Nghiên cứu định lượng amantadin hydrochlorid bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 74
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG AMANTADIN HYDROCHLORID 
BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN 
 Nguyễn Văn Thịnh*; Vũ Thị Thanh Hằng*; Nguyễn Phương Dung** 
 Vũ Bình Dương*; Phan Đình Châu** 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến 
(UV-VIS) để định lượng amantadin hydrochlorid (AM) trong môi trường thử độ hòa tan. Đối tượng 
và phương pháp: khảo sát, lựa chọn các điều kiện của phản ứng tạo phức bromophenol blue (BB) 
với amantadin. Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng với các chỉ tiêu: độ đặc hiệu, 
độ chính xác, độ đúng, đường chuẩn và khoảng tuyến tính theo hướng dẫn của ICH. Kết quả: 
đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp cho quy trình định lượng như: pH dung dịch đệm, 
nồng độ dung dịch BB, thời gian phản ứng và số lần chiết dẫn xuất tạo thành. Phương pháp 
định lượng đã được thẩm định với khoảng tuyến tính ở nồng độ 20 - 250 µg/ml. Độ chính xác 
trong ngày và khác ngày lần lượt nhỏ hơn 5,12% và 5,31%. Độ đúng của phương pháp trong 
khoảng 95,96 - 102,96%. Kết luận: đã xây dựng phương pháp phù hợp để định lượng AM trong 
phép thử độ hòa tan. 
* Từ khóa: Amantadin hydrochlorid; Bromophenol blue; UV-VIS; Phương pháp thử độ hoà tan. 
Study on Spectrophotometric Method for Determination of Amantadine 
Hydrochloride 
Summary 
Objectives: To develop and validate an UV-VIS method for determination of amantadine 
hydrochloride (AM) in drug dissolution testing. Materials and methods: Factors of complex reaction 
of amantadine with bromophenol blue (BB) were investigated and adapted. Validation of the 
method was conducted with criteria of specificity, precision, accuracy, linearity and calibration curve, 
according to ICH guidelines. Results: The appropriate procedure for the quantitation was adopted 
with regard to such factors as pH of buffer, concentration of BB, reaction time, and number of 
extraction. The quantitative method was validated with a linear range from 20 to 250 µg/mL. 
Intra- and inter-day precision were less than 5.12% and 5.31%, respectively. The accuracy was 
from 95.96% to 102.96%. Conclusion: The developed method is suitable for determination of 
AM in dissolution testing. 
* Key words: Amantadine hydrochloride; Bromophenol blue; UV-VIS; Drug dissolution testing. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Năm 1966, Cục Quản lý Thực phẩm và 
Dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận amantadin 
là một thuốc dự phòng cúm và điều trị virut 
cúm A ở người lớn. Năm 1969, thuốc được 
sử dụng trong điều trị giảm các triệu chứng 
của bệnh Parkinson, hội chứng ngoại tháp 
do thuốc và chứng ngồi nằm không yên 
(akathisia). 
* Học viện Quân y 
** Đại học Bách khoa Hà Nội 
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thịnh ([email protected]) 
Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/08/2016 
 Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 75 
Hiện nay, trên thị trường có một số chế 
phẩm chứa AM như amazolon (Sawai); 
mantadan (Boehringer, Ing.); mantadin 
(DuPont Pharma); mantadix (DuPont 
Pharma); symmetrel (DuPont Pharma). 
Việc định lượng các thuốc này gặp nhiều 
khó khăn vì amantadin không hấp thụ tia 
UV, cũng như không có khả năng phát 
bức xạ huỳnh quang. Trên thế giới, đã có 
một số nghiên cứu về phương pháp định 
lượng AM bằng đo quang phổ hấp thụ, 
quang phổ huỳnh quang [1], phương 
pháp HPLC [2], TLC [3], GC-MS [4]... 
Phương pháp định lượng dựa trên các 
phản ứng tạo dẫn xuất có khả năng bức xạ 
UV hoặc bức xạ huỳnh quang. Các chất 
phản ứng tạo dẫn xuất được sử dụng gồm 
iod [1], 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol 
[2], 2,3-diphenylquinolizinium bromid [5]. 
Nghiên cứu này, chúng tôi trình bày 
kết quả: Nghiên cứu xây dựng và thẩm 
định phương pháp định lượng AM bằng 
phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 
có sử dụng chất tạo dẫn xuất có khả năng 
hấp thụ ánh sáng tại 408 nm. Phương pháp 
xây dựng được có độ đúng và chính xác 
cao, đơn giản, phù hợp cho các phép thử 
độ hòa tan trong bào chế viên nén và 
nghiên cứu định lượng khác. 
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị. 
* Nguyên liệu, hóa chất: 
AM chuẩn (Wako Pure Chemical Industries, 
Ltd., Nhật Bản, số lô: AWF0974), thuốc 
thử BB (Merck, Đức). 
Các hóa chất t inh khiết khác: 
dichloromethan, natri acetat, axít phosphoric, 
kali dihydrophosphat, natri dihydrophosphat 
axít boric, axít chlohydric, natri hydroxyd. 
* Thiết bị nghiên cứu: 
- Máy đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 
(Biochrom Ltd, Anh). 
- Máy đo pH (Mettler - Toledo group, 
Thụy Sỹ). 
2. Phương pháp nghiên cứu. 
* Xây dựng quy trình định lượng dựa 
vào phản ứng giữa AM và BB: 
 Vì độ hấp thụ của dẫn xuất tạo thành 
của phản ứng giữa AM và BB quyết định 
đến độ đúng, độ chính xác của phương 
pháp nên cần khảo sát các yếu tố ảnh 
hưởng đến hiệu suất phản ứng gồm: pH 
môi trường phản ứng, nồng độ thuốc thử, 
thời gian thực hiện phản ứng, cũng như 
phương pháp chiết xuất dẫn chất thu 
được sau phản ứng. Để tiến hành khảo 
sát, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch sau: 
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: pha các 
dung dịch chuẩn có nồng độ 250 µg/ml, 
200 µg/ml, 150 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 
20 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc. 
- Pha dung dịch đệm: pha các dung dịch 
đệm có nồng độ 0,1 M gồm: đệm phosphat 
H3PO4/KH2PO4 có pH 2,5; đệm acetat 
CH3COOH/CH3COONa có pH 3,5, 4,5; 5,5; 
đệm KH2PO4/Na2HPO4 có pH 7,5, đệm borat 
NaOH/H3BO3 có pH 9,5; 10,5. 
- Pha dung dịch thuốc thử BB: cân 
0,15 g BB vào bình định mức 100 ml, 
thêm 10 ml dung dịch NaOH 0,05 M. Lắc 
trong 5 phút tới tan hoàn toàn. Thêm nước 
cất tới vạch định mức, thu được dung dịch 
BB có nồng độ 0,15%. 
- Khảo sát quy trình định lượng trong: 
lấy chính xác 1 ml mẫu thử đã pha loãng 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 76
về khoảng nồng độ định lượng vào bình 
gạn, thêm 5 ml dung dịch BB 0,15% và 
4 ml đệm acetat pH 3,5. Lắc trong 3 phút. 
Thêm 10 ml CH2Cl2, lắc, gạn lấy phần 
dung dịch CH2Cl2, đem đo lại bước sóng 
tại 408 nm. Khảo sát lựa chọn các điều 
kiện thích hợp về pH dung dịch đệm, 
nồng độ dung dịch BB, thời gian lắc phản 
ứng, số lần chiết với CH2Cl2. 
* Thẩm định quy trình định lượng AM: 
Thẩm định phương pháp định lượng 
đã xây dựng được theo hướng dẫn của 
ICH Q2(R1) theo các chỉ tiêu: độ đặc hiệu, 
độ đúng, độ chính xác, đường chuẩn và 
khoảng tuyến tính [6]. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 
BÀN LUẬN 
1. Kết quả xây dựng quy trình định 
lượng. 
* Khảo sát pH của dung dịch đệm trong 
phản ứng giữa AM và BB tới độ hấp thụ: 
Pha các dung dịch đệm có pH trong 
khoảng 2,5 - 10,5. Thực hiện phản ứng 
tạo dẫn xuất với dung dịch AM 250 µg/ml 
và dung dịch BB 0,15% theo quy trình 
trên. Đo độ hấp thụ của mẫu thu được. 
Bảng 1: Ảnh hưởng của pH dung dịch 
đệm tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3). 
Số thứ tự pH Độ hấp thụ 
1 2,5 0,810 ± 0,025 
2 3,5 1,279 ± 0,035 
3 4,5 0,774 ± 0,021 
4 5,5 0,087 ± 0,023 
5 7,5 0,037 ± 0,013 
6 9,5 0,005 ± 0,002 
7 10,5 0,005 ± 0,002 
pH của phản ứng tạo phức ảnh hưởng 
rất lớn tới độ hấp thụ của sản phẩm sau 
phản ứng. Khoảng pH từ 2,5 - 4,5 cho kết 
quả độ hấp thụ cao. Với pH > 4,5 độ hấp 
thụ giảm mạnh. Ở pH 3,5, độ hấp thụ cao 
nhất. 
* Khảo sát nồng độ BB: 
Pha các mẫu thuốc thử BB có nồng độ 
khác nhau từ 0,05 - 0,2%. Thực hiện phản 
ứng với dung dịch AM nồng độ 250 µg/ml 
và xử lý mẫu theo quy trình trên. 
Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ dung 
dịch BB tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3). 
Số thứ tự Nồng độ BB (%) Độ hấp thụ 
1 0,050 0,332 ± 0,015 
2 0,075 0,639 ± 0,032 
3 0,100 0,945 ± 0,028 
4 0,125 1,257 ± 0,039 
5 0,150 1,299 ± 0,036 
6 0,175 1,310 ± 0,045 
7 0,200 1,297 ± 0,031 
Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng 
nồng độ BB, độ hấp thụ tăng. Từ nồng độ 
0,125%, độ hấp thụ tăng không đáng kể, 
lượng BB đã đủ dư cho phản ứng tạo dẫn 
xuất. Dựa vào kết quả của bảng 2, chúng 
tôi lựa chọn nồng độ 0,15% để thực hiện 
phản ứng tạo dẫn xuất. 
* Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 
đến độ hấp thụ: 
Thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất của 
dung dịch AM 250 và BB 0,15% theo quy 
trình xử lý trên. Lắc kỹ trong các khoảng 
thời gian khác nhau. Sau đó chiết với 
CH2Cl2 và đo quang tại bước sóng 408 nm. 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 77 
Bảng 3: Ảnh hưởng của của thời gian 
phản ứng đến độ hấp thụ. 
Số thứ tự Thời gian Độ hấp thụ 
1 2 phút 1,285 ± 0,025 
2 3 phút 1,293 ± 0,048 
3 5 phút 1,304 ± 0,022 
4 10 phút 1,296 ± 0,011 
Phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra nhanh, 
giá trị độ hấp thụ đo được không khác 
biệt nhiều giữa các khoảng thời gian phản 
ứng. Dựa vào kết quả đo được, chúng tôi 
lựa chọn khoảng thời gian thực hiện phản 
ứng là 3 phút. 
* Khảo sát hiệu suất chiết trong quy 
trình định lượng: 
Thực hiện đo quang phổ các mẫu được 
xử lý theo quy trình đã lựa chọn. Chiết 4 
lần các mẫu đo bằng 10 ml CH2Cl2. 
Bảng 4: Hiệu suất chiết dẫn xuất tạo 
thành trong phản ứng (n = 3). 
Số thứ tự Độ hấp thụ Hiệu suất chiết (%) 
Lần chiết 1 1,326 ± 0,050 85,23 ± 4,09 
Lần chiết 2 0,182 ± 0,064 11,73 ± 3,88 
Lần chiết 3 0,041 ± 0,021 2,65 ± 1,27 
Lần chiết 4 0,006 ± 0,002 0,39 ± 0,13 
Kết quả cho thấy trong lần chiết 1, 
phần lớn dẫn xuất tạo thành đã được 
chiết khỏi dung dịch phản ứng (85,23%). 
Từ kết quả của các khảo sát trên, chúng 
tôi lựa chọn quy trình định lượng như 
sau: lấy 1 ml mẫu thử bằng pipet chính 
xác vào bình gạn, thêm 5 ml dung dịch 
BB 0,15% và 4 ml đệm acetat pH 3,5, 
lắc trong 3 phút. Thêm chính xác 10 ml 
CH2Cl2 vào bình gạn, lắc kỹ trong 3 phút. 
Tách lấy phần dung dịch CH2Cl2 và đo độ 
hấp thụ tại bước sóng 408 nm. Từ quy 
trình đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành 
thẩm định phương pháp để định lượng AM. 
2. Thẩm định phương pháp định lượng. 
* Độ đặc hiệu, chọn lọc: 
Tiến hành pha dung dịch chuẩn AM. 
Cho dung dịch này phản ứng và chiết xuất 
theo quy trình trên. 
Hình 1: Phổ hấp thụ của mẫu trắng (a) và 
mẫu thử (b). 
Kết quả cho thấy phổ hấp thụ của mẫu 
thử sau quá trình xử lý mẫu có cực đại tại 
408 nm. So với các mẫu trắng, không có 
đỉnh cực đại tại bước sóng này. Do đó, có 
thể dựa vào bước sóng này để định 
lượng AM trong các mẫu thử. 
a 
b 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 
 78
* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: 
Pha dung dịch AM chuẩn có nồng độ trong khoảng 20 - 250 µg/ml. Tiến hành xử lý 
mẫu như điều kiện đã chọn. 
Bảng 5: Đường chuẩn và khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng. 
Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ Độ đúng (%) 
250 1,296 98,23 
200 1,053 98,65 
150 0,820 100,66 
100 0,570 101,30 
50 0,317 102,05 
20 0,160 99,11 
Kết quả khảo sát cho thấy: độ hấp thụ (A) và nồng độ (C, µg/ml) của mẫu đo có sự 
tương quan tuyến tính với hệ số tương quan R là 0,999. Phương trình đường chuẩn 
được xây dựng: A = 0,005043C + 0,06026. 
Độ đúng của các điểm nồng độ trong đường chuẩn được xác định từ 98,23 - 
102,05%. Như vậy, phương pháp định lượng có độ tuyến tính cao giữa độ hấp thụ và 
nồng độ từ 20 - 250 µg/ml với độ đúng 98,23 - 102,05%. 
* Độ chính xác: 
Xác định bằng cách đo dung dịch chuẩn AM tại 3 nồng độ 50, 100, 150 µg/ml. Mỗi điểm 
nồng độ làm lặp lại 6 lần. Xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn. Thực hiện phân tích 
các mẫu trong ngày và khác ngày để xác định độ chính xác trong ngày (độ lặp lại) và độ 
chính xác khác ngày (độ chính xác trung gian). 
Bảng 6: Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày. 
Mẫu 
Trong ngày Khác ngày 
Nồng độ 
( X ± SD) 
RSD (%) Độ đúng ( X %) 
Nồng độ 
( X ± SD) 
RSD (%) Độ đúng ( X %) 
LQC (µg/ml) 50,38 ± 2,58 5,12 100,99 49,90 ± 2,65 5,31 100,01 
MQC (µg/ml) 102,73 ± 3,46 3,37 102,96 101,92 ± 3,64 3,57 102,14 
HQC (µg/ml) 143,62 ± 4,35 3,03 95,96 144,39 ± 4,98 3,45 96,47 
Tại cả 3 nồng độ (50; 100 và 150 µg/ml), phương pháp đều cho độ đúng tốt (96,96 - 
103,96%) và độ lặp lại khác ngày với giá trị RSD < 10% (3,45 - 5,31%), chứng tỏ 
phương pháp định lượng có độ đúng, độ chính xác, đảm bảo yêu cầu cho phân tích 
định lượng trong mẫu thử độ hòa tan và những nghiên cứu định lượng khác. 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 
 79 
KẾT LUẬN 
Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình 
định lượng AM dựa trên phản ứng tạo 
dẫn xuất giữa amantadin và BB. Các điều 
kiện đã được khảo sát cho quy trình định 
lượng là: lấy 1 ml mẫu thử bằng pipet 
chính xác vào bình gạn, thêm 5 ml dung 
dịch BB 0,15% và 4 ml đệm acetat pH 
3,5. Lắc trong 3 phút. Thêm chính xác 
10 ml CH2Cl2 vào bình gạn, lắc kỹ trong 
3 phút. Tách lấy phần dung dịch CH2Cl2, 
đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 408 nm. 
Phương pháp định lượng đã được 
thẩm định có độ đặc hiệu, độ đúng và độ 
chính xác cao. Độ hấp thụ (A) và nồng độ 
(C) của mẫu đo có tương quan tuyến tính 
trong khoảng nồng độ 20 - 250 µg/ml với 
hệ số tương quan R là 0,999, phương 
trình đường chuẩn được xây dựng: 
A = 0,005043C + 0,06026. Kết quả cho 
thấy phương pháp xây dựng và thẩm định 
này phù hợp cho định lượng AM trong 
các mẫu thử độ hòa tan và nghiên cứu 
định lượng khác. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. IA Darwish et al. Simple and sensitive 
spectrophotometric methods for determination 
of amantadine hydrochloride. Journal of Applied 
Spectroscopy. 2006, 73 (6), pp.792-797. 
2. Y Higash et al. Simultaneous liquid 
chromatographic assay of amantadine and its 
four related compounds in phosphate-buffered 
saline using 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole 
as a fluorescent derivatization reagent. Biomedical 
Chromatography. 2006, 20 (5), pp.423-428. 
3. HF Askal et al. Quantitative thin-layer 
chromatographic method for determination of 
amantadine hydrochloride. International Journal 
of Biomedical Science. 2008, 4 (2), pp.155-160. 
4. HJ Leis, G Fauler, W Windischhofer. 
Quantitative analysis of memantine in human 
plasma by gas chromatography/negative ion 
chemical ionization/mass spectrometry. Journal 
of Mass Spectrometry, 2002, 37 (5), pp.477-480. 
5. MA Martin, B Del Castillo. 2,3-diphenylquinolizinium 
bromide as a fluorescent derivatization reagent 
for amines. Analytica Chimica Acta. 1991, 245 (2), 
pp.217-223. 
6. ICH Q2(R1). International Conference on 
Harmonisation. Validation of analytical procedures. 
Methodology. 2005.