Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng kháng thể igy kháng vi khuẩn tả (Vibrio cholera) và độc tố tả còn hoạt tính bằng ELISA

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 110
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 
KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN TẢ (Vibrio cholera) VÀ 
ĐỘC TỐ TẢ CÒN HOẠT TÍNH BẰNG ELISA 
 Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương*; Ngô Xuân Trình* 
 Hồ Bá Ngọc Minh*; Ngô Thị Tuyết Mai*; Nguyễn Thị Hồng Thanh** 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn (VK) tả và độc 
tố tả còn hoạt tính. Đối tượng: kháng thể IgY kháng VK tả và kháng độc tố tả được sản xuất tại 
Học viện Quân y. Phương pháp: thẩm định theo Hướng dẫn của ICH, Bộ Y tế Việt Nam. Kết 
quả: xác định được điều kiện phân tích bằng phương pháp ELISA nhờ phản ứng tạo màu của 
phức hợp kháng thể - HRP với cromogen đo ở bước sóng 450 nm. Phương pháp đã được 
thẩm định, bảo đảm yêu cầu của phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, 
độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD). Kết luận: đã xây 
dựng và thẩm định được phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố tả còn 
hoạt tính bằng phương pháp ELISA. 
* Từ khóa: Vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng độc tố tả; ELISA. 
Determination of Activation of Anti-vibrio Cholera and Anti-vibrio 
Cholera Toxin IgY by ELISA Method 
Summary 
Objectives: Establishment and validation of IgY anti-vibrio and anti-vibrio toxin by ELISA. Materials: 
IgY anti-vibrio and IgY anti-vibrio toxin were prepared at Vietnam Military Medical University. 
Methods: Using ELISA method based on colourimetry of complex IgY-HRP-cromogen at 450 nm. 
The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline. 
Results: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin was 
established and validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ. 
Conclusions: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin 
was validated fully in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health. 
* Key words: Cholera; Anti-vibrio cholera IgY; Anti-vibriocholera toxin IgY; ELISA. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Bệnh tả gây ra bởi VK tả (Vibrio cholera) 
và độc tố tả (Vibrio cholera toxin), đặc biệt 
đối với các nước nhiệt đới như Việt Nam, 
là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe 
cộng đồng. Theo báo cáo của WHO năm 
2007, toàn thế giới có 177.963 trường hợp 
* Học viện Quân y 
** Đại học Y khoa Vinh 
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương ([email protected]) 
Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/08/2016 
 Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 111 
mắc dịch tả và con số tử vong là 4.301 
người [5]. Hàng năm, có trên 100.000 người 
mắc tả và 90% tập trung ở khu vực châu 
Á và châu Phi. Để điều trị tả, ngoài sử 
dụng các biện pháp dự phòng và điều trị 
kinh điển như vắc xin, bù nước điện giải, 
kháng sinh, việc sử dụng các kháng thể 
kháng VK tả và độc tố tả đường uống là 
biện pháp khá hữu hiệu [4]. Kháng thể 
IgY là một immunoglobin có tác dụng tốt 
để điều trị các dịch bệnh nhiễm trùng, 
nhiễm độc đường tiêu hóa [6, 7, 8]. Hiện 
nay, Học viện Quân y đã chế tạo thành 
công kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố 
tả có nguồn gốc từ trứng gà mái được 
gây miễn dịch [2]. Nhằm làm cơ sở cho 
đánh giá chất lượng kháng thể và bào chế 
chế phẩm dùng đường uống từ nguồn 
nguyên liệu này, chúng tôi xây dựng phương 
pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK 
tả và độc tố tả còn hoạt tính bằng phương 
pháp ELISA. 
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ 
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
1. Nguyên liệu và thiết bị. 
- Kháng thể chuẩn IgY kháng VK tả 
(Vibrio cholera) và IgY kháng độc tố tả 
(chuẩn đối chiếu) được Virusys Corporation 
(Mỹ) cung cấp (10 µg/ml; 0,1 ml). 
- Kháng thể IgY kháng VK tả và IgY 
kháng độc tố tả được Bộ môn Miễn dịch, 
Học viện Quân y cung cấp. 
- Kháng nguyên: chủng VK tả (Vibrio 
cholerae) do Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện 
Quân y 103 cung cấp, phân lập từ các mẫu 
bệnh phẩm của bệnh nhân mắc bệnh tả 
tại Việt Nam giai đoạn 2010 - 2015. Độc 
tố tả được Sigma (Mỹ > 98,0%) cung cấp. 
- Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt 
tiêu chuẩn phân tích dược học và vi sinh. 
2. Phương pháp nghiên cứu. 
Định lượng hoạt tính kháng thể IgY 
kháng VK tả và độc tố tả bằng phương 
pháp ELISA. Thẩm định phương pháp 
theo chỉ dẫn của ICH và Bộ Y tế Việt Nam 
gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ 
đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng 
và giới hạn phát hiện [1, 3]. 
- Mẫu chuẩn: chuẩn bị các chuẩn làm 
việc có nồng độ 1,56 - 50 ng/ml bằng pha 
loãng chuẩn gốc IgY kháng VK tả và độc 
tố tả (10 µg/ml) với dung môi pha loãng. 
- Mẫu thử: sử dụng dung môi pha 
loãng kháng thể để chuẩn bị mẫu thử có 
nồng độ khoảng 10 ng/ml. 
- Mẫu trắng: dung dịch đệm pha loãng 
khoáng thể IgY (Virusys Corporation, Mỹ, 
IgY Sample Diluent 1x, chứa 10 mM Tris, 
pH 7,4 và 150 mM NaCl). 
* Tiến hành: kháng nguyên VK tả và 
độc tố tả được chuẩn bị ở các nồng độ 
7,5 x 106 CFU/ml và 10 µg/ml. 100 µl mỗi 
loại dung dịch được gắn lên đĩa 96 giếng 
trong dung dịch đệm 0,1 M carbonat-
bicarbonat pH 9,6 ở 40C và để qua đêm. 
Sau đó, thêm 200 µl dung dịch PBS chứa 
0,05 Tween 20 và 1% BSA. Các giếng 
này sau đó ủ với 100 µl kháng thể IgY 
kháng độc tố tả hoặc VK tả với nồng độ 
khác nhau trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. 
Sau đó, ủ các giếng với phức hợp HRP - 
kháng thể IgG cừu kháng IgY gà. Ở giữa 
mỗi bước, rửa giếng với 200 µl dung dịch 
PBS chứa 0,05% Tween 20. Màu của 
phản ứng được khai triển bằng cách thêm 
100 µl dung dịch cromogen 1x (IAV_TMB - 
chứa 3,3', 5,5;-tetramethylbenzidine) ủ tiếp 
trong 15 phút trong bóng tối. Dừng phản 
ứng bằng thêm 100 µl dung dịch axít HCl 
1N. Đem đọc mật độ quang ở bước sóng 
450 nm. 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 112
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
1. Tính đặc hiệu của phương pháp. 
Hình 1: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng VK tả. 
(a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng. 
Hình 2: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng độc tố tả 
(a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng. 
Quét phổ để xác định cực đại hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng. 
Kết quả cho thấy phổ chuẩn và phổ thử đều xuất hiện cực đại hấp thụ ở bước sóng 
450 nm. Trên mẫu trắng không có cực đại hấp thụ này, cho thấy phương pháp đảm bảo 
tính đặc hiệu. 
2. Khoảng tuyến tính. 
Chuẩn bị dãy chuẩn từ 1,56 - 100,0 ng/ml bằng pha loãng dung dịch chuẩn gốc 
với dung dịch pha loãng (chứa 10 mM Tris, pH 7,4 và 150 mM NaCl). Thực hiện 
phản ứng theo như mô tả ở phương pháp nghiên cứu. Đánh giá mối tương quan 
giữa nồng độ IgY và độ hấp thụ quang đo được. Kết quả trình bày như bảng 1, 2 và 
hình 3, 4. 
(a) (b) (c) 
(a) (b) (c) 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 113 
Bảng 1: Mối tương quan giữa mật độ quang nồng độ IgY kháng VK tả. 
Nồng độ IgY kháng VK tả (ng/ml) Mật độ quang X SD 
50 2,212 2,21 2,196 2,206 0,009 
25 1,115 1,102 1,106 1,108 0,007 
12,5 0,572 0,565 0,582 0,573 0,009 
6,25 0,307 0,301 0,303 0,304 0,003 
3,13 0,161 0,161 0,164 0,162 0,002 
1,56 0,098 0,093 0,102 0,098 0,005 
Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và 
nồng độ IgY kháng VK tả. 
Bảng 2: Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ kháng thể IgY kháng độc 
tố tả. 
Nồng độ IgY kháng độc tố tả 
(ng/ml) Mật độ quang X SD 
50 2,201 2,145 2,189 2,178 0,029 
25 1,146 1,123 1,133 1,134 0,012 
12,5 0,567 0,545 0,572 0,561 0,014 
6,25 0,302 0,311 0,305 0,306 0,005 
3,13 0,165 0,161 0,163 0,163 0,002 
1,56 0,095 0,091 0,087 0,091 0,004 
lgY kháng VK tả 
Nồng độ (ng/ml) 
Đ
ộ 
hấ
p 
th
ụ
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 114
Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và 
nồng độ IgY kháng độc tố tả. 
Kết quả bảng 1, 2; hình 1 và 2 cho thấy: nồng độ IgY cũng như nồng độ kháng thể 
IgY kháng độc tố tả và mật độ quang có tương quan chặt chẽ với nhau, hệ số tương 
quan tuyến tính xấp xỉ bằng 1. 
3. Độ lặp lại. 
Tiến hành xử lý mẫu với các mẫu chuẩn kháng thể IgY kháng độc tố tả và VK tả có 
nồng độ khác nhau: LQC (3,13 ng/ml), MQC (6,25 ng/ml)) và HQC (25 ng/ml). Phân 
tích trong cùng 1 ngày, để bảo quản, sau đó phân tích sau 3 ngày để xác định độ lặp 
lại của phương pháp phân tích. 
Bảng 3: Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày và khác ngày định lượng IgY kháng 
VK tả và độc tố tả. 
Loại LQC (3,13 ng/ml) MQC (6,25 ng/ml) HQC (25 ng/ml) 
IgY kháng 
VK tả 
3,08 ± 0,04a 3,06 ± 0,04b 6,33 ± 0,07a 6,40 ± 0,09b 24,82 ± 0,15a 24,85 ± 0,14b 
1,29%c 1,23% c 1,11% c 1,40% c 0,62% c 0,57% c 
IgY kháng 
độc tố tả 
3,06 ± 0,05 a 3,06 ± 0,05b 6,38 ± 0,11a 6,41 ± 0,08b 25,59 ± 0,27a 25,67 ± 0,14b 
1,52% c 1,64% c 1,67% c 1,24% c 1,05% c 0,55% c 
(a Độ lặp lại trong ngày được tính ± SD, n = 3; b) Độ lặp lại khác ngày (sau 3 ngày) 
tính là ± SD, n = 6; c) RSD tính là SD/ × 100%. 
Kết quả cho thấy, RSD ở 3 mức nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn, kể cả trong 
ngày và khác ngày đều < 2,0%. Với kết quả này, phương pháp phân tích đáp ứng yêu 
cầu về độ lặp lại. 
4. Độ đúng. 
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định độ đúng của phương pháp định lượng. 
Thêm các lượng kháng thể IgY chuẩn vào mẫu thử đã biết hàm lượng. Tiến hành xử lý 
mẫu theo phương pháp đã lựa chọn ở trên. Sau đó, đo mật độ quang ở bước sóng 
450 nm và dựa vào đường chuẩn để ngoại suy lượng thêm vào. 
lgY kháng độc tố tả 
Nồng độ (ng/ml) 
Đ
ộ 
hấ
p 
th
ụ
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 115 
Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng định lượng IgY kháng VK tả và độc tố tả. 
Loại 
LQC (3,13 ng) MQC (6,25 ng) HQC (25 ng) 
Lượng tìm 
thấy (ng) 
Độ thu hồi 
(%) 
Lượng tìm 
thấy (ng) 
Độ thu hồi 
(%) 
Lượng tìm 
thấy (ng) 
Độ thu hồi 
(%) 
IgY kháng VK tả 3,10 ± 0,09 98,9 ± 2,7 6,26 ± 0,05 100,2 ± 0,8 25,22 ± 0,38 100,9 ± 1,5 
IgY kháng độc tố tả 3,13 ± 0,08 100,1 ± 2,6 6,32 ± 0,05 101,2 ± 0,7 25,66 ± 0,20 102,6 ± 0,8 
Ở 3 mức thêm chuẩn, độ thu hồi của mẫu đều đạt ≥ 98%. Như vậy, phương pháp 
định lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng. 
5. Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện. 
Có nhiều phương pháp để xác định giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện của 
phương pháp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp ngoại suy từ độ 
dốc đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của mẫu trắng để xác định LOD và LOQ, trong 
đó LOD = 3,3 × SD/δ và LOQ = 10 × SD/δ; với SD là độ lệch chuẩn của mẫu trắng và 
δ là độ dốc đường tuyến tính. Kết quả nghiên cứu đã xác định được LOD và LOQ của 
IgY kháng VK tả và IgY kháng độc tố tả đều lần lượt là 0,04 ng/ml và 0,13 ng/ml. 
* Áp dụng đánh giá một số mẫu kháng thể IgY: 
Chúng tôi áp dụng phương pháp định lượng trên để xác định lượng kháng thể IgY 
còn hoạt tính trong một số mẫu sản xuất ở Học viện Quân y. 
Bảng 5: Kết quả xác định lượng IgY kháng VK tả và độc tố tả ở một số mẫu. 
Mẫu % IgY kháng VK tả còn hoạt tính % IgY kháng độc tố tả còn hoạt tính 
1 67,6 ± 5,3% - 
2 80,5 ± 7,3% - 
3 96,1 ± 5,3% - 
4 - 88,5 ± 4,2% 
5 - 56,7 ± 8,3% 
6 - 94,5 ± 5,3% 
Như vậy, lượng IgY còn hoạt tính ở một số mẫu sản xuất được tại Học viện Quân y 
dao động ở mức khoảng ≥ 60%. Điều này có thể do các mẫu này lấy ở phân đoạn với 
phương pháp tách chiết và tinh chế khác nhau. 
KẾT LUẬN 
Đã xây dựng được phương pháp định 
lượng IgY còn hoạt tính kháng VK tả 
và độc tố tả bằng phương pháp ELISA. 
Phương pháp được thẩm định theo quy 
định chung của ICH và Bộ Y tế Việt Nam, 
đảm bảo các yêu cầu về tính đặc hiệu, độ 
đúng (98,9 - 102,6%), độ chính xác (RSD 
< 2%), độ lặp lại, giới hạn định lượng và 
giới hạn phát hiện. Xác định lượng IgY 
kháng VK tả và độc tố tả ở một số mẫu 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 116
cho thấy lượng kháng thể còn hoạt tính 
của IgY kháng VK tả từ 67,6 - 96,1%, 
của IgY kháng độc tố tả từ 56,7 - 94,5%, 
tùy thuộc vào phương pháp tinh chế, tách 
chiết khác nhau. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Cục Quản lý Dược - Bộ Y tế. Sổ tay 
Hướng dẫn tạm thời đăng ký thuốc. Ban hành 
kèm theo quyết định số 229/QĐ-QLD ngày 12 
tháng 08 năm 2010. 2010. 
2. Hoàng Trung Kiên và CS. Nghiên cứu 
quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY 
kháng VK tả (Vibrio cholerae) trên gà mái. 
2013, số 1. 
3. ICH. Validation of analytical procedures: 
text and methodology. Q2R1. 2005. 
4. Kazuyuki Hirai et al. Passive oral 
immunization by egg yolk immunoglobulin 
(IgY) to Vibrio cholerae effectively prevents 
cholera. Acta Med Okayama. 2010, 64 (3), 
pp. 163-170. 
5. World Health Organization., Cholera 2007. 
Wkly Epidemiol Rec Geneva. 2008, 83, pp.269-
283. 
6. Xiao-Yu Li et al. Chitosan-alginate 
microcapsules for oral delivery of egg yolk 
immunoglobulin (IgY): in vivo evaluation in a 
pig model of enteric colibacillosis. Veterinary 
Immunology and Immunopathology. 2009, 
129 (1), pp.132-136. 
7. Xiao-Yu Li et al. Chitosan-alginate 
microcapsules for oral delivery of egg yolk 
immunoglobulin (IgY). Journal of Agricultural 
and Food Chemistry. 2007, 55 (8), pp.2911-
2917. 
8. Yoshinori Mine, Jennifer Kovacs-Nolan. 
Chicken egg yolk antibodies as therapeutics 
in enteric infectious disease: a review. Journal 
of Medicinal Food. 2002, 5 (3), pp.159-169.