Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn photobacterium damselae đột biến giảm độc lực

45
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ 1 - 2017
NGHIEÂN CÖÙU TAÏO CHUÛNG VI KHUAÅN PHOTOBACTERIUM DAMSELAE 
ÑOÄT BIEÁN GIAÛM ÑOÄC LÖÏC 
Lê Minh Hải1, Phạm Thị Tâm2, Tô Long Thành3
TÓM TẮT
Chủng vi khuẩn, ký hiệu là T4.3, có những đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá phù họp với chủng P. 
damsalae đã phân lập được từ cá mắc bệnh lở loét trên da và đốm trặng ở nội tạng. Chủng vi khuẩn này đã 
được sử dụng để tạo chủng nhược độc bằng hai tác nhân là tia UV và rifampicine. Với tác nhân là tia UV 
qua các đời chiếu đã tạo ra 112 dòng vi khuẩn và với tác nhân là rifampicin đã lựa chọn được 50 dòng vi 
khuẩn có sự thay đổi về hình thái, những dòng vi khuẩn này đã được kiểm tra về mức độ giảm độc lực của 
chúng. Bằng phương pháp sàng lọc trên môi trường thạch máu cừu đã thu được 06 dòng vi khuẩn không 
gây dung huyết, trong đó 4 dòng vi khuẩn T4.3K6, T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2 được tạo ra bởi phương 
pháp gây đột biến bằng rifampicin, 2 dòng vi khuẩn T4.3U5, T4.3U6 được tạo ra bởi phương pháp gây đột 
biến bằng tia UV. 6 dòng vi khuẩn không còn độc tố dung huyết được sử dụng để đánh giá khả năng gây 
bệnh trên cá mú nhằm chứng minh mức độ giảm độc lực của chúng. Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng 
đột biến đều giảm độc lực đáng kể so với chủng giống gốc. So sánh độc lực của 6 dòng đột biến chúng 
tôi nhận thấy: 2 dòng T4.3K8.2, T4.3U6 là an toàn hơn so với 04 dòng còn lại, tỷ lệ cá sống sót ngay sau 
khi gây nhiễm với các liều 104, 105, 106 CFU/ml của các dòng T4.3K8.2, T4.3U6 tương ứng là 93,33%, 
83,33%, 83,33% và 93,33%, 93,33%, 90%. Thời gian gây chết cá của các dòng này là 8-20 ngày. Cá chết 
có các biểu hiện biếng ăn, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục, xuất huyết rải rác trên vây.
Từ khoá: P. damselae, Cá biển, Bệnh tụ huyết trùng, Xuất huyết, Nhược độc, Đột biến.
Creating the attenuated mutant strains of Photobacterium damselae 
Le Minh Hai, Pham Thi Tam, To Long Thanh
SUMMARY
A bacteria strain signing T4.3, having the morphological, physiological and biochemical char-
acteristics of P. damsalae was isolated from the Pasteurellosis infected fish. It was used to cre-
ate the attenuated bacteria strains by ultraviolet (UV) and rifampicin. Applying these factors, 162 
modified clones, including 112 clones were generated by UV and 50 clones were obtained by 
rifampicin. By screening on the sheep blood agar medium, 6 bacteria strains without causing hae-
molysis were obtained. Of which, 4 bacteria strains namely T4.3K6, T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2 
were created by rifampicin, 2 bacteria strains namely T4.3U5, T4.3U6 were created by UV. These 
bacteria strains were used to evaluate the ability of causing disease in grouper in order to prove 
their virulence reduction. The studied result showed that 02 strains (T4.3K8.2, T4.3U6) were safer 
than 04 others. The survival rate of fish just after infection with dose of 104, 105, 106 CFU/ml of 
T4.3K8.2 and T4.3U6 was 93.33%, 83.33%, 83.33% and 93.33%, 93.33%, 90%, respectively. 
Lethal time of the experimental fish was from 8-20 days with the typical signs of Pasteurellosis, 
such as anorexia, pale gill, opaque convex ankle and haemorrhagic on the fins. 
Keywords: P. damselae, Seafish, Pasteurellosis, Haemorrhagic, Attenuated, Mutant.
1. Trường Đại học Vinh
2. Viện Đại học Mở Hà Nội
3. Trung tâm Chẩn đoán Thú y Quốc gia
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tụ huyết trùng ở cá (Photobacteriosis 
hay Pasteurellosis) còn được gọi là xuất huyết
nhiễm trùng, gây ra bởi vi khuẩn ưa mặn 
Photobacterium damselae.
Vi khuẩn P. damselae có thể tấn công và gây 
bệnh trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát 
triển của cá, từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến 
46
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ 1 - 2017
cá nuôi thương phẩm. Khi bị bệnh, cá có thể 
biểu hiện ở dạng mạn tính và cấp tính, biểu hiện 
bệnh tụ huyết trùng như: gây loét trên da, xuất 
hiện các nốt kem trắng hoặc u hạt tubercules 
màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại 
tử trong nội tạng, tập trung ở thận và lách, gây 
nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi (Evelyn, 1996, 
Romalde, 2002; Bames và các cộng sự, 2005). 
Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ cao 
từ 80-100%, gây thiệt hại kinh tế ở các nước 
như: Nhât, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, 
Thổ Nhĩ Kỳ. Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu 
hết các vùng nuôi trên cả nước.
Hiện nay, người nuôi cá biển chủ yếu sử 
dụng kháng sinh trong điều trị bệnh. Để giảm 
thiểu sử dụng kháng sinh, việc nghiên cứu tạo 
vacxin là rất cần thiết. Trong các phương pháp 
tạo vacxin, phương pháp tạo chủng vi khuẩn 
nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực 
nghiệm tạo ra vacxin sống nhược độc là phương 
pháp phổ biến và rất hữu hiệu.
Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích 
tạo chủng vi khuẩn P. damselae đột biến có độc 
lực giảm, làm nguyên liệu sản xuất vacxin để 
làm cơ sở cho công tác phòng bệnh ở một số 
loài cá nước mặn như cá mú, cá chẽm, cá hồng 
và cá giò.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Photobacterium damselae 
T4.3 có LD50 là 104,3 được phân lập từ 17 mẫu 
cá (cá mú, cá hồng, cá giò, cá bớp) có dấu hiệu 
của bênh tụ huyết trùng: có vết loét trên da, 
bong tróc vẩy, xuất huyết trên da, xuất huyết 
vây ngực, da tối mầu, bơi dữ dội khác thường, ở 
vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi 
khuẩn
P. damselae được phân lập trên các mẫu 
gan, thận, da, mắt, vây cá thu nghi mắc bệnh 
tụ huyết trùng. Nghiền mẫu trong dung dịch 
nước muối 1,5%, rồi tăng sinh trong môi trường 
BHI vô trùng. Nuôi lắc ở 28°C, 150 vòng/phút 
trong vòng 24 giờ. Canh khuẩn tăng sinh được 
pha loãng theo hệ số 10-1- 10-7 rồi cấy trên môi 
trường Marine agar. Nuôi trong tủ ấm ở điều 
kiện 28°C trong 24 giờ. Những khuẩn lạc có đặc 
điểm điển hình của vi khuẩn P. damselae trên 
môi trường Marine agar (khuẩn lạc hình tròn, 
lồi, bóng, có màu hồng hơi nâu hoặc màu trắng 
đục) được thu thập để xác định loài dựa trên đặc 
điểm hình thái vi khuẩn, đặc điểm sinh hóa, đặc 
điểm phân tử.
2.2.2. Phương pháp tạo chủng nhược độc 
bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm
2.2.2.1. Phương pháp gây đột biến giảm độc 
lực bằng tia cực tím
Chủng vi khuẩn P. damselae T4.3 được nuôi 
cấy tăng sinh trong môi trường Nutrient broth 
(Sigma, 70148) ở 28°C trong 24 giờ. Pha loãng 
sinh khối vi khuẩn để đạt mật độ 108cfu/ml 
(0.2 ở bước sóng OD600nm) rồi cấy trải trên 
môi trường Nutrient agar (Sigma, N9405). Đĩa 
cấy vi khuẩn được chiếu tia UV (cường độ ánh 
sáng 65 W) trong 1, 2, 3, 4, 5, 10 phút ở khoảng 
cách 30cm (Preecha et al., 2010). Đĩa xử lý UV 
được nuôi cấy trong tủ ấm 28°C, trong điều kiện 
không có ánh sáng cho đến khi xuất hiện các 
khuẩn lạc.
Các khuẩn lạc mọc trên đĩa được cấy lại trên 
môi trường Nutrient agar và tiếp tục xử lý UV với 
điều kiện như trên. Các khuẩn lạc trên đĩa xử lý 
UV lặp lại được cấy lại trên môi trường Nutrient 
agar, các khuẩn lạc có hình thái biến đổi được lựa 
chọn để đánh giá sự biến đổi về độc lực thông 
qua các phương pháp kiểm tra mức độ gây dung 
huyết và mức độ gây bệnh trên cá.
2.2.2.2. Phương pháp gây đột biến bằng kháng 
sinh rifampicin
Chủng vi khuẩn P. damselae T4.3 được nuôi 
cấy tăng sinh trong môi trường Nutrient broth 
(Sigma, 70148) ở 28°C trong 24 giờ. Pha loãng 
47
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ 1 - 2017
sinh khối vi khuẩn để đạt mật độ 108cfu/ml (0.2 
ở bước sóng OD600nm) rồi cấy trải trên môi 
trường Nutrient agar (Sigma, N9405). Lấy các 
khuẩn lạc đơn cấy chuyển sang môi trường 
Nutrient agar bổ sung kháng sinh rifampicin 
(Sigma, 5723476) nồng độ 5 µg/ml rồi tiếp 
tục nuôi cấy ở 28°C cho đến khi xuất hiện các 
khuẩn lạc.
Lấy ngẫu nhiên 2 khuẩn lạc riêng rẽ, đặt 
tên dòng rồi tiếp tục cấy riêng rẽ trên Nutrient 
agar bổ sung kháng sinh rifampicin (Sigma, 
5723476) với nồng độ tăng dần. Quá trình này 
lặp lại cho đến khi nồng độ kháng sinh đạt 250 
µg/ml. Ở mỗi bước, các khuẩn lạc được thu lại 
để đánh giá sự biến đổi về độc lực thông qua các 
phương pháp kiểm tra mức độ gây dung huyết 
và mức độ gây bệnh trên cá.
2.2.3. Đánh giá khả năng gây dung huyết của 
các chủng vi khuẩn đột biến 
Các dòng vi khuẩn đột biến được tăng sinh 
trong môi trường Nutrient broth (Sigma, 70148) 
rồi cấy gạt trên môi trường thạch máu (blood 
agar base- Sigma, 70133) + 5% máu cừu rồi 
nuôi trong tủ ấm 28oC. Kết quả phản ứng dung 
huyết được đọc sau 24 giờ.
2.2.4. Phương pháp gây nhiễm động vật thí 
nghiệm
Các dòng vi khuẩn đột biến đã được đánh 
giá giảm khả năng gây dung huyết, được tăng 
sinh trong môi trường Nutrient broth (Sigma, 
70148) ở 28°C trong 24 giờ. Pha loãng sinh khối 
vi khuẩn để đạt mật độ 105cfu/ml rồi tiêm phúc 
mạc cho cá mú có khối lượng 50-100g, khỏe 
mạnh và được nuôi 2 tuần trong bể của phòng 
thí nghiệm trước khi gây nhiễm.
Theo dõi cá trong 30 ngày, xác định liều 
LD
50 
theo công thức của Reed Muench, 1938. 
2.2.5. Phương pháp đánh giá khả năng tạo 
kháng thể bảo hộ
 Các dòng vi khuẩn đột biến đã được đánh giá 
giảm khả năng gây dung huyết và khả năng gây 
bệnh được tăng sinh trong môi trường Nutrient 
broth (Sigma, 70148) ở 28oC trong 24 giờ. Pha 
loãng sinh khối vi khuẩn để đạt mật độ 105 cfu/
ml, rồi tiêm phục mạc cho cá mú có khội lượng 
50-100g, khỏe mạnh, được nuôi trong bể nuôi 
phòng thí nghiệm 2 tuần trước khi gây nhiễm.
Sau 15 ngày gây miễn dịch, cá được thử 
thách bởi chủng tự nhiên T4.3 với liều công 
cường độc là 108 cfu/ml (Yong-hua Hu và cộng 
sự, 2012) theo dõi trong 4 tuần để đánh giá khả 
năng bảo hộ của dòng vi khuẩn đột biến giảm 
độc lực.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 
THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tạo dòng vi khuẩn Photobacterium 
damselae đột biến 
Từ chủng T4.3 được phân lập từ cá mắc bệnh 
tụ huyết trùng có các đặc điểm hình thái, đặc 
tính sinh lý, sinh hoá phù hợp với P. damselae, 
chúng tôi tiến hành sử dụng hai tác nhân là tia 
UV và rifampicin để tạo chủng nhược độc. Kết 
quả được trình bày ở bảng 1 và bảng 2.
Từ bảng 1, chúng tôi nhận thấy qua 6 đời 
chiếu UV ở cùng 1 mật độ vi khuẩn ban đầu 300 
cfu/đĩa và cường độ chiếu UV như nhau, chỉ 
khác nhau về thời gian chiếu giữa các lần, mật 
độ vi khuẩn sống sót tỷ lệ nghịch với thời gian 
chiếu. Sau đời chiếu thứ 3, khuẩn lạc vi khuẩn 
bắt đầu có sự biến đổi, khuẩn lạc chuyển từ dạng 
trơn bóng sang dạng nhám, bám chặt vào bề mặt 
môi trường nuôi cấy có thể là do có sự biến đổi 
về cấu trúc vỏ tế bào. Từ kết quả bảng 1, chúng 
tôi lựa chọn 112 dòng tế bào thu được sau đời 
xử lý UV thứ 3, với biểu hiện biến đổi hình thái 
khuẩn lạc để kiểm tra mức độ giảm độc lực.
Qua 8 đời sử dụng kháng sinh với nồng độ 
khác nhau, chúng tôi nhận thấy: số khuẩn lạc 
sống sót tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh 
bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Cũng như tác 
động của tia UV, rifampicin có thể gây biến đổi 
vách tế bào vi khuẩn, vì vậy dẫn tới sự biến đổi 
về hình thái khuẩn lạc. 
48
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ 1 - 2017
Bảng 1. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae đột biến nhược độc bằng tác nhân UV
TT Chủng vi khuẩn
Thời gian 
chiếu 
(phút)
Số khuẩn 
lạc sống sót 
(CFU/đĩa)
Hình thái khuẩn lạc
1 T 4.3(chủng gốc) 0 300 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm
2 T 4.3U1 1 59 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,2-1,8mm
3 T 4.3U2 2 56 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,2-1,5mm
4 T 4.3U3 3 55 Trắng, nhám, bám chặt vào bề mặt môi trường D = 1-1,3mm
5 T 4.3U4 4 25 Trắng, nhám, bám chặt vào bề mặt môi trường D=0,8-1,2mm
6 T 4.3U5 5 22 Trắng, nhám, bám chặt vào bề mặt môi trường D = 0,8-1mm
7 T 4.3U6 10 10 Trắng, nhám, bám chặt vào bề mặt môi trường D = 0,7-1mm
Bảng 2. Kết quả tạo chủng vi khuẩn P. damselae đột biến nhược độc 
bằng tác nhân kháng sinh Rifampicin
TT Chủng vi khuẩn
Nồng độ 
kháng sinh 
(µg/ml)
Số khuẩn lạc 
sống sót 
(CFU/đĩa)
Hình thái khuẩn lạc
1 T 4.3(chủng gốc) 0 300 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm
2 T 4.3K1 5 107 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm
3 T 4.3K2 10 98 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm
4 T 4.3K3 25 77 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm
5 T 4.3K4 50 53 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,5-2mm
6 T 4.3K5 100 33 Trắng trơn, tròn, bóng nhầy D = 1,4-1,8mm
7 T 4.3K6 150 25 Trắng, tròn, bóng D = 1,2-1,8mm
8 T 4.3K7 200 17 Trắng, tròn, bóng D = 1,2-1,8mm
9 T 4.3K8 250 8 Trắng, tròn, bóng D = 1,2-1,5mm
Từ kết quả ghi trong bảng 2, chúng tôi lựa 
chọn 50 dòng tế bào thu được sau đời xử lý 
rifampicin thứ 6, với biểu hiện biến đổi hình 
thái khuẩn lạc để kiểm tra mức độ giảm độc lực.
3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc 
lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium 
damselae đột biến
3.2.1. Đánh giá mức độ giảm khả năng dung 
huyết của các dòng vi khuẩn Photobacterium 
damselae đột biến
Độc tố dung huyết (haemolysin) là một trong 
những yếu tố gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn 
Photobacterium damselae đối với vật chủ. Độc 
tố haemolysin bám lên màng tế bào hồng cầu, 
làm thủng màng và giải phóng haemoglobin, 
gây hiện tượng dung huyết β. Đánh giá khả năng 
gây dung huyết của các chủng đột biến nhằm 
mục đích xem xét mức độ giảm độc lực của độc 
tố này thu được, kết quả ghi ở bảng 3 và hình 1.
Bằng phương pháp sàng lọc trên môi trường 
thạch máu cừu, chúng tôi đã thu được 6 dòng vi 
khuẩn không gây dung huyết, trong đó 4 dòng 
vi khuẩn T4.3K6, T4.3K7, T4.3K8.1, T4.3K8.2 
49
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ 1 - 2017
Bảng 3. Kết quả khả năng dung huyết của các dòng Photobacterium damselae đột biến
Dòng vi khuẩn
Số lượng 
các dòng 
không gây 
dung huyết
Số lượng các dòng gây dung huyết ở các độ pha loãng độc tố
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
Vi khuẩn xử lý UV
(n= 112) 2 110 110 110 110 110 110 92 87 72
Vi khuẩn xử lý 
rifampicin (n=50) 4 46 46 46 46 46 41 38 35 31
Hình 1. Hình ảnh dung huyết thạch máu của các dòng vi khuẩn thí nghiệm
(A: chủng T4.3 gây dung huyết β trên thạch máu cừu, B: Dòng T4.3K6 không gây dung huyết trên 
thạch máu cừu) 
được tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng 
rifampicin, 2 dòng vi khuẩn T4.3U5, T4.3U6 được 
tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng tia UV. 
Các dòng vi khuẩn gây dung huyết trên thạch 
máu được tăng sinh trong môi trường Nutrient 
Broth ở 280C trong 24 giờ. Sinh khối vi khuẩn 
được xử lý bằng kháng sinh norfloxacin nồng 
độ 30µg/ml để diệt vi khuẩn rồi ly tâm ở tốc độ 
10.000 vòng/phút, trong 15 phút. Dịch nổi được 
pha loãng theo hệ số 2 và cho kết hợp với hồng 
cầu cừu 5% để đánh giá mức độ gây dung huyết.
Nhìn chung 156 dòng vi khuẩn có biểu hiện 
thay đổi hình thái khuẩn lạc đều gây dung huyết 
hồng cầu cừu ở mức độ cao, 100% các dòng này 
đều gây dung huyết ở nồng độ pha loãng độc tố 
là 1/64. Ở các độ pha loãng 1/132, 1/256. 1/512, 
số lượng các dòng gây dung huyết giảm, lần lượt 
là 92, 87, 72 dòng xử lý UV và 38, 35, 31 dòng 
xử lý rifampicin (bảng 3). Kết quả này chứng 
tỏ các tác nhân gây đột biến có ảnh hưởng làm 
giảm độc lực của độc tố dung huyết ở một số 
dòng vi khuẩn được tạo ra, tuy nhiên mức độ 
không nhiều.
6 dòng vi khuẩn không còn độc tố dung 
huyết được sử dụng để đánh giá khả năng gây 
bệnh trên cá mú và chứng minh mức độ giảm 
độc lực của chúng.
3.2.2. Đánh giá mức độ giảm độc lực của các 
dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến
Trên đối tượng động vật mẫn cảm, chúng tôi 
50
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ 1 - 2017
Bảng 4. Kết quả gây nhiễm cho cá mú sau 15 ngày tiêm các dòng P. damselae đột biến
STT Dòng vi khuẩn
Liều 
gây nhiễm
(CFU/ml)
Số cá thí nghiệm
(con)
Số cá 
sống sót
(con)
Số cá chết
(con)
Tỷ lệ 
chết 
(%)
Tỷ lệ 
sống sót 
(%)
Thời gian 
chết
(ngày)
1
T4.3
(LD50=104,3 
CFU/ml)
104 30 2 28 93,33 6,67 3-7 ngày
105 30 1 29 96,67 3,33 3-7 ngày
106 30 0 30 100,00 - 3-7 ngày
2 T4.3K6
104 30 21 9 30,00 70,00 7-10 ngày
105 30 18 12 40,00 60,00 7-10 ngày
106 30 11 19 63,33 36,67 5-8 ngày
3 T4.3K7
104 30 22 8 26,67 73,33 8-10 ngày
105 30 21 9 30,00 70,00 8-10 ngày
106 30 15 15 50,00 50,00 8-10 ngày
4 T4.3K8.1
104 30 25 5 16,67 83,33 8-10 ngày
105 30 24 6 20,00 80,00 8-10 ngày
106 30 21 9 30,00 70,00 8-10 ngày
5 T4.3K8.2
104 30 28 2 6,67 93,33 8-15 ngày
105 30 25 5 16,67 83,33 8-15 ngày
106 30 25 5 16,67 83,33 8-20 ngày
6 T4.3U5
104 30 26 4 13,33 86,67 8-10 ngày
105 30 23 7 23,33 76,67 8-10 ngày
106 30 22 8 26,67 73,33 8-10 ngày
7 T4.3U6
104 30 28 2 6,67 93,33 18-20 ngày
105 30 28 2 6,67 93,33 18-20 ngày
106 30 27 3 10,00 90,00 15-18 ngày
8 Nước sinh lý 0 30 30 0 - 100,00
Nhìn chung, các dòng đột biến đều giảm 
độc lực đáng kể so với chủng giống gốc. Với 
các liều gây nhiễm là 104, 105, 106 CFU/ml 
(tương ứng với 1-100LD50), chủng tự nhiên 
T4.3 gây chết với tỷ lệ lần lượt là 93,33%, 
96,67% và 100%. Cá chết nhanh trong vòng 
3-7 ngày, có các biểu hiện đặc trưng của bệnh 
tụ huyết trùng do vi khuẩn P. damselae gây ra 
như: cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ 
thể có màu đen, đặc biệt ở vùng lưng và trên các 
vết thương tổn da, vây có thể sưng lên và bị lở 
loét, mang nhợt nhạt, mắt lồi, đục, lớp cơ dưới 
da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện 
dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp 
biểu bì. Lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử 
này lan nhanh, hoá lỏng và lách sẽ có màu đỏ 
anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của nó, 
gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. 
sử dụng cá mú có kích thước 3cm để gây nhiễm 
bằng 6 dòng vi khuẩn là T4.3K6, T4.3K7, 
T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5, T4.3U6 và 1 
dòng tự nhiên T4.3. Liều tiêm cho mỗi con cá 
là 0,2 ml canh khuẩn chứa 104, 105, 106 CFU/ml.
Cá thí nghiệm được nuôi trong điều kiện 
tương tự với điều kiện tự nhiên, thời gian theo 
dõi là 30 ngày. Kết quả tiến hành gây nhiễm 
thực nghiệm cụ thể ở bảng 4.
51
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXIV SỐ 1 - 2017
Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất huyết, 
tim xuất hiện các vết nâu đen.
So sánh độc lực của 6 dòng đột biến, chúng 
tôi nhận thấy 2 dòng: T4.3K8.2, T4.3U6 là an 
toàn hơn so với 4 dòng còn lại: tỷ lệ cá sống sót 
sau khi gây nhiễm với các liều 104, 105, 106 CFU/
ml của dòng T4.3K8.2, T4.3U6 tương ứng là: 
93,33%, 83,33%, 83,33% và 93,33%, 93,33%, 
90%. Thời gian gây chết cá của các dòng này 
là 8-20 ngày. Cá chết có các biểu hiện biếng ăn, 
mang nhợt nhạt, mắt lồi, đục, xuất huyết rải rác 
trên vây.
Như vậy, từ kết quả thu được của các thí 
nghiệm gây đột biến và đánh giá mức độ giảm 
độc lực, chúng tôi đã xác định được 2 dòng vi 
khuẩn giảm độc lực, đó là dòng: T4.3K8.2, và 
T4.3U6.
IV. KẾT LUẬN 
T ừ c h ủ n g v i k h u ẩ n g ố c ( T 4 . 3 ) 
Photobacterium damselae bằng phương pháp 
gây đột biến thực nghiệm dùng rifampicin và 
tia UV qua các đời sử dụng có biểu hiện biến 
đổi hình thái vi khuẩn và giảm độc lực. Kết quả 
đã tạo ra 6 dòng đột biến là T4.3K6, T4.3K7, 
T4.3K8.1, T4.3K8.2, T4.3U5 và T4.3U6. Đánh 
giá mức độ giảm độc lực cho thấy 2 dòng vi 
khuẩn giảm độc lực, có thể sử dụng làm nguyên 
liệu để sản xuất vacxin, đó là dòng: T4.3K8.2 
và T4.3U6.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Botella S., Pujalte M.-J., Maciasn M.-C., 
Hernandez J. and Garay E. (2002). Amplified 
fragment length polymorphism (AFLP) 
and biochemical typing of Photobacterium 
damselae subsp. Damselae. Journal of 
Applied Microbiology, Volume 93, Issue 4, 
681–688.
2. Fouz B., Toranzo, A.E., Millan, M. & Amaro, 
C. (2000). Evidence that water transmits 
the disease caused by the fish pathogen 
Photobacterium damselae subsp.Journal of 
Applied Microbiology 88: 531-535.
3. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy 
Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học 
thủy sản. NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ 
Chí Minh.
4. Lê Thanh Hoà (2006), Y – Sinh học phân 
tử (Quyển 1). Nhà xuất bản Y học. Hà Nội.
5. Labella A., C. Berbel, M. Manchado, 
D. Castro and J. J. Borrego (2011). 
Photobacterium damselae subsp. damselae, 
an emerging pathogen affecting new culture 
marine fish species in Southern Spain. 
Archives of virology 142, 2345-2364.
6. Laganas Pasqualina, Gabriella Caruso, 
Eleonora Minutoli, Renata Zaccone, Santi 
Delia (2011). Susceptibility to antibiotics 
of Vibrio spp and Photobacterium damselae 
ssp. piscicida strains isolated from Italian 
aquaculture farms. The new microbiologica 
34, 1/2011, 53-63.
7. Trần Phước Linh (2008), “Phương pháp 
phân tích vi sinh vật”, Nhà xuất bản giáo 
dục.
8. Osorio C. R., Romalde J. L., Barja J. 
L., Toranzo A. E. (2000). Presence of 
phospholipase D (dly) gene coding for 
damselysin production is not a pre-requisite 
for pathogeniCity in Photobacterium 
damselae subsp. damselae. Microb. Pathol. 
28:119–126.
9. Rajan P.R., J.H.-Y. Lin, M.-S. Ho and H.-
L. Yang (2003). Simple and rapid detection 
of Photobacterium damselae ssp. piscicida 
by a PCR technique and plating method. 
Journal of Applied Microbiology 95, 1375–
1380. 
10. Romalde Jesu´s L. (2002). Photobacterium 
damselae subsp. piscicida: an integrated 
view of a bacterial fish pathogen. Int 
Microbiol 5: 3–9.
Nhận ngày 18-10-2016
Phản biện ngày 18-11-2016