Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê

Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 367-372, 2017 
367 
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA METAGENOME HỆ VI KHUẨN 
TRONG DẠ CỎ DÊ 
Lê Ngọc Giang1, Lưu Hàn Ly2, Nguyễn Mai Phương1, Lê Tùng Lâm1, Đỗ Thị Huyền1, Phùng Thu 
Nguyệt1, Trương Nam Hải1, * 
1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
2Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 
* Người chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail: tnhai@ibt.ac.vn 
Ngày nhận bài: 10.6.2016 
Ngày nhận đăng: 20.5.2017 
TÓM TẮT 
 Hệ vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn trong dạ cỏ của các động vật nhai lại là nguồn gen có giá trị được nhiều 
nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Trong những năm gần đây, để khai thác hiệu quả nguồn gen, DNA đa hệ 
gen của vi khuẩn trong mỗi môi trường sinh thái thường được tách chiết và giải mã trực tiếp bằng hệ thống giải 
trình tự thế hệ mới dựa trên công nghệ Metagenomics. Tuy nhiên, để có được bộ dữ liệu DNA metagenome tốt 
cho khai thác gen thì chất lượng của DNA tách chiết cần phải đảm bảo tiêu chuẩn. Trong nghiên cứu này, 
chúng tôi đánh giá hiệu quả tách chiết DNA metagenome vi khuẩn trong dịch dạ cỏ dê bằng năm phương pháp 
RBB (sử dụng hạt thủy tinh), RBBC (sử dụng hạt thủy tinh và tinh sạch bằng cột Qiagen), PSP1, PSP2 
(PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 1, 2, Đức) và QIA (QIAamp® DNA Stool Mini Kit, Đức). Kết quả, DNA 
metagenome tách từ năm phương pháp đều có chỉ số A260/280 đạt trên 1,8. Mặc dù phương pháp RBB cho 
nồng độ DNA cao hơn nhưng do không được tinh chế nên DNA từ mẫu này có chỉ số A260/230 thấp, chỉ đạt 
khoảng 1,4 và trong mẫu vẫn còn chất ức chế Taq polymerase. Mẫu tách từ RBB sau khi được tinh sạch lại 
bằng cột Qiagen có chỉ số A260/230 tăng lên đáng kể, đạt khoảng 2,0 và không còn chất ức chế Taq 
polymerase nhưng hàm lượng cũng như nồng độ DNA metagenome giảm 57% và đạt gần tương đương với 
DNA metagenome tách bằng QIA. Phương pháp sử dụng kit tách chiết PSP®Spin Stool DNA cho nồng độ 
DNA metagenome thu được cao nhất (từ 149,7 đến 195,5 ng/µl), chỉ số A260/280 đạt khoảng 1,9 và A260/230 
đạt 1,8-1,9, không còn chất ức chế Taq polymerase và tiêu tốn ít thời gian. Vì vậy, đây là phương pháp thích 
hợp cho tách chiết DNA metagenome của vi khuẩn trong ruột dê. DNA thu được từ phương pháp này đủ chất 
lượng cho việc giải trình tự bằng thiết bị giải trình tự DNA thế hệ mới Illumina.	
Từ khóa: Dạ cỏ dê, DNA metagenome, vi khuẩn, nồng độ, khả năng ức chế polymerase 
MỞ ĐẦU 
 Dê cũng như một số động vật nhai lại sử dụng 
nguồn thức ăn chủ yếu là cỏ, rơm rạ. Để tiêu hóa 
được nguồn thức ăn nghèo dinh dưỡng này, động vật 
nhai lại có hệ tiêu hóa phù hợp với dạ dày kép gồm 
bốn ngăn: dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách và dạ múi khế. 
Dạ cỏ là dạ lớn nhất và là môi trường sinh sống của 
hệ vi sinh vật phong phú. Ước tính có khoảng 1011 tế 
bào vi sinh vật trên một gram dịch dạ cỏ, bao gồm vi 
khuẩn, tảo (Kim et al., 2011), nấm, động vật nguyên 
sinh (Fouts et al., 2012) và virus (Berg Miller et al., 
2012) thuộc nhiều loài và chi khác nhau. Hệ vi sinh 
vật này tham gia vào chuyển hóa lignocellulose 
thành đường đơn, cung cấp năng lượng cho cơ thể. 
Vì vậy, đây là nguồn gen tiềm năng cho việc khai 
khác gen mã hóa enzyme phân giải lignocellulose. 
Metagenomics (nghiên cứu đa hệ gen) là phương 
pháp nghiên cứu (phân tích) đa hệ gen 
(Metagenome) của tất cả các vi sinh vật thu nhận 
trực tiếp từ mẫu môi trường tự nhiên (Handelsman, 
2004, Streit ,Schmitz, 2004, Hogan et al., 1988). Từ 
đó, rất nhiều thư viện DNA metagenome của vi sinh 
vật trong các môi trường sống đã được xây dựng 
nhằm khai thác gen cũng như nghiên cứu sự đa dạng 
vi sinh vật, ví dụ môi trường nước biển (Schloss, 
Handelsman, 2003, Breitbart et al., 2002, Venter et 
al., 2004), môi trường đất (Xu et al., 2014) Để có 
được kết quả phân tích dữ liệu DNA metagenome 
đáng tin cậy, thì trước hết DNA metagenome được 
Lê Ngọc Giang et al. 
368 
tách chiết phải đảm bảo về chất lượng và nồng độ. 
Yêu cầu đối với mẫu DNA metagenome dùng cho 
giải trình tự bằng hệ thống giải trình tự mới là 
A260/280 phải đạt trên 1,8 và A260/230 trên 1,5, tức 
là mẫu phải sạch protein cũng như các chất thứ cấp 
khác, đặc biệt là acid formic. Nhìn trên điện di đồ, 
DNA metagenome phải đảm bảo tính toàn vẹn, 
không bị phân cắt, và nồng độ phải đạt trên 50 ng/µl. 
Đồng thời, mẫu DNA metagenome không còn chất 
ức chế enzyme tổng hợp chuỗi ví dụ như enzyme 
polymerase. Do vậy, đối với mỗi hệ sinh thái mini, 
việc khảo sát các phương pháp tách chiết DNA đa hệ 
gen của vi sinh vật là rất cần thiết. Nhiều nghiên cứu 
đã được thực hiện nhằm kiểm tra ảnh hưởng của 
phương pháp tách chiết tới chất lượng DNA phân lập 
từ các nguồn khác nhau (Krsek ,Wellington, 1999, 
Cuív et al., 2011, McOrist et al., 2002), trong đó có 
dạ cỏ (Chen et al., 2015, Henderson et al., 2013). 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành so sánh 
hiệu quả của các phương pháp tách chiết DNA 
metagenome từ dạ cỏ dê thu thập tại Ninh Bình, Ba 
Vì, Thanh Hóa để tiến tới giải trình tự DNA đa hệ 
gen phục vụ cho việc khai thác các gen mã hóa 
protein, enzyme có đặc tính quí, có giá trị sử dụng 
trong công nghiệp, nông nghiệp, y, dược. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu dịch dạ cỏ dê 
 Dê trưởng thành (6 tháng đến 2 năm tuổi) được 
lựa chọn ngẫu nhiên từ các đàn dê chăn thả tự nhiên 
của các trại chăn nuôi ở các tỉnh Thanh Hóa, Ninh 
Bình và huyện Ba Vì (Hà Nội). Dạ cỏ được lấy trực 
tiếp tại trại nuôi, được bảo quản lạnh để đưa về 
phòng thí nghiệm tiến hành các bước thu DNA 
metagenome vi sinh vật. Toàn bộ dịch trong dạ cỏ 
được thu và lọc qua vải bốn lớp để loại xác thức ăn. 
Dịch lọc sau đó được ly tâm phân đoạn nhiều lần để 
loại bỏ tạp chất. Cuối cùng, dịch chứa vi sinh vật 
được hòa với glycerol 25% trong đệm PBS pH 7,0 
và được bảo quản ở nhiệt độ -80oC. 
Các phương pháp tách chiết DNA metagenome 
 Các phương pháp tách chiết DNA metagenome 
sử dụng trong nghiên cứu này được tham khảo từ 
một số nghiên cứu trên thế giới. Chúng tôi lựa chọn 
ra năm phương pháp được liệt kê trong Bảng 1. Các 
phương pháp được tiến hành dựa trên hướng dẫn của 
nhà sản xuất hoặc tác giả. Mỗi phương pháp được 
thực hiện với mỗi 200 µl mẫu dịch dạ cỏ dê và lặp 
lại ít nhất ba lần. 
Bảng 1. Các phương pháp tách chiết DNA được sử dụng trong nghiên cứu. 
Phương pháp 
Tên viết tắt Ghi chú Tài liệu tham khảo / 
Hãng sản xuất 
Repeated bead beating plus column RBBC (Yu, Morrison, 2004) 
Repeated bead beating RBB Thực hiện tương tự phương 
pháp RBBC nhưng không có 
bước sử dụng cột tinh sạch 
PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 1 PSP1 Theo hướng dẫn protocol 1 của 
nhà sản xuất 
Invitek GmbH, Berlin, 
Đức 
PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 2 PSP2 Theo hướng dẫn protocol 2 của 
nhà sản xuất 
Invitek GmbH, Berlin, 
Đức 
QIAamp® DNA Stool Mini Kit QIA Theo hướng dẫn protocol 1 của 
nhà sản xuất 
QIAgen, Hilden, Đức 
Kiểm tra chất lượng và tính toàn vẹn của DNA 
metagenome 
 Nồng độ DNA metagenome tách chiết được từ 
mỗi phương pháp được kiểm tra bằng máy quang 
phổ Nanodrop (Implen GmbH, Đức). Độ tinh sạch 
của DNA được xác định bởi giá trị A260/280 và 
A260/230. Từng mẫu DNA được điện di kiểm tra 
trên gel agarose 0,8% với DNA chuẩn 1 kb 
(Fermentas). 
Nhân bội bằng PCR với cặp mồi 16S rDNA vi 
khuẩn 
 DNA metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ sau 
quá trình tách chiết bằng các phương pháp khác nhau 
được tiến hành khuếch đại gen 16S rDNA bằng cặp 
mồi 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 
1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′) 
(Rainey et al., 1996) để đánh giá sự tồn tại của chất 
ức chế polymerase có trong mẫu. PCR được thực 
Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 367-372, 2017 
369 
hiện trên máy Mastercycler® gradient (Eppendorf, 
Netheler – Hinz GmbH, Hamburg, Đức) với chu 
trình phản ứng gồm 30 chu kỳ (pha biến tính 94oC, 1 
phút; pha gắn mồi 58oC, 1 phút và pha kéo dài 72oC, 
1 phút 30 giây). Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra 
trên gel agarose 0,8%. 
Phân tích thống kê 
 Dữ liệu thu được được phân tích bằng phần mềm 
GraphPad Prism 5. Giá trị thu được biểu diễn dưới 
dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp 
lại thí nghiệm. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Tách chiết DNA metagenome và đánh giá chất 
lượng của mẫu 
 Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 5 
phương pháp tách chiết khác nhau để phân lập DNA 
metagenome từ dịch dạ cỏ dê. Trong đó, phương 
pháp PSP1, PSP2 và QIA hoàn toàn sử dụng các kit 
tách DNA thương mại. Phương pháp RBBC dựa trên 
mô tả của Yu và Morrison (2004) là phương pháp 
kết hợp phá tế bào bằng hạt thủy tinh trong đệm 
EDTA chứa muối và SDS và tinh sạch bằng cột 
QIAgen kit. Ngoài ra, chúng tôi tiến hành song song 
phương pháp RBB dựa trên phương pháp RBBC 
nhưng không tiến hành tinh sạch qua cột để so sánh. 
 Hàm lượng DNA cũng như các chỉ số A260/280 
và A260/230 thu được khi sử dụng các phương pháp 
tách chiết khác nhau được kiểm tra bằng máy 
Nanodrop (Bảng 2). Nồng độ DNA thu được cao hơn 
đáng kể khi tách chiết bằng kit PSP, lần lượt là 149,7 
và 195,5 ng/µl cho protocol 1 và 2 và phương pháp 
RBB là 143,5 ng/µl. Tuy nhiên, đối với DNA tách 
chiết bằng phương pháp RBB sau đó sử dụng cột 
tinh sạch QIAgen (RBB+C) nồng độ DNA 
metagenome đã bị giảm đi hơn hai lần. Yu và 
Morrison (2004) đã phát triển phương pháp tách 
chiết RBBC và ứng dụng trên đối tượng là dịch dạ cỏ 
bò (Yu, Morrison, 2004). Kết quả nghiên cứu của hai 
tác giả cho thấy phương pháp này có khả năng tách 
chiết được lượng lớn DNA vi sinh vật vượt trôi khi 
so sánh với hai kit thương mại là QIAamp® DNA 
Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) và 
FastDNA® SPIN Kit (Qbiogene, Carlsbad, CA, 
USA). Tương tự, kết quả so sánh hiệu quả tách chiết 
của 15 phương pháp do Henderson và đồng tác giả 
(2013) thực hiện trên bò và cừu cũng cho thấy nồng 
độ DNA vi sinh vật dạ cỏ tách chiết bằng phương 
pháp RBBC cao hơn các phương pháp sử dụng kit 
(Henderson et al., 2013). Nguyên nhân có thể do 
trong quá trình xử lý mẫu, chúng tôi đã thực hiện 
nhiều bước ly tâm phân đoạn nhằm mục đích thu 
được chủ yếu mẫu vi khuẩn nên lượng DNA thu 
được không cao như các nghiên cứu này. Như vậy, 
có lẽ phương pháp xử lý mẫu và đối tượng đã có ảnh 
hưởng tới nồng độ DNA vi sinh vật tách chiết bằng 
RBBC. Mặc dù vậy, những nghiên cứu này cũng cho 
thấy tính ổn định của các kit thương mại khi sử dụng 
trên các đối tượng khác nhau. Nồng độ DNA tách 
chiết trực tiếp theo kit QIAgen luôn thấp hơn so với 
các phương pháp còn lại trong nghiên cứu của chúng 
tôi tương đồng với các nghiên cứu đã nêu trên và 
một số nghiên cứu khác (Chen et al., 2015). 
Bảng 2. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA metagenome sử dụng các phương pháp tách chiết khác nhau. 
Phương pháp Nồng độ DNA metagenome 
(ng/µl) 
A260/280 A260/230 
RBBC 61,70 ± 28,84 1,930 ± 0,111 2.097 ± 0,387 
RBB 143,5 ± 20,51 1,878 ± 0,011 1,462 ± 0,008 
PSP1 149,7 ± 29,94 1,921 ± 0,031 1,832 ± 0,394 
PSP2 195,5 ± 98,29 1,893 ± 0,001 1,902 ± 0,020 
QIA 55,93 ± 42,34 1,887 ± 0,096 1,797 ± 0,677 
 Dịch dạ cỏ của dê cũng như các động vật ăn cỏ 
khác chứa nhiều tạp chất có nguồn gốc từ thực vật 
như tannin, saponin, mimosine và nitrate-nitrite 
(Kamra, 2005). Trong đó, tannin và một số hợp chất 
chứa nhóm phenol tự do có khả năng ảnh hưởng đến 
hiệu quả sử dụng DNA tách chiết cho các mục đích 
sinh học phân tử như PCR, cắt giới hạn và giải trình 
tự do ức chế hoạt động của enzyme polymerase và 
endonuclease (Porebski et al., 1997, Kontanis, Reed, 
2006). Do đó, ngoài hàm lượng DNA, chất lượng 
của DNA tách chiết còn xác định dựa trên các chỉ số 
A260/230 (xác định sự có mặt của carbohydrate, hợp 
chất chứa nhóm phenol) và A260/280 (cho protein). 
DNA được cho là “sạch” nếu chỉ số A260/280 trên 
Lê Ngọc Giang et al. 
370 
1,8 và A260/230 trên 2,0 (có thể chấp nhận từ 1,5 
đến 1,8). Tất cả các phương pháp tách chiết DNA 
metagenome được sử dụng cho nghiên cứu này đều 
cho kết quả chỉ số A260/280 trên 1,8. DNA tách 
chiết cũng đạt tiêu chuẩn về hàm lượng carbohydrate 
và hợp chất phenol trong mẫu, chỉ có phương pháp 
RBB cho kết quả A260/230 thấp (1,462). Điều này 
cho thấy, các phương pháp đều có khả năng loại bỏ 
protein trong quá trình tách chiết nhưng chỉ phương 
pháp có sử dụng cột tinh sạch mới có thể loại bỏ 
đáng kể các hợp chất không mong muốn khác trong 
mẫu DNA tách chiết từ dạ cỏ dê. Như vậy, DNA 
tách chiết từ các phương pháp RBBC, sử dụng kit 
thương mại PSP hoặc QIAgen đều đạt tiêu chuẩn độ 
tinh sạch ở cả hai chỉ số A260/280 và A260/230. 
 DNA metagenome sau mỗi lần tách chiết bằng 
các phương pháp được điện di kiểm tra trên gel 
agarose 0,8% (Hình 1). Kết quả điện di cho thấy 
các thí nghiệm đều thu được các băng có kích thước 
lớn hơn 10 kb. Riêng DNA tách chiết bằng phương 
pháp RBB tuy có nồng độ cao nhưng khi điện di 
kiểm tra cho thấy các vệt DNA kéo dài. Có thể 
trong quá trình tách chiết, hạt thủy tinh không chỉ 
phá màng tế bào vi DNA metagenome sau mỗi lần 
tách chiết bằng các phương pháp được điện di kiểm 
tra trên gel agarose 0,8% (Hình 1). Kết quả điện di 
cho thấy các thí nghiệm đều thu được các băng có 
kích thước lớn hơn 10 kb. Riêng DNA tách chiết 
bằng phương pháp RBB tuy có nồng độ cao nhưng 
khi điện di kiểm tra cho thấy các vệt DNA kéo dài. 
Có thể trong quá trình tách chiết, hạt thủy tinh không 
chỉ phá màng tế bào vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến 
DNA giải phóng ra. Sau khi thực hiện đầy đủ quy 
trình tách chiết RBBC, các vệt DNA không còn 
nhiều do màng của cột tinh sạch chỉ giữ lại chủ yếu 
DNA kích thước lớn. 
1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 M Kb
10
A B C D E 
Hình 1. So sánh DNA metagenome thu được từ các phương pháp tách chiết khác nhau: (A) RBB, (B) RBBC, (C) PSP1, (D) 
PSP2 và (E) QIA. 1-3: Ba lần lặp lại thí nghiệm. M: DNA chuẩn 1 Kb (Fermentas) 
Đánh giá khả năng tồn tại chất ức chế polymerase 
trong mẫu DNA metagenome 
 Để khẳng định chắc chắn DNA thu được có thể 
sử dụng để giải trình tự phục vụ mục đích khai thác 
dữ liệu DNA metagenome, chúng tôi tiến hành thực 
hiện khuếch đại gen mã cho 16S rRNA vi khuẩn 
bằng PCR với cặp mồi 1527R-27F đối với DNA thu 
được từ các phương pháp tách chiết sau khi đưa về 
cùng nồng độ. PCR là phương pháp phổ biến, dễ 
dàng được sử dụng trong các nghiên cứu để kiểm tra 
chất lượng DNA có đạt chuẩn cho các ứng dụng 
phân tử về sau hay không (Tang et al., 2008, 
Scupham et al., 2007) cũng như phản ứng kéo dài 
chuỗi được sử dụng trong công nghệ giải trình tự gen 
thế hệ mới. PCR mẫu DNA tách chiết cho kết quả 
dương tính tức là mẫu hầu như không chứa các chất 
có khả năng ức chế enzyme DNA polymerase hoặc 
enzyme cắt. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel 
agarose tương ứng với dự đoán. Các mẫu tách có hai 
chỉ số A260/280 và A260/230 đạt tiêu chuẩn, chúng 
tôi đều quan sát thấy có băng sản phẩm PCR có kích 
thước khoảng 1500 bp. Riêng mẫu tách chiết bằng 
phương pháp RBB sau phản ứng không thu được 
băng sản phẩm nào. Điều này phản ánh đúng kết quả 
đo chỉ số A260/230, chứng tỏ trong mẫu còn chứa 
nhiều tạp chất ảnh hưởng tới hiệu quả của PCR. 
 Tóm lại, các phương pháp đều mang lại hiệu quả 
tách chiết nhất định. Trong đó, các phương pháp 
RBBC, PSP1, PSP2 và QIA cho kết quả thu được 
DNA đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch, có thể sử dụng 
cho các thí nghiệm về sau như PCR, cắt giới hạn 
hoặc giải trình tự. Xét về hiệu quả tách chiết, thực 
hiện phương pháp RBBC cần từ 20 đến 30 phút 
trong khi sử dụng kit tinh sạch thương mại tiêu tốn ít 
thời gian hơn nhưng hàm lượng DNA thu được 
tương đương hoặc cao hơn. 
Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 367-372, 2017 
371 
PC 1 2 3 M PC 1 2 3 M PC 1 2 3 1 2 3 M PC 1 2 3 M 
Bp
1500
RBB RBBC PSP1 PSP2 QIA
A B C D 	
Hình 1. Sản phẩm PCR khuếch đại gen mã cho 16S rDNA của các mẫu DNA thu được từ các phương pháp tách chiết khác 
nhau: (A) RBB, (B) RBBC, (C) PSP và (E) QIA. PC: Đối chứng dương (mẫu DNA tổng số của vi khuẩn Staphylococcus). 1-
3: Ba lần lặp lại thí nghiệm. M: DNA chuẩn 1 Kb (Fermentas) 
KẾT LUẬN 
 Chúng tôi đã thử nghiệm 5 phương pháp khác 
nhau là RBB, RBBC, PSP1, PSP2 và QIA để tách 
chiết DNA metagenome của vi khuẩn dạ cỏ dê. Kết 
quả cho thấy, tách chiết bằng kit PSP cho sản phẩm 
DNA có chất lượng đảm bảo cho giải trình tự DNA 
metagenome bằng hệ thống HiSeq 2000 (Illumina) 
với chỉ số A260/280 là 1,893; A260/230 là 1,902 và 
nồng độ cao nhất đạt 195,5 ng/µl. 
Lời cảm ơn: Công trình được hỗ trợ về kinh phí của 
đề tài Độc lập cấp nhà nước mã số ĐTĐLCN.15/14: 
“Nghiên cứu metagenome của một số hệ sinh thái 
mini tiềm năng nhằm khai thác các gen mới mã hóa 
hệ enzyme chuyển hóa hiệu quả lignocellulose"	và sử 
dụng trang thiết bị của phòng Thí nghiệm trọng điểm 
công nghệ gen, viện Công nghệ sinh học, viện Hàn 
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Berg MME, Yeoman CJ, Chia N, Tringe SG, Angly FE, 
Edwards RA, Flint HJ, Lamed R, Bayer EA, White BA 
(2012) Phage–bacteria relationships and CRISPR elements 
revealed by a metagenomic survey of the rumen 
microbiome. Environ Microbiol 14: 207-227. 
Breitbart M, Salamon P, Andresen B, Mahaffy JM, Segall 
AM, Mead D, Azam F, Rohwer F (2002) Genomic 
analysis of uncultured marine viral communities. Proc 
Natl Acad Sci USA 99: 14250-14255. 
Chen YB, Lan DL, Tang C, Yang XN, Li J (2015) Effect 
of DNA extraction methods on the apparent structure of 
Yak rumen microbial communities as revealed by 16S 
rDNA sequencing. Polish J Microbiol 64: 29-36. 
Cuív PÓ, De Cárcer DA, Jones M, Klaassens ES, 
Worthley DL, Whitehall VL, Kang S, Mcsweeney CS, 
Leggett BA, Morrison M (2011) The effects from DNA 
extraction methods on the evaluation of microbial diversity 
associated with human colonic tissue. Microb Ecol 61: 
353-362. 
Fouts DE, Szpakowski S, Purushe J, Torralba M, 
Waterman RC, Macneil MD, Alexander LJ, Nelson KE 
(2012) Next generation sequencing to define prokaryotic 
and fungal diversity in the bovine rumen. PloS ONE 7: 
e48289. 
Handelsman J (2004) Metagenomics: application of 
genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol 
Biol Rev 68: 669-685. 
Henderson G, Cox F, Kittelmann S, Miri VH, Zethof M, 
Noel SJ, Waghorn GC, Janssen PH (2013) Effect of DNA 
extraction methods and sampling techniques on the 
apparent structure of cow and sheep rumen microbial 
communities. PLoS ONE 8: e74787. 
Hogan M, Schulz M, Slaytor M, Czolij R, O'brien R 
(1988) Components of termite and protozoal cellulases 
from the lower termite, Coptotermes lacteus froggatt. 
Insect Biochem 18: 45-51. 
Kamra D (2005) Rumen microbial ecosystem. Curr Sci 89: 
124-135. 
Kim M, Morrison M, Yu Z (2011) Status of the 
phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes. 
FEMS Microbiol Ecol 76: 49-63. 
Kontanis EJ, Reed FA (2006) Evaluation of real‐time PCR 
amplification efficiencies to detect PCR inhibitors. J 
Forensic Sci 51: 795-804. 
Krsek M, Wellington E (1999) Comparison of different 
methods for the isolation and purification of total 
community DNA from soil. J Microbiol Meth 39: 1-16. 
Mcorist AL, Jackson M, Bird AR (2002) A comparison of 
five methods for extraction of bacterial DNA from human 
faecal samples. J Microbiol Meth 50: 131-139. 
Porebski S, Bailey LG, Baum BR (1997) Modification of a 
CTAB DNA extraction protocol for plants containing high 
polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol 
Biol Reporter 15: 8-15. 
Lê Ngọc Giang et al. 
372 
Rainey FA, Ward-Rainey N, Kroppenstedt RM, 
Stackebrandt E (1996) The genus Nocardiopsis represents 
a phylogenetically coherent taxon and a distinct 
actinomycete lineage: proposal of Nocardiopsaceae fam. 
nov. Int J Syst Evol Microbiol 46: 1088-1092. 
Schloss PD, Handelsman J (2003) Biotechnological 
prospects from metagenomics. Curr Opin Biotechnol 14: 
303-310. 
Scupham A, Jones J, Wesley I (2007) Comparison of DNA 
extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. 
J Appl Microbiol 102: 401-409. 
Streit WR, Schmitz RA (2004) Metagenomics-the key to 
the uncultured microbes. Curr Opin Microbiol 7: 492-498. 
Tang JN, Zeng ZG, Wang HN, Yang T, Zhang PJ, Li YL, 
Zhang AY, Fan WQ, Zhang Y, Yang X (2008) An 
effective method for isolation of DNA from pig faeces and 
comparison of five different methods. J Microbiol Meth 75: 
432-436. 
Venter JC, Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, 
Rusch D, Eisen JA, Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson 
W, Fouts DE, Levy S, Knap AH, Lomas MW, Nealson K, 
White O, Peterson J, Hoffman J, Parsons R, Baden-Tillson 
H, Pfannkoch C, Rogers YH, Smith HO (2004) 
Environmental genome shotgun sequencing of the 
Sargasso Sea. Sci 304: 66-74. 
Xu Z, Hansen MA, Hansen LH, Jacquiod S, Sorensen SJ 
(2014) Bioinformatic approaches reveal metagenomic 
characterization of soil microbial community. PLoS ONE 
9: e93445. 
Yu Z, Morrison M (2004) Improved extraction of PCR-
quality community DNA from digesta and fecal samples. 
Biotechniques 36: 808-813. 
INVESTIGATION OF METHODS FOR EXTRACTION OF BACTERIAL DNA 
METAGENOME FROM GOAT RUMEN 
Le Ngoc Giang1, Luu Han Ly2, Nguyen Mai Phuong1, Le Tung Lam1, Do Thi Huyen1, Phung Thu 
Nguyet1, Truong Nam Hai1 
1Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology 
2Hanoi University of Science, Vietnam National University 
SUMMARY 
 Microorganisms, particularly bacteria, in the ruminant's rumen are valuable genetic resources that many 
scientists interested in. In recent years, the application of next-generation sequencing technologies allows 
direct decoding an extracted DNA metagenome in each ecological community without culture, increasing the 
efficiency of exploiting interested genes. Notably, the quantity and quality of extracted DNA play an important 
role in getting a reliable metagenome database. In this study, DNA metagenome from goat rumen fluid was 
extracted by five different methods RBB (repeated bead beating plus column), RBBC (repeated bead beating), 
PSP1, PSP2 (PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 1, 2, Germany) và QIA (QIAamp® DNA Stool Mini Kit, 
Germany). The results showed that DNA metagenome obtained by all methods had A260/280 greater than 1.8. 
DNA extracted by the RBB method had high DNA concentration but low A260/230 values (less than 1.4) and 
still contained Taq polymerase inhibitor. After purifying by QIA column, A260/230 values of RBB-extracted 
DNA significantly increased up to 2.0 and Taq polymerase inhibitor in samples were removed. However, the 
concentrations decreased by 57% that nearly equivalent to concentration of DNA metagenome obtained by 
QIA. The method using PSP®Spin Stool DNA kit produced the highest DNA concentrations (from 149.7 to 
195.5 ng/µl) with A260/280 ratios of 1.9 and A260/230 ratios of 1.8 to 1.9. Morever, this method was able to 
remove polymerase inhibitor and be performed on short time. Therefore, the PSP®Spin Stool DNA kit is a 
suitable method for DNA metagenome extraction of bacteria from goat rumen. DNA obtained by this method 
fulfilled all criteria about quality and concentration for sequencing by next-generation sequencing Illumina. 
Keywords: bacteria, concentration, DNA metagenome, goat rumen, polymerase inhibitor