Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101-106 
101 
Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào của một số chủng 
Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng 
trong xử lý nước thải 
Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà*, Vũ Minh ðức, Chu Văn Mẫn 
Khoa Sinh, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam 
Nhận ngày 02 tháng 4 năm 2007 
Tóm tắt. Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, ña dạng về sinh thái. Các 
loài Bacillus ñã, ñang và ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng ñầu về mặt ứng 
dụng. Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền 
thống ñến công nghệ lên men hiện ñại, ñến sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm 
nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu. Chính vì lẽ ñó 
nên ñã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về chi Bacillus này cũng như mở rộng ứng dụng 
của chúng ñối với ñời sống con nguời. Từ thiên nhiên nhiệt ñới và á nhiệt ñới ña dạng của Việt 
Nam, chúng tôi ñã thu nhận các chủng Bacillus có hoạt tính phong phú từ các vùng sinh thái khác 
nhau nhằm từng bước xây dựng bộ sưu tập các chủng của chi vi khuẩn quan trọng này. Trong kết 
quả nghiên cứu, chúng tôi phân lập ñược 236 chủng Bacillus từ các mẫu ñất và nước thải khác 
nhau, trong ñó ñã khảo sát hoạt tính các enzym ngoại bào như proteaza, amylaza và CMC-aza của 
236 chủng. Trong số ñó, các chủng T20, TR6 và TH5 có tác dụng tốt trong xử lý nước thải. Các 
giá trị BOD5 của nước thải nhà máy sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội ñược xử lý lắc có và không có 
dịch nuôi chủng T20 lần lượt là 1250 và 730mg/L. Các giá trị BOD5 của nước thải ấy ñược xử lý 
lắc có và không có huyền dịch tế bào TR6 lần lượt là 800 và 610mg/L. Các giá trị BOD5 của nước 
thải sông Tô Lịch xử lý lắc có và không có dịch nuôi chủng TH5 pha loãng lần lượt là 165 và 
92mg/L. 
Từ khóa: Bacillus.spp, enzyme, wastewater treatment. 
1. ðặt vấn ñề∗ 
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có tiềm năng 
lớn về các enzym ngoại bào. Nhiều trong số các 
enzym ngoại bào này là những enzym thuỷ 
phân các phân tử hữu cơ lớn. Chính vì thế vi 
khuẩn này có nhiều ứng dụng trong các lĩnh 
vực khác nhau [1] như: công nghiệp sản xuất 
_______ 
∗
 Tác giả liên hệ. ðT: 84-4-38588856 
 E-mail: habtv@vnu.edu.vn 
chấy tẩy rửa [1,2], công nghiệp thực phẩm - 
bánh kẹo - ñồ uống [3,4], công nghiệp dược 
phẩm [5], công nghiệp thuộc da [1,6], công 
nghiệp dệt [5], và trong xử lý chất thải [1,7]. 
Riêng về ứng dụng vi khuẩn này trong xử lý 
nước thải thì chưa thấy tài liệu nào công bố. 
Tuy nhiên, như trên ñã nói, nhiều enzym ngoại 
bào của Bacillus là enzym thuỷ phân các phân 
tử hữu cơ lớn, và vì trong nước thải sinh hoạt và 
nước thải từ công nghiệp thực phẩm nói chung 
rất giàu chất hữu cơ nên việc ứng dụng vi 
N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101-106 
102 
khuẩn này ñể xử lý các loại nước thải ñó là có 
triển vọng. Bài báo này trình bày ba hoạt tính 
enzym thuỷ phân ngoại bào của một số chủng 
Bacillus và thăm dò khả năng ứng dụng ñể xử 
lý nước thải sông Tô Lịch và nước thải nhà máy 
sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội. Những chủng 
này nằm trong số 236 chủng mới phân lập từ 
các vùng ñịa lý khác nhau nhằm khai thác tính 
ña dạng về sinh lý và sự thích ứng bằng enzym 
của Bacillus [8]. 
2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 
2.1. Vi sinh vật 
Các chủng Bacillus dùng trong nghiên cứu 
ñược phân lập từ ñất ở nhiều vùng ñịa lý và từ 
nước thải sông Tô Lịch Hà Nội cũng như nước 
thải nhà máy sữa Vinamilk Gia Lâm Hà Nội. 
2.3. Phân lập Bacillus 
Các mẫu phân lập ñược pha loãng tới ñộ 
pha loãng cần thiết rồi ñược xử lý nhiệt ở 800C 
trong 15 phút, sau ñó ñược cấy gạt lên môi 
trường thạch dinh dưỡng. Nuôi ở nhiệt ñộ 28-
300C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc mọc lên ñược 
kiểm tra hiển vi và kiểm tra các ñặc ñiểm khác, 
nếu phù hợp với các ñặc ñiểm của Bacillus thì 
ñược cấy chuyển sang thạch nghiêng ñể bảo 
quản. 
2.3. Xác ñịnh hoạt tính proteaza, amylaza và 
xenlulaza (CMC-aza) 
Các hoạt tính này ñược xác ñịnh theo kỹ 
thuật khuếch tán trên thạch 
2.4. Xác ñịnh nhu cầu oxy sinh hoá 5 ngày 
(BOD5) (Theo tiêu chuẩn Việt Nam ISO 
5815:1989). 
3. Kết quả và thảo luận 
3.1. Phân lập Bacillus 
Từ các mẫu ñất ở các vùng ñịa lý thuộc 
nhiều tỉnh khác nhau, ñã phân lập ñược 236 
chủng Bacillus. Một số chủng ñã ñược kiểm tra 
về các hoạt tính enzym thuỷ phân ngoại bào, 
như ñược trình bày dưới ñây. 
Hình 1. Vùng phân huỷ gelatin của hai chủng T20 
và M27. 
3.2 Hoạt tính proteaza 
- Các chủng T20 và M27 thể hiện hoạt tính 
phân huỷ gelatin và phân huỷ sữa gầy, như nêu 
trong hình 1 trong ñó chủng T20 mạnh hơn 
chủng M27. 
- Các chủng TR1, TR5, TR6, TR12, TR13 
và TR14 thể hiện một hoạt tính proteaza ñược 
cảm ứng bởi 1% sữa gầy, như nêu trong hình 2. 
Hình 2. Tác dụng cảm ứng của sữa gầy ñối với hoạt 
tính proteaz a của 6 chủng TR. 
 T20 
 M27 
N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101-106 
103 
Hình 3. Khả năng phân huỷ sữa gầy của 20 chủng 
(TH1-TH20) trên môi trường MP. 
- Các chủng từ TH1ñến TH20 thể hiện khả 
năng phân huỷ sữa gầy như trên hình 3, trong 
ñó các chủng TH5 và TH8 là mạnh nhất. 
3.3. Hoạt tính amylaza 
- Các chủng T20 và M27, trong thử nghiệm 
cấy ñiểm, ñều thể hiện hoạt tính amylaza, với 
ñường kính vòng phân huỷ bằng 19,5 và 20mm 
theo thứ tự. 
- Các chủng TR4, TR6, TR8, TR10, TR12, 
và TR14, trong thử nghiệm ñục lỗ, mặc dù 
không thể hiện hoạt tính amylaza ngoại bào trên 
môi trường HA dịch thể nhưng ñã thể hiện hoạt 
tính này trên môi trường HA dịch thể +1% tinh 
bột (hình 4). 
Hình 4. Tác dụng cảm ứng của tinh bột ñối với 
amylaza của 7 chủng nghiên cứu. 
- Các chủng từ TH1 ñến TH20, trong thử 
nghiệm ñục lỗ, ñều không thể hiện hoạt tính 
phân huỷ tinh bột trên môi trường HA và môi 
trường HA + 1% tinh bột. Tuy nhiên, nếu 
glucoza trong môi trường HA ñược thay thế 
bằng tinh bột với cùng lượng thì 17/20 chủng 
thể hiện vòng phân huỷ tinh bột (hình 5). 
Hình 5. Hoạt tính phân huỷ tinh bột của các chủng từ 
TH1 ñến TH20. Bên trái là các lỗ ñược tra dịch nuôi 
các chủng trên môi trường HA+1% tinh bột; tất cả 
các chủng ñều không thể hiện hoạt tính phân huỷ 
tinh bột, ở ñây chỉ trình bày một số chủng trong ñó. 
Bên phải là các lỗ ñược tra dịch nuôi các chủng trên 
môi trường HA trong ñó glucoza ñược thay bằng 
tinh bột, kết quả là một số chủng thể hiện hoạt tính 
phân huỷ tinh bột. 
3.4. Hoạt tính CMC-aza 
- Hai chủng T20 và M27 ñều thể hiện hoạt 
tính CMC-aza ở mức 20mm, theo thử nghiệm 
cấy ñiểm trên môi trường MT4. 
- Các chủng từ TR1 ñến TR14, trừ chủng số 
10, tất cả ñều thể hiện hoạt tính CMC-aza trên 
môi trường HA kiềm (hình 6a), và hoạt tính này 
tăng lên ñáng kể nếu môi trường nuôi ñược bổ 
sung CMC (hình 6b). 
Hình 6a. Các chủng từ TR1 ñến TR14 nuôi trên môi 
trường HA kiềm, trừ chủng số 10, ñều thể hiện vòng 
hoạt tính CMC-aza, theo thử nghiệm ñục lỗ. 
N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101-106 
104 
Hình 6b. Các chủng TR mang số hiệu 1, 3, 5, 7, 9, 
11, 13 thể hiện một hoạt tính CMC-aza ñược cảm 
ứng bằng CMC ở mức ñộ khác nhau. 
Các chủng từ TH1 ñến TH20 ñều không 
biểu hiện hoạt tính CMC-aza trên môi trường 
HA, nhưng 14 chủng trong số ñó biểu hiện hoạt 
tính này trên môi trường HA+1% CMC (hình 7). 
Hình 7. Khả năng phân huỷ CMC của các chủng từ 
TH1 ñến TH20, theo thử nghiệm ñục lỗ. 14 chủng 
có ñường kính vùng phân huỷ > 10mm là những 
chủng có hoạt tính. 
Nhìn chung, cả ba hoạt tính enzym nói trên 
(proteaza, amylaza và CMC-aza) ở các chủng 
nghiên cứu là rất ña dạng, cả về mức ñộ hoạt 
tính và về mức ñược cảm ứng. ðiều ñó tạo 
nhiều khả năng lựa chọn những chủng thích 
hợp cho mục ñích xử lý môi trường ô nhiễm 
hữu cơ. 
3.5. Thăm dò khả năng xử lý nước thải 
3.5.1. Xử lý nước thải nhà máy sữa 
Vinamilk Gia Lâm Hà Nội 
Dịch nuôi 4 ngày tuổi của chủng T20 trên 
môi trường HA ñược loại bỏ tế bào và dùng làm 
chế phẩm (chế phẩm T20), ñược bổ sung vào 
nước thải theo tỷ lệ 1/2 (v/v) và xử lý hiếu khí 
lắc. Hình 8 cho thấy chế phẩm T20 làm giảm 
ñáng kể BOD5của nước thải ñược xử lý, xuống 
còn 730, so với 1250mg/L của công thức xử lý 
lắc không có chế phẩm. 
Hình 9. Tác dụng của chế phẩm TR6 trong xử lý 
nước thải. ðối chứng 1: Mẫu nước thải không xử lý. 
ðối chứng 2: Mẫu nước thải xử lý lắc không bổ sung 
chế phẩm. 
Ký hiệu chủng 
Hình 8. Tác dụng của chế phẩm T20 trong xử lý 
nước thải. ðối chứng 1: Mẫu nước thải không xử lý. 
ðối chứng 2: Mẫu nước thải xử lý lắc không bổ 
sung chế phẩm. 
Trong một thí nghiệm khác, 10ml huyền 
dịch tế bào TR6 có OD600 = 0,6 ñược bổ sung 
vào 50ml nước thải trước khi xử lý lắc. Hình 9 
cho thấy chế phẩm này làm giảm rõ rệt BOD5 
của nước thải, xuống còn 610 so với 800mg/L 
của mẫu xử lý lắc không bổ sung chế phẩm. 
N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101-106 
105 
Hình 10. Hiệu quả xử lý nước thải bằng chế phẩm 
TH5. Hai công thức xử lý với chế phẩm là XL2 và 
XL3 xem chi tiết trong bài. 
3.5.2. Xử lý nước thải sông Tô Lịch 
Huyền dịch tế bào chủng TH5 có OD600 = 
1,7 ñược dùng ở hai nồng ñộ, như trong các 
công thức thí nghiệm sau ñây: 
+ ðC 1 (ñối chứng 1): nước thải trước xử lý. 
+ ðC 2 (ñối chứng 2): nước thải ñể yên 
không lắc, 300C, 5 ngày. 
+ XL 1: xử lý lắc 200 vòng/phút, 300C, 5 
ngày. 
+ XL 2: xử lý lắc có chế phẩm (10ml/50ml 
nước thải), 200 vòng/phút, 300C, 5 ngày. 
+ XL 3: xử lý lắc có chế phẩm (10m chế 
phẩm pha loãng gấp ñôi/50ml nước thải), 200 
vòng/phút, 300C, 5 ngày. 
Hình 10 cho thấy chế phẩm TH5 ở hai nồng 
ñộ khác nhau (công thức XL2 và XL3) làm 
giảm mạnh BOD5 xuống còn 116,67 và 
92,2mg/L theo thứ tự, so với 165,55mg/L ở 
công thức xử lý không có chế phẩm. ðiều ñáng 
chú ý là ở nồng ñộ thấp của chế phẩm (công 
thức XL3) hiệu quả xử lý lại cao hơn ở nồng ñộ 
cao của chế phẩm (công thức XL2). ðiều này 
có thể liên quan ñến một hiệu ứng phụ: việc ñưa 
chế phẩm ở nồng ñộ cao vào nước thải có thể 
cũng ñưa thêm chất hữu cơ vào ñó, do ñó bù lại 
một phần BOD ñược giảm do tác dụng của chế 
phẩm. Vì vậy trong thực tiễn xử lý, sử dụng chế 
phẩm bào tử có thể là một giải pháp khác nhằm 
tránh hiệu ứng phụ có thể có vừa nêu. 
4. Kết luận 
 ðã phân lập ñược 236 chủng Bacillus từ 
các mẫu ñất và nước thải khác nhau, trong ñó 
ñã khảo sát hoạt tính các enzym ngoại bào như 
proteaza, amylaza và CMC-aza của 236 chủng. 
Trong số ñó, các chủng T20, TR6 và TH5 có 
tác dụng tốt trong xử lý nước thải. Các giá trị 
BOD5 của nước thải nhà máy sữa Vinamilk Gia 
Lâm Hà Nội ñược xử lý lắc có và không có dịch 
nuôi chủng T20 lần lượt là 1250 và 730mg/L. 
Các giá trị BOD5 của nước thải ấy ñược xử lý 
lắc có và không có huyền dịch tế bào TR6 lần 
lượt là 800 và 610mg/L. Các giá trị BOD5 của 
nước thải sông Tô Lịch xử lý lắc có và không 
có dịch nuôi chủng TH5 pha loãng lần lượt là 
165 và 92mg/L. 
Lời cảm ơn 
Công trình có sự hỗ trợ của chương trình 
NCCB trong KHTN (Bộ KH&CN). Các tác giả 
xin chân thành cảm ơn PGS.TS Kiều Hữu Ảnh 
ñã ñọc và góp cho bản thảo. 
Tài liệu tham khảo 
[1] R. Gupta, Q.K. Beg, P.Lorenz, Bacterial alkaline 
proteases: molecular approaches and industrial 
applications, Appl Microbiol Biotechnol 59 
(2002) 15. 
[2] H. Outtrup, T.S. Jorgensen ST, The importance 
of Bacillus species in the production of industrial 
enzymes. In: Berkeley R, Heyndrickx M, Logan 
N, De Vos P (eds), Applications and 
systematics of Bacillus and relatives, Blackwell 
publishing, UK, 2002, pp 206-218. 
[3] P.G. Dalev, Utilization of waste feathers from 
poultry slaughter for production of a protein 
concentrate, Bioresour Technol 48 (1994) 265. 
N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101-106 
106 
[4] B.D. Rebeca, Pena-Vera MT, Diaz – Castaneda 
M, Production of fish protein hydrolysates with 
bacterial proteases; yield and nutritional value, 
J Food Sci 56 (1991) 309. 
[5] M. Schallmey, A. Singh, P.O.Ward, Developments 
in the use of Bacillus species for industrial 
production, Can J Microbiol 50 (2004) 1. 
[6] A. Hammed, T. Keshavarz, C.S. Evan, Effect of 
dissolved oxygen tension and pH on the 
production of extracellular protease from a new 
isolate of Bacillus subtilis K2, for use in leather 
processing, J Chem Technol Biotechnol 74 (1999) 5. 
[7] M. Kubo, J. Okajima, F. Hasumi, Isolation and 
characterization of soybean waste – degrading 
microorganisms and analysis of fertilizer effects 
of the degraded products, Applied and 
Environmental Microbiology 60 (1994) 243. 
[8] F.G. Priest, Extracellular Enzyme synthesis in 
the Genus Bacillus, Bacteriological Reviews 
41 (1977) 711. 
Study on extracellular enzymes of some newly isolated 
Bacillus strains and their ability to use them for wastewater 
treatment 
Ngo Tu Thanh, Bui Thi Viet Ha, Vu Minh ðuc, Chu Van Man 
Faculty of Biology, College of Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam 
236 Bacillus strains were isolated from soil and wastewater samples. The activities of extracellular 
enzymes of 36 isolates were investigated. Most of them secreted extracellular protease, amylase, and 
carboxymetylcellulase. Under the laboratory conditions, the wastewater treament with preparations 
made from strains T20, TR6 and TH5 decreased significantly BOD5 values of wastewaters. Examples: 
BOD5 values of wastewater from Vinamilk Gia Lam Ha Noi treated by shaking without and with 
cultural fluid of the strain T20 were 1250 and 730 mg/L, respectively; BOD5 values of wastewater 
from To Lich river treated by shaking without and with diluted cell suspension of the strain TH5 were 
165 and 92 mg/L, respectively. 
Keywords: Bacillus.spp, enzyme, wastewater treatment.