanded T Cell 
for Immunotherapy. Adv Clin Exp Med. 25(5), 
821 - 828.
13. Waldmann T.A (2006).The biology of 
interleukin - 2 and interleukin - 15: implications 
for cancer therapy and vaccine design. Nat Rev 
Immunol. 6(8), 595 - 601.
14. Waldmann TA (2002). The IL - 2/IL - 15 
receptor systems: targets for immunotherapy. J 
Clin Immunol. 22(2), 51 - 56.