Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 
 5 
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH 
VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ 
KHÁNG HLA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN SUY THẬN 
MẠN TÍNH DỰ KIẾN GHÉP THẬN 
 Đỗ Khắc Đại1; Nguyễn Ngọc Tuấn1 
 Hoàng Trung Kiên1; Nguyễn Đặng Dũng1 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân nhận thận 
ghép bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang và đánh giá hiệu quả định 
danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn dự kiến ghép thận bằng 
kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang. Đối tượng và phương pháp: sử dụng 
2 bộ kít sàng lọc và định danh kháng thể kháng HLA trên 55 mẫu huyết thanh được thu thập từ 
55 bệnh nhân suy thận và phân tích bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh 
quang trên hệ thống Luminex 200 tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y. Kết quả: 27/55 mẫu 
huyết thanh (49,09%) có kháng thể kháng HLA dương tính, trong đó dương tính với lớp I + lớp 
II chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%). Định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng 
thể kháng HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II. Kết luận: đã ứng dụng thành công kỹ 
thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong xét nghiệm sàng lọc và định danh 
kháng thể kháng HLA trong huyết thanh của bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận. 
* Từ khoá: Suy thận mạn tính (dự kiến ghép thận); Phát hiện kháng thể kháng HLA; Kỹ thuật 
hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang. 
Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent 
Assay in Detection of Anti-HLA Antibodies in Recipient Candidates 
for Kidney Transplant 
Summary 
Objectives: Anti-HLA antibodies in serum of kidney transplant recipients may significantly be 
involved in antibody-mediated graft rejection. Identification of the antibodies before kidney 
transplant in these patients, therefore, helps clinicians to better manage the patients both 
pre-and post-transplant. The aims of the present study are to screen and to identify anti-HLA 
antibodies in serum of recipient candidates for kidney transplant at 103 Military Hospital. 
Subjects and methods: A fluorescence covalent microbead immunosorbent assay test kit, along 
with Luminex 200 analyzer, were adopted in the study which allowed screening and identifying 
anti-HLA antibodies present in 55 serum samples from 55 recipient candidates for kidney transplant. 
1. Học viện Quân y 
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com) 
Ngày nhận bài: 21/12/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/01/2019 
 Ngày bài báo được đăng: 28/02/2019. 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 
 6 
Results: 27 (out of 55) serum samples (49.09%) were reactive to anti-HLA antibodies; samples 
simultaneously reactive to anti-HLA class I and class II accounted for 44.4% of total number 
of reactive samples. HLA class I antibodies identified include 17 anti-HLA-A and 31 anti-HLA-B; 
for HLA class II antibodies, 22 anti-HLA-DR antibodies were identified. Conclusions: Fluorescence 
covalent microbead immunosorbent assay with Luminex 200 analyzer were effective in screening 
and identification of anti-HLA antibodies in kidney transplant recipients. 
* Keywords: Kidney transplant; Recipient candidates for kidney transplant; Anti-HLA antibody; 
Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Kể từ khi ca ghép thận đầu tiên trên 
thế giới thành công năm 1954, ghép thận 
đã trở thành phương pháp điều trị tối ưu 
nhất đối với bệnh nhân (BN) suy thận 
mạn (STM) giai đoạn cuối. Tại Việt Nam, 
ca ghép thận đầu tiên được thực hiện 
thành công tại Bệnh viện Quân y 103 vào 
tháng 6 - 1992. Từ đó đến nay, đã có 
hàng ngàn BN được ghép thận thành 
công tại các trung tâm y tế lớn trên toàn 
quốc. Một trong những vấn đề quan trọng 
nhất trong ghép thận đó là tình trạng đào 
thải thận ghép, nguyên nhân do đáp ứng 
miễn dịch của cơ thể túc chủ chống lại 
mô ghép khác gen. Trong đó, phản ứng 
đào thải thận ghép tối cấp, cấp tính và 
mạn tính qua trung gian kháng thể được 
nhiều tác giả công bố [1]. 
Nhiều phương pháp xét nghiệm phát 
hiện kháng thể kháng - kháng nguyên HLA 
trước ghép (xét nghiệm tiền mẫn cảm) 
được ứng dụng trên lâm sàng nhằm hạn 
chế phản ứng đào thải thận ghép tối cấp 
và cấp tính qua trung gian kháng thể như 
kỹ thuật gây độc tế bào phụ thuộc bổ 
thể (CDC); kỹ thuật ELISA và kỹ thuật 
hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh 
quang (FCMIA). Trong đó, kỹ thuật FCMIA 
là kỹ thuật mới với nhiều ưu điểm nổi bật 
như có độ nhạy và độ chính xác cao trong 
việc phát hiện kháng thể kháng lại kháng 
nguyên HLA so với kỹ thuật CDC và ELISA. 
Tại Học viện Quân y, việc triển khai 
thành công kỹ thuật này có ý nghĩa thực 
tiễn rất quan trọng, góp phần hạn chế tối 
đa phản ứng đào thải mô ghép trong 
ghép thận, cũng như theo dõi xuất hiện 
của kháng thể kháng HLA sau ghép 
nhằm nâng cao hiệu quả trong chẩn 
đoán và điều trị cho BN nhận thận ghép. 
Xuất phát từ những phân tích trên, nhóm 
nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm 
mục tiêu: Sàng lọc phát hiện kháng thể 
kháng HLA trong huyết thanh bằng kỹ 
thuật FCMIA và hiệu quả định danh 
kháng thể kháng HLA ở BN STM tính dự 
kiến ghép thận. 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu. 
* Đối tượng nghiên cứu: 55 mẫu huyết 
thanh được thu thập từ 55 BN STM tính 
dự kiến ghép thận và có chỉ định ghép 
thận tại Bệnh viện Quân y 103. 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 
 7 
* Vật liệu nghiên cứu: 
- 2 kít xét nghiệm: 
 + Kít xét nghiệm sàng lọc phát hiện 
kháng thể kháng HLA (LMX) (Hãng 
Immucor, Mỹ). 
 + Kít xét nghiệm định danh kháng thể 
kháng HLA (ID1 và ID2) (Hãng Immucor, Mỹ). 
- Hoá chất và sinh phẩm xét nghiệm: 
+ Hỗn hợp với số lượng bằng nhau 
các loại hạt từ khác nhau, mỗi loại hạt từ 
huỳnh quang được gắn lên bề mặt một 
hoặc một số loại kháng nguyên HLA. 
+ Hỗn hợp kháng thể phát hiện đã gắn 
phức hợp huỳnh quang PE. 
 + Dung dịch pha mẫu, dung dịch pha 
sinh phẩm, dung dịch rửa (Hãng Immucor, 
Mỹ sản xuất và cung cấp). 
+ Hệ thống Luminex 200 và phần mềm 
điều khiển đi kèm (Hãng Luminex, Mỹ chế 
tạo và cài đặt). 
- Vật liệu và thiết bị labô phụ trợ khác 
như máy lắc, máy hút chân không, các loại 
pipét, đầu pipét, giấy bạc, giấy thấm, nước 
cất, ống nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế 
được chính hãng sản xuất cung cấp. 
2. Phương pháp nghiên cứu. 
* Phương pháp tách huyết thanh từ 
máu toàn phần: 
Lấy máu toàn phần số lượng 2 ml cho 
vào ống không có chất chống đông, đặt 
trong tủ ấm 30 phút ở nhiệt độ 370C để co 
cục máu tự nhiên. Ly tâm với tốc độ 
2.500 rpm trong 20 phút, hút 0,5 ml dịch 
nổi màu vàng cho vào ống eppendorf loại 
1,5 ml và tiến hành xét nghiệm ngay. 
* Phương pháp xét nghiệm sàng lọc 
phát hiện kháng thể kháng HLA bằng kỹ 
thuật FCMIA: 
- Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh 
+ 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng 
nguyên HLA (LMX bead) được lấy từ kít 
LMX vào các giếng xét nghiệm tương ứng. 
- Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy 
lắc 30 phút (trong buồng tối). Sau thời 
gian ủ tiến hành rửa plate 3 lần bằng 
cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào 
mỗi giếng. Hút cạn dịch trong giếng xét 
nghiệm bằng hệ thống bơm hút chuyên 
dụng. 
- Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 
50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất 
huỳnh quang PE. 
- Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết 
mô tả tại bước 2. 
- Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 
150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy 
lắc 30 giây. 
- Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên 
hệ thống Luminex 200. 
* Phương pháp xét nghiệm định danh 
kháng thể kháng HLA bằng kỹ thuật 
FCMIA: 
- Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh 
+ 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng 
nguyên HLA (ID1 và ID2 bead) được lấy 
từ kít ID1 và ID2 vào các giếng xét nghiệm 
tương ứng. 
- Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy 
lắc 30 phút (trong buồng tối). Sau thời 
gian ủ, tiến hành rửa plate 3 lần bằng cách 
cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào mỗi 
giếng. Hút cạn dịch trong giếng xét nghiệm 
bằng hệ thống bơm hút chuyên dụng. 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 
 8 
- Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 
50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất 
huỳnh quang PE. 
- Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết 
mô tả tại bước 2. 
- Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm 
150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy 
lắc 30 giây. 
- Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên 
hệ thống Luminex 200. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 
BÀN LUẬN 
* Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể 
kháng HLA (n = 55): 
Dương tính: 27 BN (49,09%); âm tính: 
28 BN (50,91%). Theo Bùi Văn Mạnh và 
CS (2009), tỷ lệ này là 69,2% [2], của 
Yamamoto và CS (2014) là 39,4% [3]. 
Kết quả thu được khác nhau phụ thuộc 
vào đối tượng nghiên cứu, cỡ mẫu 
nghiên cứu. Đặc biệt là phương pháp xét 
nghiệm phát hiện kháng thể kháng HLA. 
Bùi Văn Mạnh và CS nghiên cứu trên cỡ 
mẫu nhỏ hơn (n = 39) so với nghiên cứu 
của chúng tôi và Yamamoto. Chúng tôi 
nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn (n = 55); 
đối tượng nghiên cứu là BN suy thận có 
chỉ định ghép thận và sử dụng kỹ thuật 
FCMIA để phát hiện kháng thể kháng HLA. 
* Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể 
kháng HLA theo lớp kháng nguyên HLA: 
Dương tính với lớp I: 8 BN (29,63%); 
dương tính với lớp II: 7 BN (25,93%); 
dương tính với lớp I + lớp II: 12 BN 
(44,44%). 
Trên các mẫu có kháng thể kháng HLA 
dương tính, nhóm có kháng thể kháng HLA 
dương tính với cả 2 lớp (lớp I + lớp II) 
chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%), cao hơn 
trường hợp chỉ dương tính với 1 lớp. Kết 
quả này có thể giúp các nhà lâm sàng 
theo dõi điều trị BN sau ghép thận tốt hơn. 
Trường hợp kháng thể kháng HLA dương 
tính với cả 2 lớp, tiên lượng xấu hơn 
dương tính với 1 lớp. 
Bảng 1: Kết quả định danh kháng thể 
kháng HLA-A. 
Số thứ 
tự
Kháng thể 
kháng HLA-A 
Tần suất 
xuất hiện 
Tỷ lệ 
(%) 
1 A*01 6 7,32 
2 A*02 7 8,54 
3 A*03 6 7,32 
4 A*11 6 7,32 
5 A*23 4 4,88 
6 A*24 2 2,44 
7 A*25 1 1,23 
8 A*26 6 7,32 
9 A*29 3 3,66 
10 A*30 5 6,10 
11 A*31 6 7,32 
12 A*32 4 4,88 
13 A*33 9 10,98 
14 A*34 1 1,23 
15 A*66 3 3,66 
16 A*68 10 12,20 
17 A*74 3 3,66 
Tổng 82 100 
Đã định danh được 17 loại kháng thể 
kháng HLA-A. Trong đó, chiếm tỷ lệ cao 
nhất là kháng thể kháng HLA-A*68 
(12,20%) và thấp nhất là kháng thể kháng 
HLA-A*2534 (1,23%). 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 
 9 
Bảng 2: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA-B. 
Số thứ tự Kháng thể kháng HLA-B Tần suất xuất hiện Tỷ lệ % 
1 B*07 2 2,99 
2 B*08 5 7,46 
3 B*14 6 8,96 
4 B*15 4 5,97 
5 B*27 4 5,97 
6 B*35 4 5,97 
7 B*37 2 2,99 
8 B*38 1 1,49 
9 B*39 1 1,49 
10 B*40 3 4,48 
11 B*41 1 1,49 
12 B*42 2 2,99 
13 B*44 3 4,48 
14 B*45 3 4,48 
15 B*47 1 1,49 
16 B*48 1 1,49 
17 B*49 1 1,49 
18 B*52 1 1,49 
19 B*53 1 1,49 
20 B*54 2 2,99 
21 B*57 2 2,99 
22 B*58 3 4,48 
23 B*62 1 1,49 
24 B*63 1 1,49 
25 B*64 1 1,49 
26 B*65 4 5,96 
27 B*72 1 1,49 
28 B*73 1 1,49 
29 B*77 2 2,99 
30 B*78 2 2,99 
31 B*81 1 1,49 
Tổng 67 100 
Đã định danh được 31 loại kháng thể kháng HLA-B. Trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất 
là kháng thể kháng HLA-B*14 (8,96%) và B*08 (7,46%). 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 
 10 
Nghiên cứu đã phát hiện một số kháng thể kháng lại các kháng nguyên HLA 
như A*23, A*25, B*08, B*14 Theo nghiên cứu của Nguyễn Đặng Dũng và CS, những 
kháng nguyên trên mẫu tế bào thu nhận từ máu cuống rốn chưa thấy xuất hiện [3], 
chứng tỏ trong cộng đồng người Việt vẫn có người mang kháng nguyên này, nhưng để 
phát hiện được kháng nguyên hiếm gặp đòi hỏi phải có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn 
hơn và thực hiện trên nhiều khu vực khác nhau mới có thể đưa ra kết luận chính xác. 
Bảng 3: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA lớp II theo phân lớp. 
Đã định danh được 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II, trong đó chiếm tỷ lệ lớn 
nhất là HLA-DRB1*10 (14,29%). 
Số TT Kháng thể kháng HLA lớp II Phân lớp Tần suất xuất hiện Tỷ lệ (%) 
1 B1*01 6 10,71 
2 B1*03 2 3,57 
3 B1*04 1 1,79 
4 B1*07 2 3,57 
5 B1*08 2 3,57 
6 B1*09 3 5,36 
7 B1*10 8 14,29 
8 B1*11 2 3,57 
9 B1*12 2 3,57 
10 B1*13 2 3,57 
11 B1*14 3 5,36 
12 
DRB1 
B1*16 2 3,57 
13 B3*01 1 1,79 
14 B3*02 2 3,57 
15 
DRB3 
B3*03 1 1,79 
16 DRB4 B4*01 4 7,14 
17 DRB5 B5*01 3 5,36 
18 B1*02 3 5,36 
19 B1*03 3 5,36 
20 B1*04 1 1,79 
21 B1*05 2 3,57 
22 
DQB1 
B1*06 1 1,79 
Tổng 56 100 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019 
 11 
Bảng 4: Kết quả định danh kháng thể 
kháng HLA lớp II theo các nhóm. 
Số 
thứ tự 
Kháng thể 
kháng HLA lớp II 
Số 
lượng Tỷ lệ % 
1 DRB1 14 48.28 
2 DRB3 2 6.90 
3 DRB4 4 13.79 
4 DRB5 3 10,35 
5 DQB1 6 20,68 
Tổng 29 100 
Đã định danh được 5 nhóm kháng thể 
kháng HLA lớp II (HLA-DRB1; HLA-DRB3; 
HLA-DRB4; HLA-DRB5 và HLA-DQB1). 
Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng 
thể kháng HLA-DRB1 (48,28%), tiếp theo 
là DQB1 (20,68%) và thấp nhất là kháng 
thể kháng DRB3 (6,90%). 
Bảng 5: Kết quả định danh kháng thể 
kháng HLA theo loại kháng thể/mẩu 
huyết thanh. 
Loại kháng thể kháng 
HLA/mẫu huyết thanh 
Số 
lượng 
Tỷ lệ (%) 
1 8 29,62 
2 - 3 4 14,81 
4 - 6 4 14,81 
> 6 11 40,76 
Tổng 27 100 
Số mẫu huyết thanh có > 6 loại kháng 
thể kháng HLA chiếm tỷ lệ cao nhất 
(40,76%). Kết quả này có thể do kỹ thuật 
FCMIA có độ nhạy cao, có thể định danh 
được nhiều loại kháng thể khác nhau 
tương ứng với các allen kháng nguyên đã 
biết gắn trên hạt từ huỳnh quang. Do vậy, 
xét nghiệm tiền mẫn cảm trước ghép 
bằng kỹ thuật FCMIA giúp sàng lọc và lựa 
chọn người cho thận phù hợp nhất, góp 
phần làm giảm tỷ lệ đào thải thận ghép 
trên lâm sàng. 
KẾT LUẬN 
Nghiên cứu đã ứng dụng thành công 
kỹ thuật FCMIA trong xét nghiệm sàng lọc 
và định danh kháng thể kháng HLA trong 
huyết thanh của BN nhận thận ghép 
như sau: 
- 27/55 BN (49,09%) dương tính với 
kháng thể kháng HLA, trong đó dương 
tính với HLA lớp I: 29,63%; lớp II: 25,93%; 
lớp I và lớp II: 44,44%. 
- Đã định danh được 17 loại kháng thể 
kháng HLA-A; 31 loại kháng thể kháng 
HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA-DR 
và DQ với tần suất xuất hiện cao nhất là 
kháng thể kháng HLA-A*68; HLA-B*14 và 
HLA-DRB1*10. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Hoàng Mạnh An. Những tiến bộ trong 
ghép tạng ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học 
Công nghệ Việt Nam. 2014, số 8, tr.41-43. 
2. Bùi Văn Mạnh và CS. Nghiên cứu lâm 
sàng, cận lâm sàng và một số chỉ số miễn dịch 
ở BN sau ghép thận. Luận án Tiến sỹ Y học. 
Học viện Quân y. 2009. 
3. Nguyễn Đặng Dũng và CS. Xây dựng 
cơ sở dữ liệu và phần mềm tra cứu HLA của 
các mẫu tế bào gốc dây rốn được hiến tặng 
cho Ngân hàng Tế bào gốc Mekostem. Tạp chí 
Y - Dược học Quân sự. 2007, số 7, tr.21-28. 
4. Yamamoto H, Uchida N, Matsuno N, 
Ota H, Kageyama K, Wada et al. Anti-HLA 
antibodies other than against HLA-A, -B, -DRB1 
adversely affect engraftment and nonrelapse 
mortality in HLA-mismatched single cord blood 
transplantation: Possible implications of 
unrecognized donor-specific anti-bodies. 
Biol Blood Marrow Transplant. 2014, 20 (10), 
pp.1634-1640. doi:10.1016/j bbmt 2014.06.024.