Nghiên cứu thẩm định các chỉ tiêu an toàn vi sinh đăng ký công nhận ISO 17025 tại Labo trung tâm năm 2019

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
112 TCNCYH 129 (5) - 2020
Tác giả liên hệ: Lê Thị Kim Chung, 
Viện ĐT YHDP &YTCC, Trường Đại học Y Hà Nội
Email: [email protected]
Ngày nhận: 04/02/2020
Ngày được chấp nhận: 20/03/2020
NGHIÊN CỨU THẨM ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU AN TOÀN VI SINH 
ĐĂNG KÝ CÔNG NHẬN ISO 17025 TẠI LABO TRUNG TÂM 
NĂM 2019
Lê Thị Kim Chung , Tạ Thị Linh, Đặng Quang Tân, Nguyễn Đăng Vững, 
Vũ Thị Quý, Bùi Thị Minh Hạnh
Viện ĐT YHDP&YTCC, Trường Đại học Y Hà Nội
Thẩm định phương pháp hay còn gọi là xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là công việc luôn 
cần phải tiến hành trước khi phòng thí nghiệm đưa phương pháp đó vào sử dụng với các mục đích khác 
nhau, đặc biệt khi dùng cho kiểm nghiệm hoặc nghiên cứu. Labo Trung Tâm của Viện Đào tạo Y học dự 
phòng và Y tế công cộng (PTN) tiến hành thẩm định sáu phương pháp xác định vi sinh vật trong nước 
và thực phẩm có các kết quả về giới hạn phát hiện đạt yêu cầu so với ngưỡng quy chuẩn kỹ thuật quốc 
gia; độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng đều đạt 100 % cho các phương pháp định tính. Đối với các phương 
pháp định lượng có các kết quả giới hạn định lượng đạt yêu cầu so với ngưỡng của quy chuẩn kỹ thuật 
quốc gia; độ lệch chuẩn lặp lại < 14 %, độ lệch chuẩn tái lặp < 16 % cho các phương pháp định lượng.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm là 
một trong những việc quan trọng của ngành 
y tế dự phòng. Để thực hiện tốt nhiệm vụ của 
ngành an toàn thực phẩm cần phải có phương 
pháp chuẩn được thẩm định kỹ lưỡng. Thẩm 
định phương pháp là sự khẳng định bằng việc 
kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan 
chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng 
được các yêu cầu đặt ra. Có các thuật ngữ 
khác nhau như định trị phương pháp, đánh 
giá phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng 
phương pháp, phê duyệt phương pháp đều 
là cách gọi khác nhau của thẩm định phương 
pháp (method validation). Thẩm định phương 
pháp có thể xuất phát từ các phương pháp tiêu 
chuẩn như là các phương pháp thử theo tiêu 
chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học 
được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như Tiêu 
chuẩn Việt Nam (TCVN), Tổ chức Tiêu chuẩn 
hóa quốc tế (ISO), Hội Thử nghiệm và Vật liệu 
Mỹ (ASTM), Hiệp hội các nhà Hóa phân tích 
chính thống (AOAC) hoặc xuất phát từ các 
phương pháp không tiêu chuẩn hay phương 
pháp nội bộ (non-standard/alternative/in-house 
method) như là các phương pháp do phòng thí 
nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng 
dẫn của nhà sản xuất thết bị, phương pháp 
theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành. Theo 
yêu cầu của ISO 17025, phương pháp phân 
tích phải được thẩm định hoặc thẩm định lại 
khi: (1) Phương pháp áp dụng không phải là 
phương pháp tiêu chuẩn; (2) Phương pháp do 
phòng thí nghiệm tự xây dựng mới trước khi 
đưa vào sử dụng thành thường quy; (3) Có sự 
thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối 
tượng áp dụng của phương pháp đã thẩm định 
hoặc phương pháp tiêu chuẩn; (4) Có sự thay 
đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã 
được thẩm định như thiết bị phân tích với các 
đặc tính khác biệt, nền mẫu phân tích, người 
Từ khóa: Thẩm định phương pháp; độ đặc hiệu; độ nhạy. 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
113TCNCYH 129 (5) - 2020
phân tích).1 Như vậy, kết quả của thẩm định 
phương pháp có thể đánh giá chất lượng, độ tin 
cậy của kết quả phân tích và thẩm định phương 
pháp là một phần không thể thiếu nếu muốn có 
một kết quả phân tích đáng tin cậy. 
Các phương pháp xác định vi sinh vật trong 
nước và thực phẩm đã được chuyển đổi về các 
tiêu chuẩn quốc gia để xác định tổng số vi sinh 
vật hiếu khí, Coliforms, E.coli, Salmonella spp. 
trong nước và thực phẩm.2-6 Tuy nhiên, như 
theo yêu cầu (4) của ISO 17025 đã nêu ở trên, 
mỗi phòng thí nghiệm khi sử dụng các phương 
pháp này cần tiến hành thẩm định phương 
pháp trên hệ thống thiết bị, vật tư hóa chất của 
đơn vị mình để xem có phù hợp để sử dụng các 
phương pháp đó hay không. Các hướng dẫn 
về thẩm định phương pháp từ các nguồn khác 
nhau như tài liệu trong nước được biên soạn 
lại, tài liệu của tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế 
ISO, các tài liệu hướng dẫn của Codex7-11 
đã được Labo Trung tâm xem xét đưa vào áp 
dụng cho quá trình thẩm định các chỉ tiêu an 
toàn vi sinh vật trong nước và thực phẩm.2-6,12 
Nhằm phục vụ công tác xin công nhận phòng 
thí nghiệm của Viện Đào tạo Y học dự phòng và 
Y tế công cộng đạt tiêu chuẩn ISO 17025:2017, 
Labo Trung Tâm đã tiến hành thẩm định các 
phương pháp cụ thể sau: Đếm khuẩn lạc ở 30oC 
bằng kỹ thuật đổ đĩa; Định lượng Coliform bằng 
kỹ thuật đếm số có xác xuất lớn nhất (MPN); 
Phát hiện và định lượng E.coli giả định bằng kỹ 
thuật MPN; Định lượng Coliform và E.coli bằng 
phương pháp màng lọc; Phát hiện Salmonella 
bằng kỹ thuật nuôi cấy và khuếch đại chuỗi gen 
PCR.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
1. Đối tượng
Nền mẫu nghiên cứu: nền mẫu nước, thịt 
xay đóng hộp, rau đóng hộp, sữa tiệt trùng, bột 
ngũ cốc uống liền.
Chủng vi sinh vật bổ sung vào các nền mẫu 
phân tích bao gồm các chủng có nguồn gốc từ 
bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC): 
Salmonella sp. VTCC 12271
Salmonella enteritica VTCC 12270
Escherichia coli VTCC 12272
Các thiết bị, vật tư, môi trường nuôi cấy vi 
sinh.
2. Phương pháp 
Chỉ số nghiên cứu, xử lý số liệu đối với 
phương pháp định tính¹
Độ nhạy SE 
Độ nhạy được tính theo các công thức: 
Độ đặc hiệu SP
Độ đặc hiệu được tính theo các công thức: 
Độ chính xác AC
Độ chính xác được tính theo các công thức: 
Trong đó : 
TP: Dương tính đúng 
FP: Dương tính giả
TN: Âm tính đúng 
FN: Âm tính giả
Tổng số kết quả: N= TP + FP + FN + TN
Giới hạn phát hiện LOD
Giới hạn phát hiện được tính theo chương 
trình PODLOD calculation program version 9 
(dated 2017-09-23).13
Chỉ số nghiên cứu, xử lý số liệu đối với 
phương pháp định lượng1
Độ lặp lại : thông qua độ lệch chuẩn tương 
đối lặp lại RSDr theo công thức
SE = TP
TP + FN
×100 
SP = TN
TN + FP
× 100 
AC = TP + TN
N
 × 100 
𝑥𝑥𝑖𝑖 =
log ai + log bi
2
RSDr=
√∑ [( log ai - log bi )/xi]
n
i=1
2
2n
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
114 TCNCYH 129 (5) - 2020
 Trong đó:
 ai, bi : Các kết quả phân tích song song của cán bộ phân tích.
 xi: Kết quả trung bình của hai lần thí nghiệm song song của cán bộ phân tích.
 n: Số kết quả phân tích song song của cùng của cán bộ phân tích.
Độ tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm : thông qua độ lệch chuẩn tương đối tái lặp RSDR theo công 
thức
 xi=
log ai + log bi
2
𝑅𝑅𝑅𝑅𝐷𝐷𝑅𝑅 = √
∑ [( log ai - log bi )/xi]
n
i=1
2
2n
Trong đó: 
ai, bi: Các kết quả phân tích song song của 
hai cán bộ phân tích.
xi: Kết quả trung bình của hai lần thí nghiệm 
song song của hai cán bộ phân tích.
n: Số kết quả phân tích song song của hai 
cán bộ phân tích.
Giới hạn định lượng LOQ
Tính toán giới hạn định lượng LOQ = 3×LOD 
Độ không đảm bảo đo U
Tính toán độ không đảm bảo đo U theo ISO/
TS 19036 :2006 thông qua độ lệch chuẩn lặp lại 
Sr và độ lệch chuẩn tái lặp SR.
10
 Nội dung, qui trình nghiên cứu
Thẩm định phương pháp đếm khuẩn lạc 
ở 30oC bằng kỹ thuật đổ đĩa. 2
Nghiên cứu giới hạn phát hiện LOD
- Nền mẫu 1 (nước): mẫu thử nhiễm chủng 
ở các nồng độ 2 đơn vị hình thành khuẩn lạc 
(CFU)/ ml, 10 CFU/ ml, 20 CFU/ ml, 50 CFU/ 
ml vào 25 ml nước vô trùng x 4 mẫu, được 4 
mẫu thử nhiễm chủng có các nồng độ vi khuẩn 
nêu trên.
- Nền mẫu 2 (thịt xay đóng hộp): mẫu thử 
nhiễm chủng ở các nồng độ 20 CFU/ g, 100 
CFU/ g, 200 CFU/ g, 500 CFU/ g vào 25 g mẫu 
x 4 mẫu, được 4 mẫu thử nhiễm chủng có các 
nồng độ vi khuẩn nêu trên.
- Nền mẫu 3 (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm 
chủng ở các nồng độ 20 CFU/ g, 100 CFU/ g, 
200 CFU/ g, 500 CFU/ g vào 25 g mẫu x 4, 
được 4 mẫu thử nhiễm chủng có các nồng độ 
vi khuẩn nêu trên.
Nghiên cứu độ lặp lại, độ tái lặp
Tiến hành thí nghiệm và xử lý số liệu ở nồng 
độ 12500 CFU/25g/25ml, lặp lại 6 lần.
Định lượng Coliform và Phát hiện và định 
lượng E.coli giả định bằng kỹ thuật đếm số 
có xác suất lớn nhất MPN.3,4
Nghiên cứu giới hạn phát hiện LOD
- Nền mẫu 1 (nước): mẫu thử nhiễm chủng 
ở các nồng độ 4 CFU/25 ml, 5 CFU/25 ml, 10 
CFU/25 ml, 20 CFU/25 ml, 200 CFU/25 ml 
vào 25 ml nước vô trùng được mẫu thử nhiễm 
chủng có các nồng độ vi khuẩn nêu trên.
- Nền mẫu 2 (thịt xay đóng hộp): mẫu thử 
nhiễm chủng ở các nồng độ 40 CFU/25 g, 50 
CFU/25 g, 100 CFU/25 g, 200 CFU/25 g vào 25 
g mẫu được mẫu thử nhiễm chủng có các nồng 
độ vi khuẩn nêu trên.
Nền mẫu 3 (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm 
chủng ở các nồng độ 40 CFU/25 g, 50 CFU/25 
g, 100 CFU/25 g, 200 CFU/25 g vào 25 g mẫu 
được mẫu thử nhiễm chủng để có các nồng độ 
vi khuẩn nêu trên.
 Nghiên cứu độ lặp lại, độ tái lặp 
Tiến hành thí nghiệm và xử lý số liệu ở nồng 
độ 200 CFU/ 25 g/25 ml, lặp lại 6 lần.
Thẩm định phương pháp định lượng 
Coliform và E.coli bằng màng lọc.5
Nghiên cứu giới hạn phát hiện LOD
Nền mẫu nước: mẫu thử nhiễm chủng ở 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
115TCNCYH 129 (5) - 2020
các nồng độ 1 CFU/100 ml, 2 CFU/100 ml, 10 
CFU/100 ml, 20 CFU/100 ml vào 25 ml nước vô 
trùng x 3 mẫu, được 3 mẫu thử nhiễm chủng có 
các nồng độ vi khuẩn nêu trên.
Nghiên cứu độ lặp lại, độ tái lặp 
Tiến hành thí nghiệm và xử lý số liệu ở nồng 
độ 20 CFU/ 100 ml, lặp lại 6 lần.
Thẩm định phương pháp phát hiện 
Salmonella bằng nuôi cấy6 và kỹ thuật 
khuếch đại chuỗi gen PCR.12
Nghiên cứu giới hạn phát hiện LOD
- Nền mẫu 1 (nước): mẫu thử nhiễm chủng 
ở các nồng độ 1 CFU/25 ml, 2 CFU/25 ml, 5 
CFU/25 ml vào 25 ml nước vô trùng x 3 mẫu, 
được 3 mẫu thử nhiễm chủng có các nồng độ 
vi khuẩn nêu trên.
- Nền mẫu 2 (thịt lợn xay đóng hộp): mẫu 
thử nhiễm chủng ở các nồng độ 1 CFU/25 g, 2 
CFU/25 g, 5 CFU/25 g vào 25 g mẫu x 3 mẫu, 
được 3 mẫu thử nhiễm chủng có các nồng độ 
vi khuẩn nêu trên.
- Nền mẫu 3 (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm 
chủng ở các nồng độ 1 CFU/25 g, 2 CFU/25 
g, 5 CFU/25 g vào 25 g mẫu x 3 mẫu, được 3 
mẫu thử nhiễm chủng có các nồng độ vi khuẩn 
nêu trên.
 Nghiên cứu độ chính xác AC, độ nhạy SE, 
độ đặc hiệu SP
- Nền mẫu 1 (nước): mẫu thử nhiễm chủng 
ở nồng độ 5 CFU/25 ml vào 25 ml nước vô 
trùng x 2 mẫu, được 2 mẫu thử nhiễm chủng có 
các nồng độ vi khuẩn nêu trên. 
- Nền mẫu 2 (thịt lợn xay đóng hộp): mẫu 
thử nhiễm chủng ở nồng độ 5 CFU/25 g vào 25 
g mẫu x 2 mẫu, được 2 mẫu thử nhiễm chủng 
có các nồng độ vi khuẩn nêu trên.
- Nền mẫu 3 (rau đóng hộp): mẫu thử nhiễm 
chủng ở nồng độ 5 CFU/25 g vào 25 g mẫu x 2 
mẫu, được 2 mẫu thử nhiễm chủng có nồng độ 
vi khuẩn nêu trên. 
- Nền mẫu 4 (bột ngũ cốc uống liền): mẫu 
thử nhiễm chủng ở các nồng độ 5 CFU/25 g 
vào 25 g mẫu x 2, được 2 mẫu thử nhiễm chủng 
có các nồng độ vi khuẩn nêu trên.
- Nền mẫu 5 (sữa tiệt trùng): mẫu thử nhiễm 
chủng ở nồng độ 5 CFU/25 ml vào 25 ml mẫu 
x 2, được 2 mẫu thử nhiễm chủng có các nồng 
độ vi khuẩn nêu trên. 
Tương ứng với mỗi nền mẫu bổ sung chủng 
được chuẩn bị như trên, chuẩn bị thêm 2 mẫu 
không nhiễm chủng cùng điều kiện. Tiến hành 
phân tích 10 mẫu chứng dương và 10 mẫu 
chứng âm theo qui trình để tìm ra độ nhạy, độ 
đặc hiệu, độ đúng của phương pháp.
2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành năm 2019 tại Labo 
Trung tâm, Viện Đào tạo Y học dự phòng và Y 
tế công cộng.
3. Đạo đức nghiên cứu: Không áp dụng.
III. KẾT QUẢ
1. Thẩm định phương pháp đếm khuẩn lạc 
ở 30oC bằng kỹ thuật đổ đĩa
Độ lệch chuẩn lặp lại Sr của nền mẫu nước, 
thịt, rau tương ứng là 3,8 %; 2,9% và 4,0 %. Độ 
lệch chuẩn tái lặp SR của nền mẫu nước, thịt, 
rau tương ứng là 10,2 %; 8,9% và 7,7 %. Giới 
hạn định lượng của phương pháp là 3,7 CFU/
ml/g.
Bảng 1. Thẩm định phương pháp đếm khuẩn lạc ở 30oC bằng kỹ thuật đổ đĩa
Thông số đánh giá
Kết quả
Tiêu chí của PTNNền mẫu 
nước
Nền thịt Nền rau
Sr 0,038 0,029 0,040 0,14
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
116 TCNCYH 129 (5) - 2020
Thông số đánh giá
Kết quả
Tiêu chí của PTNNền mẫu 
nước
Nền thịt Nền rau
RSDr 0,039 0,041 0,026 < 0,05
SR 0,102 0,089 0,077 0,16
RSDR 0,059 0,051 0,044 < 0,10
LOD50% (CFU/ ml/g) 0,772 1,222 1,222 1,3
LOQ (CFU/ ml/g) 2,316 3,666 3,666 3,7
U 0,203 0,178 0,153 0,203
2. Thẩm định phương pháp định lượng Coliform bằng kỹ thuật MPN
 Bảng 2. Thẩm định phương pháp định lượng Coliform bằng kỹ thuật MPN
Thông số đánh giá
Kết quả
Tiêu chí của PTNNền mẫu 
nước
Nền thịt Nền rau
Sr 0,033 0,037 0,042 0,14
RSDr 0,032 0,021 0,117 < 0,05
SR 0,070 0,032 0,111 0,16
RSDR 0,080 0,036 0,125 < 0,13
LOD95% (MPN/ml/g) 0,36 0,36 0,36 0,36
LOQ (MPN/ ml/g) 1,08 1,08 1,08 1,08
U 0,167 0,109 0,239 0,239
Độ lệch chuẩn lặp lại Sr của nền mẫu nước, thịt, rau tương ứng là 3,3 %; 3,7 % và 4,2 %. Độ lệch 
chuẩn tái lặp SR của nền mẫu nước, thịt, rau tương ứng là 7,0 %; 3,2 % và 11,1 %.
Giới hạn định lượng của phương pháp là 1,08 MPN/ml/g.
3. Thẩm định phương pháp phát hiện và định lượng E.coli giả định bằng kỹ thuật MPN
Bảng 3. Phát hiện và định lượng E.coli giả định bằng kỹ thuật MPN
Thông số đánh giá
Kết quả
Tiêu chí của PTNNền mẫu 
nước
Nền thịt Nền rau
Sr 0,038 0,043 0,041 0,14
RSDr 0,107 0,041 0,113 < 0,12
SR 0,098 0,069 0,115 < 0,16
RSDR 0,111 0,077 0,128 < 0,15
LOD95% (MPN/ml/g) 0,36 0,36 0,36 0,36
LOQ (MPN/ ml/g) 1,08 1,08 1,08 1,08
U 0,215 0,163 0,246 0,246
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
117TCNCYH 129 (5) - 2020
Độ lệch chuẩn lặp lại Sr của nền mẫu nước, thịt, rau tương ứng là 3,8 %; 4,3 % và 4,1 %. Độ lệch 
chuẩn tái lặp SR của nền mẫu nước, thịt, rau tương ứng là 9,8 %; 6,9 % và 11,5 %.
Giới hạn định lượng của phương pháp là 1,08 MPN/ml/g.
4. Thẩm định phương pháp định lượng Coliform và E.coli bằng màng lọc (Bảng 4)
Bảng 4. Thẩm định phương pháp định lượng Coliform và E.coli bằng màng lọc
Thông số đánh giá
Kết quả
Tiêu chí của PTN
E.coli Coliform
Sr 0,043 0,040 0,14
RSDr 0,083 0,060 < 0,10
SR 0,098 0,087 0,16
RSDR 0,076 0,066 < 0,10
LOD50% (CFU/ 100 ml) 0,3 0,3 1
LOQ (CFU/ 100 ml) 0,9 0,9 1
U 0,195 0,175 0,195
Độ lệch chuẩn lặp lại Sr của E.coli và coliform tương ứng là 4,3 % và 4,0 %. Độ lệch chuẩn tái lặp 
SR của của E.coli và coliform tương ứng là 9,8 % và 8,7 %. Giới hạn định lượng của phương pháp 
là < 1 CFU/ 100 ml.
5. Thẩm định phương pháp phát hiện Salmonella bằng nuôi cấy và PCR (Bảng 5)
Bảng 5. Thẩm định phương pháp phát hiện Salmonella bằng nuôi cấy và PCR
TT Thông số đánh giá
Kết quả
Tiêu chí
của PTN
Nền mẫu 
nước
Nền thịt Nền rau
1 LOD50% (CFU/ 25ml/25g) 0,47 0,45 0,35 < 1
2 AC (%) 100 100 100 > 90
3 SE (%) 100 100 100 > 90
4 SP (%) 100 > 90
Độ chính xác AC, độ nhạy SE, độ đặc hiệu SP ở các nền mẫu nước, thịt , rau đều là 100 %. Giới 
hạn phát hiện 50 % của ba nền mẫu đều ở mức < 1 CFU/ 25 ml/ 25 g.
IV. BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này cho thấy các thông số 
thẩm định chỉ tiêu hiếu khí của nền mẫu nước, 
nền mẫu thịt, nền mẫu rau bổ sung chủng vi 
sinh vật đích có kết quả sàn sàn như nhau và 
tiêu chí công bố của phòng thí nghiệm đạt so 
với các yêu cầu của tiêu chuẩn quốc gia (tiêu 
chuẩn) TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013)2 
tương ứng. Các giá trị độ lệch chuẩn lặp lại, 
độ lệch chuẩn tương đối lặp lại của 3 nền mẫu 
có xu hướng nhỏ hơn độ lệch chuẩn tái lặp, độ 
lệch chuẩn tương đối tái lặp tuân theo qui luật 
chung về sự phù hợp. Giới hạn phát hiện và 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
118 TCNCYH 129 (5) - 2020
giới hạn định lượng của phương pháp của nền 
mẫu thịt xay đóng hộp nhỏ hơn rất nhiều so với 
ngưỡng của quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (quy 
chuẩn). Theo quy chuẩn, đối với nền mẫu thịt 
và sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng trực tiếp 
không cần qua xử lý nhiệt có giới hạn cho phép 
đối với tổng số vi sinh vật hiếu khí là 5 x 105 
CFU/ g; đối với E.coli là 5 x 101 CFU/g.14
Đối với các thông số thẩm định của nền mẫu 
nước, nền mẫu thịt, nền mẫu rau bổ sung chủng 
vi sinh vật đích trong chỉ tiêu Coliform MPN có 
kết quả sàn sàn như nhau và tiêu chí công bố 
của phòng thí nghiệm đạt so với các yêu cầu 
của quy chuẩn và tiêu chuẩn tương ứng. Tuy 
nhiên, ngoài giới hạn phát hiện và giới hạn định 
lượng, các thông số còn lại của nền mẫu rau có 
xu hướng cao hơn hai nền mẫu còn lại có thể 
giải thích do tính chất đặc trưng của nền mẫu 
cũng như khả năng đồng nhất của nền mẫu rau 
không tối ưu bằng mẫu nước và mẫu thịt xay 
đóng hộp. 
Các giá trị độ lệch chuẩn lặp lại, độ lệch 
chuẩn tương đối lặp lại của 3 nền mẫu đều nhỏ 
hơn độ lệch chuẩn tái lặp, độ lệch chuẩn tương 
đối tái lặp theo xu hướng, hợp lý chung. Ở nền 
mẫu thịt, độ lệch chuẩn lặp lại (3,7 %) lớn hơn 
độ lệch chuẩn tái lặp (3,2 %) nhưng sự khác 
biệt đó nghĩ nhiều đến độ ổn định về kỹ thuật 
của một cán bộ phân tích hơn là qui cho khác 
biệt có ý nghĩa thống kê. 
Các thông số thẩm định của nền mẫu nước, 
nền mẫu thịt, nền mẫu rau bổ sung chủng vi 
sinh vật đích của chỉ tiêu E.coli MPN có kết 
quả gần giống với kết quả của chỉ tiêu Coliform 
MPN. Điều này được giải thích do kỹ thuật xác 
định Coliform MPN và E.coli MPN được tiến 
hành trên cùng nền mẫu, cùng chủng vi sinh 
vật bổ sung vào nền mẫu là E.coli và quá trình 
thí nghiệm có nhiều điểm tương đồng nhau ở 
các bước chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu, các bước 
nuôi cấy ban đầu và bước đọc kết quả, chỉ khác 
ở bước tăng sinh chọn lọc và kiểm tra tính chất 
sinh vật hóa học để xác định E.coli. Các giá 
trị độ lệch chuẩn lặp lại, độ lệch chuẩn tương 
đối lặp lại của 3 nền mẫu đều nhỏ hơn độ lệch 
chuẩn tái lặp, độ lệch chuẩn tương đối tái lặp 
theo xu hướng, hợp lý chung. Tuy nhiên, ngoài 
độ lệch chuẩn lặp lại, giới hạn phát hiện và giới 
hạn định lượng, các thông số còn lại của nền 
mẫu rau có xu hướng cao hơn hai nền mẫu còn 
lại có thể giải thích do tính chất vật lý đặc trưng 
của nền mẫu cũng như khả năng đồng nhất của 
nền mẫu này không tối ưu bằng mẫu nước và 
mẫu thịt xay đóng hộp. Giới hạn phát hiện và 
giới hạn định lượng của phương pháp của nền 
mẫu thịt xay đóng hộp nhỏ hơn rất nhiều so 
với ngưỡng của quy chuẩn là 0,36 MPN/ g cho 
LOD và 1,08 MPN/ g cho LOQ và các gía trị này 
khi chuyển đổi sang CFU/ g cũng cho kết quả 
tương tự (Theo quy chuẩn, đối với nền mẫu thịt 
và sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng trực tiếp 
không cần qua xử lý nhiệt có giới hạn cho phép 
đối với E.coli là 5 x 101 CFU/g; ).14
Phương pháp màng lọc cho thấy các thông 
số thẩm định của nền mẫu nước bổ sung chủng 
vi sinh vật đích có kết quả tương đồng. Điều 
này được giải thích do Coliform và E.coli được 
tiến hành trên cùng nền mẫu nước, cùng chủng 
vi sinh vật bổ sung vào nền mẫu là E.coli và quá 
trình thí nghiệm giống nhau hoàn toàn ở các 
bước ban đầu là chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu, các 
bước nuôi cấy ban đầu và bước đọc kết quả, 
chỉ khác ở bước kiểm tra tính chất sinh vật hóa 
học để xác định E.coli được bổ sung vào nền 
mẫu nước phân tích. Giới hạn phát hiện và giới 
hạn định lượng của phương pháp của cả E. 
Coli và Coliform đều đạt so với yêu cầu của quy 
chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước 
sạch sử dụng cho mục đích sinh hoạt (Coliform 
< 3; E.coli <1 CFU/ 100 ml).11 
Các thông số xác nhận giá trị sử dụng cho 
phương pháp nuôi cấy Salmonella và phương 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
119TCNCYH 129 (5) - 2020
pháp phát hiện bằng kỹ thuật sinh học phân 
tử đạt yêu cầu so với quy chuẩn về xác định 
Salmonella trong thực phẩm. Giới hạn phát 
hiện của nền thịt và nền rau tốt hơn nền mẫu 
nước có khả năng do lượng chất dinh dưỡng 
ở hai nền mẫu này phong phú hơn. Tuy nhiên 
sự khác biệt này không có ý nghĩa, số liệu 
vẫn được coi là sàn sàn nhau và điều này 
được giải thích do nguyên liệu để tách chiết 
ADN cho PCR được lấy từ các khuẩn lạc điển 
hình của đĩa thạch nuôi cấy chọn lọc và cũng 
là các bước ban đầu của phương pháp xác 
định Salmonella truyền thống. Tuy nhiên, khi 
sử dụng nguyên liệu tách chiết ADN từ dịch 
tăng sinh chọn lọc hoặc từ dung dịch tăng sinh 
không chọn lọc (đệm pepton) thì khả năng phát 
hiện của Salmonella đã giảm đi đáng kể. Khi 
so với ngưỡng quy chuẩn, giới hạn phát hiện 
của phương pháp của các nền mẫu đều đạt 
yêu cầu vì có kết quả < 1 CFU/25g/25ml (Theo 
quy chuẩn QCVN 8-3:2012/BYT, đối với nền 
mẫu thịt và sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng 
trực tiếp không cần qua xử lý nhiệt, nền mẫu 
rau ăn sống có giới hạn đối với Salmonella phải 
là không phát hiện; quy chuẩn nước QCVN 
01-1: 2018/BYT không yêu cầu về chỉ tiêu 
Salmonella).14
Nhìn chung, phát hiện Salmonella bằng 
phương pháp sinh học phân tử được rút ngắn, 
trả lời kết quả nhanh hơn 24 - 48 giờ so với 
phương pháp nuôi cấy truyền thống, giảm công 
sức cho người làm thí nghiệm nhưng chi phí 
trên mẫu cho phương pháp sinh học phân tử lại 
cao hơn so với phương pháp nuôi cấy truyền 
thống. Như vậy, phương pháp nuôi cấy truyền 
thống phù hợp hơn cho các đối tượng yêu cầu 
chi phí thấp, không cấp bách về thời gian có 
được kết quả phân tích còn phương pháp sinh 
học phân tử lại thích hợp cho các đối tượng 
chịu được chi phí cao hơn nhưng yêu cầu kết 
quả nhanh hơn. 
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã hoàn thành nhiệm vụ thẩm 
định các phương pháp xin công nhận ISO 
17025: 2017 cho năm 2019 về các chỉ tiêu an 
toàn vi sinh vật bao gồm : Đếm khuẩn lạc ở 30oC 
bằng kỹ thuật đổ đĩa; Định lượng Coliform bằng 
kỹ thuật đếm số có xác xuất lớn nhất (MPN); 
Phát hiện và định lượng E.coli giả định bằng kỹ 
thuật MPN; Định lượng Coliform và E.coli bằng 
phương pháp màng lọc; Phát hiện Salmonella 
bằng kỹ thuật nuôi cấy và khuếch đại chuỗi gen 
PCR.với các thông số phù hợp theo tiêu chuẩn 
quốc gia và quy chuẩn kỹ thuật quốc gia hiện 
hành tương ứng cho lĩnh vực xét nghiệm nước 
và thực phẩm. Như vậy, các phương pháp 
đăng ký phù hợp cho việc sử dụng tại phòng 
thí nghiệm, trên hệ thống thiết bị máy móc, vật 
tư, hóa chất, môi trường và con người hiện tại, 
đáp ứng yêu cầu của công việc cần phải thẩm 
định phương pháp khi có các thay đổi liên quan 
đến con người, thiết bị, nền mẫu phân tích cho 
phòng thí nghiệm để được công nhận và duy trì 
ISO 17025. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị 
Hồng Hảo, Nguyễn Thành Trung, Phạm Gia 
Huệ, P.T. Nhã. Thẩm định phương pháp trong 
phân tích hóa học và vi sinh vật. Nhà Xuất bản 
Khoa học và Kỹ thuật 2010.
2. Tiêu chuẩn quốc gia. Phần 1: Đếm khuẩn 
lạc ở 30 Độ C bằng kỹ thuật đổ đĩa. Vi sinh 
vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp 
định lượng Vi sinh vật . Bộ Khoa học và công 
nghệ,TCVN4848-1:2015
3. Microbiology of food and animal feeding 
stuffs - Horizotal method for the detection 
and enumeration of coliforms - Most probable 
number technique, ISO 4831: 2006.
4. Microbiology of food and animal feeding 
stuffs - Horizontal method for the detection 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
120 TCNCYH 129 (5) - 2020
and enumeration of presumptive Escherichia 
coli - Most probable number technique, ISO 
7251:2005.
5. Water quality – Detection and enumeration 
of Escherichia coli and coliform bacteria. Part 
1: Membrane filtration method, ISO 9308 - 1: 
2000.
6. Microbiology of the food chain - Horizontal 
method for the detection, enumeration and 
serotyping of Salmonella - Part 1: Detection of 
Salmonella spp., ISO 6579-1:2017.
7. Microbiology of food and animal feeding 
stuffs - protocol for the validation of alternative 
method, ISO 16140:2003(E).
8. Microbiology of food and animal feeding 
stuffs - General requirements and guidance for 
microbiological examinations ISO 7218: 2007 
with amendment 1: 2013.
9. Microbiology of the food chain - Estimation 
of measurement uncertainty for quantitative 
determinations, ISO 19036: 2019.
10. Microbiology of food and animal 
feeding stuffs - Guidelines for the estimation 
of measurement uncertainty for quantitative 
determination ISO/TS 19036: 2006.
11. Guidelines on performance criteria 
and validation of methods for detection and 
quantification of specific DNA sequences and 
specific proteins in foods, CAC/GL 74-2010.
12. Trần Thị Xuân Mai, Võ Thị Thanh 
Phương, T.T.H.Y.v.N.V. Bé. Phát hiện nhanh 
Salmonella spp., Salmonella enteritica hiện 
diện trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR đa 
mồi (multiplex PCR), Tạp chí Khoa học 20b 
.2011: 198-208.
13. W. Wilrich. Journal of AOAC international 
92. 2009 : 1763-1772.
14. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô 
nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm, QCVN 8-3 
: 2012/BYT
Summary
STUDY ON MICROBIOLOGICAL METHODS VALIDATION FOR 
ACCREDITATION OF ISO 17025 AT LABO CENTER IN 2019
Microbiological Methods Validation, defined as a process to demonstrate the suitability of an analytic 
method, is an essential and important task to complete before applying such method for different 
purposes in the laboratory, especially for testing or researching. The Laboratory Center of the Institute 
for Preventive Medicine and Public Health (Laboratory) conducted the validation of six methods to 
qualify or quantify microorganisms including Coliform, E.coli, Total aerobic bacteria and Salmonella in 
fresh water and food matrix. For qualitative methods, the limit of detection (LOD) - in compliance with 
National technical regulation of microbiology contaminants in food-, the level of Specificity, Sensitivity, 
and Accuracy all reach 100 %. For quantitative methods, the LOD complies with National technical 
regulation, the repeat standard deviation is < 14 %, and the reproducible standard deviation is < 16 %.
 Keywords: Method validation; specificity; sensitivity.