Nghiên cứu chỉnh sửa gen bằng hệ thống CRISPR/Cas9 trong dòng tế bào ung thư

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
1TCNCYH 126 (2) - 2020
Tác giả liên hệ: Vũ Thị Hà,
Trường Đại học Y Hà Nội
Email: [email protected]. 
Ngày nhận: 13/12/2019
Ngày được chấp nhận: 03/03/2020
NGHIÊN CỨU CHỈNH SỬA GEN BẰNG HỆ THỐNG CRISPR/
CAS9 TRONG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ
Vũ Thị Hà1,2, , Bùi Tường An1, Đoàn Thị Kim Phượng1,2 
1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Đại học Y Hà Nội 
Hệ thống CRISPR/Cas9 là một trong những công cụ đem lại hiệu quả chỉnh sửa gen cao và có triển vọng 
trong ứng dụng lâm sàng. Với mục tiêu chỉnh sửa gen RAPTOR và Atg5 trên dòng tế bào bạch cầu mạn 
tính dòng tủy K562 và tế bào ung thư não TGS04 bằng hệ thống CRISPR/Cas9, chúng tôi thiết kế hệ thống 
CRISPR/Cas9 bằng cách chèn đoạn trình tự đích vào plasmid PX330. Plasmid này được đưa vào tế bào đích 
bằng xung điện. Để đánh giá hiệu quả của quá trình chỉnh sửa gen chúng tôi sử dụng các kỹ thuật PCR, giải 
trình tự gen và Western blotting. Kết quả cho thấy CRISPR/Cas9 được thiết kế đã gây xóa exon3 trên gen 
RAPTOR; gây đột biến mất đoạn gen Atg5 dẫn đến tăng rõ rệt mức độ biểu hiện của protein LC3I và giảm 
đáng kể mức độ biểu hiện của protein LC3II. Nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra rằng hệ thống CRISPR/Cas9 
chỉnh sửa được các gen đích dẫn đến sự biến đổi protein và các sản phẩm trong con đường hoạt hóa gen.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
CRISPR/Cas9 được viết tắt từ những 
chữ cái đầu của cụm Clustered Regularly 
Interspaced Short Palindromic Repeats và 
CRISPR-associated (Cas) protein, là một hệ 
miễn dịch ở sinh vật nhân sơ giúp chúng có khả 
năng ghi nhớ và tạo miễn dịch với các yếu tố di 
truyền ngoại lai. Trình tự CRISPR lần đầu tiên 
được nhà khoa học Nhật Bản Yoshizumi Ishino 
và cộng sự tìm ra vào năm 1987 trên E. coli và 
nhiều vi khuẩn khác sau đó. Đến năm 2013 cơ 
chế hoạt động của CRISPR/enzym Cas được 
làm sáng tỏ và sử dụng trong các tế bào động 
vật có vú, đặt cơ sở cho việc áp dụng CRISPR / 
Cas9 như một công cụ chỉnh sửa bộ gen. Hoạt 
động của hệ CRISPR/Cas9 có sự tham gia của 
hai thành phần chính là Cas9 protein và đoạn 
dẫn RNA không mã hóa (được gọi là sgRNA). 
Phân tử sgRNA bắt cặp với trình tự của vùng 
đệm spacer trên DNA đích mới xâm nhập và 
giúp protein Cas (CRISPR-associated) nhận 
ra và thực hiện cắt đứt, sửa chữa sợi DNA tại 
vùng bắt cặp. Kết quả là DNA có thể được sửa 
đổi nhanh hơn và dễ dàng hơn nhiều so với khả 
năng sử dụng các phương pháp chỉnh sửa gen 
trước đó.1,2 Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã 
sử dụng hệ thống này để sửa chữa DNA của bộ 
gen trên một số dòng tế bào ung thư hoặc trên 
tế bào gốc.³ Heckl D. và cộng sự, năm 2014, đã 
dùng hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến gây 
ung thư tủy bào ở chuột.⁴ Ở một nghiên cứu 
khác, Xue W. và cộng sự đã gây đột biến gen 
ung thư ở gan chuột với mục đích phá vỡ chức 
năng của gen ung thư.⁵ Tuy nhiên ở Việt Nam, 
những nghiên cứu về hệ thống CRISPR/Cas9 
còn khá mới mẻ và chưa được sử dụng rộng 
rãi. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này 
với mục tiêu ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 
chỉnh sửa gen RAPTOR trên dòng tế bào ung 
thư máu và gen Atg5 trên dòng tế bào ung thư 
não, đồng thời đánh giá hiệu quả của quá trình 
chỉnh sửa đó .
Từ khóa: CRISPR/Cas9, liệu pháp gen, tế bào ung thư.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2 TCNCYH 126 (2) - 2020
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại: Bộ môn Y 
Sinh học – Di truyền, Trường ĐH Y Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu: 10/2018 - 10/2019
2. Thiết kế và sử dụng hệ thống CRISPR/
Cas9
Đoạn trình tự đích sgRNA thích hợp lựa 
chọn từ thư viện sgRNA6 gồm 20 pb được biến 
tính và chèn vào plasmid PX330 sau khi được 
cắt bởi enzym BbsI. Plasmid mang đoạn trình 
tự đích được đưa vào tế bào bằng xung điện 
(Amaxa Mouse neural stem Nucleofector Kit, 
Lonza, Basel, Switzerland). Sử dụng đồng thời 
hai sgRNA đích trên vùng intron giữa exon2 
với exon3 (GCCGAAATACAAATGAACGT) 
và vùng intron giữa exon3 với exon4 
(GAAATTTACCACGGACTCCA) để gây xóa 
đoạn exon3 của gen RAPTOR trên dòng tế 
bào ung thư máu, hoặc một sgRNA trên gen 
Atg5 (GGCCATCAATCGGAAACTCA) để gây 
đột biến gen Atg5 trên dòng tế bào ung thư 
não. 
3. Tạo đột biến trên các tế bào và nuôi cấy 
dòng tế bào
Sử dụng tế bào Leukemia mạn tính dòng tủy 
K562 và tế bào ung thư não TGS04 được cung 
cấp bởi giáo sư Atsushi Hirao, Trung tâm ung 
thư, trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản7. 
Tế bào ung thư máu và tế bào ung thư não 
được nuôi cấy trong môi trường RPMI (Sigma-
Aldrich) và DMEM/F12 (Wako) tương ứng .
 4. Các kỹ thuật kiểm tra hiệu quả gây đột 
biến của hệ thống CRISPR/Cas9
Tế bào sau khi gây đột biến được thu hoạch 
và khuếch đại vùng đột biến bằng kỹ thuật 
PCR với ba mồi đồng thời. Sử dụng phần mềm 
primer3 để thiết kế các mồi trên vùng intron 
trước và sau exon3 của gen RAPTOR (Mồi xuôi: 
CTGGAACCCACTCCTGAAAT, mồi ngược 
thứ nhất: CGATGGTTTCCAGAGCTTTC 
và mồi ngược thứ hai: 
CACACCCACCTTGTTGAAGA). Sử dụng cặp 
mồi xuôi: GGCCATCAATCGGAAACTCA, và 
mồi ngược: TGAGTTTCCGATTGATGGCC cho 
kỹ thuật giải trình tự gen cho gen Atg5. Các sản 
phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên 
gel Agarose 2%. Protein của gen tương ứng 
được kiểm tra bằng kỹ thuật Western blotting 
với các kháng thể tương ứng ATG5 (Novusbio, 
Littleton, CO, USA, NB110 - 53818; 1:500), LC3 
(NanoTools, Teningen, Germany; clone 5F10, 
0231; 1:200), β - actin (Sigma - Aldrich A5441; 
1:2000). Trình tự DNA hay trình tự mRNA được 
kiểm tra bằng kỹ thuật giải trình tự gen trên 
máy giải trình tự 3500 của Applied Biosystems 
– Thermo Fisher Scientific.
5. Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu tuân thủ các quy định về đạo 
đức trong nghiên cứu y sinh. Các thí nghiệm 
trong nghiên cứu tuân thủ theo đúng các quy 
trình, quy tắc phòng thí nghiệm.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
3TCNCYH 126 (2) - 2020
III. KẾT QUẢ
1. Hệ thống CRISPR/Cas9 xóa hoàn toàn exon3 trên gen RAPTOR
(Hình 1) Cột 2: Xuất hiện băng exon3 ở tế bào không gây đột biến. Cột 3: không hiển thị sản phẩm 
PCR do kích thước của đoạn intron rất lớn, các cặp mồi không thể bắt cặp, do đó phản ứng PCR 
không xảy ra. Cột 4: xuất hiện băng đột biến chứng tỏ exon 3 bị xóa bỏ.
Để khẳng định thêm bằng chứng exon 3 bị xóa bỏ hoàn toàn, chúng tôi kiểm tra trình tự genome 
và trình tự mRNA của tế bào đột biến. 
(Hình 2) A) Đoạn DNA nằm trong khoảng giữa hai sgRNA đích bao gồm cả exon 3 và một phần 
intron trước và sau exon 3 bị xóa bỏ. B) Trên mRNA, exon 3 bị xóa bỏ hoàn toàn, exon 2 và exon 4 
kết nối lại với nhau.
Hình 2. Kết quả giải trình tự DNA (A) và trình tự mRNA (B) của gen RAPTOR 
trên tế bào K562 bị gây đột biến.
3 2 4 1 
Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện 
xóa đoạn exon3 trên gen RAPTOR. 
Cột 1- Thang chuẩn 
Cột 2- Tế bào K562 không gây đột biến 
Cột 3- Tế bào không ung thư 
Cột 4- Tế bào K562 gây đột biến. 
2000 
1000 
500 
300 
bp 
 A B 
Intron2 Intron3 
Exon3 bị xóa trên DNA Exon3 bị xóa trên mRNA 
Exon2 Exon4 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
4 TCNCYH 126 (2) - 2020
2. CRISPR/Cas9 gây knockout gen Atg5 dẫn đến sự biến đổi protein và các sản phẩm trong 
con đường hoạt hóa của gen đó.
(Hình 3) Mẫu đột biến bị xóa các trình tự gen tương ứng với các axit amin K, L, M, E. Sự xóa đoạn 
gen Agt5 được khẳng định bằng thí nghiệm kiểm tra sự biến đổi của các protein mà bị ảnh hưởng 
bởi gen này.
Hình 3. Kết quả giải trình tự gen Atg5 và các acid amin tương ứng bị đột biến trên 
dòng tế bào ung thư não
Hình 4. Hình ảnh xóa gen Atg5 trên dòng tế bào ung thư não TGS04. Mẫu đột biến được 
kiểm tra bằng Western blotting. Mẫu bình thường: 1, 4; Mẫu đột biến: 2,3,5,6
(Hình 4) Gen Atg5 có vai trò hoạt hóa LC3I thành LC3II trong trong quá trình tự thực bào của tế 
bào. Nếu gen Atg5 bị đột biến mất chức năng thì phân tử LC3I cũng không được kích hoạt thành 
LC3II, dẫn tới sự không hình thành LC3II. Hình 4 cho thấy ở mẫu đột biến, protein Atg5 và LC3II biến 
mất hoàn toàn, đồng thời LC3I tăng lên đáng kể.
IV. BÀN LUẬN
Hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 đã 
được biết đến với hiệu quả cao chỉnh sửa gen, 
từ đó mở ra một ứng dụng vô cùng to lớn và 
hữu ích trong tương lai để nghiên cứu các chức 
năng gen và điều trị bệnh di truyền. So sánh với 
các kỹ thuật chỉnh sửa gen khác, thì hệ thống 
CRISPR/Cas9 cho chi phí sử dụng thấp, sử 
dụng đơn giản và dễ thực hiện. Nó không đòi 
hỏi phải thiết kế các phức hợp protein cũng như 
các kỹ thuật liên quan khác như các kỹ thuật 
Meganucleases (MNs), Zinc Finger Nucleases 
(ZNFs), Transcription Activator-Like Effector 
Nucleases (TALENs).1,2 RAPTOR là một trong 
những thành phần cấu tạo nên gen mTOR – 
một gen quan trọng trong con đường hoạt hóa 
PI3K-mTOR tham gia nhiều hoạt động của tế 
bào.8 Atg5 là một gen tham gia vào quá trình tự 
thực bào tế bào. Nghiên cứu của Ha và cộng 
AC AGA TTT GAC CAG TTT TGG GCC ATC AAT CGG AAA CTC ATG GAA TAT CCT 
GCA GAA GAA AAT 
 R F D Q F W A I N R K L M E Y P A 
E E N 
 GGA TTT CGT TAT ATC CCC TTT AGA ATA TAT CAG G 
AC AGA TTT GAC CAG TTT TGG GCC ATC AAT CGG AAA CTC ATG G AA TAT CCT 
GCA GAA GAA AAT 
 R F D Q F W A I N R K L M E N I L 
Q K K M 
 GGA TTT CGT TAT ATC CCC TTT AGA ATA TAT CAG G 
WT 
MT 
ATG5 50 
kDa 
1 
LC3-I 
LC3-II 
actin 
25 
37 
2 3 4 5 6 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
5TCNCYH 126 (2) - 2020
sự, năm 2018, cũng cho thấy dòng tế bào ung 
thư não bị đột biến gen Atg5 kết hợp với một 
số thuốc chống ung thư, kết quả điều trị có hiệu 
quả rõ rệt so với dòng tế bào không bị đột biến.⁹ 
Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra vai trò quan 
trọng của những gen này trong tế bào ung thư, 
và đột biến gen này có thể đưa lại hiệu quả điều 
trị khác biệt rõ rệt trong ung thư máu và ung thư 
não.8–10
Nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra hệ thống 
CRISPR/Cas9 có thể xóa hoàn toàn exon3 trên 
gen RAPTOR bằng cách sử dụng hai sgRNA 
đích khác nhau trên những vùng khác nhau của 
gen. Thí nghiệm tương tự với exon4 và một số 
exon khác, cũng cho hiệu quả xóa đoạn tương 
tự. Như vậy, với việc sử dụng đồng thời hai hay 
nhiều sgRNA đích trên cùng một gen hoặc trên 
các gen khác nhau, chúng ta có thể xóa bỏ một 
exon hoặc nhiều exon, xóa bỏ một hoặc nhiều 
gen mong muốn khác nhau. Điều này mở ra 
khả năng mới trong nghiên cứu về những rối 
loạn mang tính chất đa gen phức tạp.³
Nghiên cứu này cũng đã tạo ra một hệ thống 
CRISPR/Cas9 gây xóa gen Atg5 dẫn đến thay 
đổi mức độ biểu hiện protein tương ứng. Điều 
đó chứng tỏ rằng CRISPR/Cas9 có khả năng 
xóa hoàn toàn chức năng của gen, làm biến 
đổi các sản phẩm protein trong con đường hoạt 
hóa của chúng. Nhiều nghiên cứu trên thế giới 
đã chỉ ra rằng CRISPR/Cas9 có thể gây nhiều 
dạng đột biến khác nhau như đột biến điểm với 
sự mất, hoặc thêm một nucleotide, hoặc xóa 
bỏ một hay nhiều gen, và có thể là sự sắp xếp 
lại cấu trúc nhiễm sắc thể. Ứng dụng khả năng 
gây đột biến đa gen của hệ thống CRISPR/
Cas9, Heckl và cộng sự đã gây đột biến đồng 
thời 5 gen trong tế bào gốc tạo máu chuột để 
tạo ra mô hình bệnh bạch cầu tủy cấp tính. 
Tương tự như vậy, nhiều tác giả đã sử dụng 
hệ thống CRISPR/Cas9 để bất hoạt hai hoặc 
nhiều gen ức chế khối u trong ung thư gan, phổi 
ở trên chuột.4,5,11 Với nhiều kết quả nghiên cứu 
khả quan về hiệu quả chỉnh sửa gen, hiện nay 
hệ thống CRISPR/Cas9 đã và đang được thử 
nghiệm lâm sàng, đặc biệt là trong trị liệu gen 
và liệu pháp điều trị miễn dịch ung thư.2,9,10
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu của chúng tôi đã chỉ ra được 
hiệu quả gây đột biến gen RAPTOR và Atg5 
trên dòng tế bào ung thư máu và ung thư não 
bằng hệ thống CRISPR/Cas9. Hiệu quả gây đột 
biến này biểu hiện ở cả ba mức độ gen, mRNA 
và protein.
Trong tương lai chúng tôi tiếp tục ứng dụng 
khả năng gây đột biến đa gen của hệ thống này 
để đồng thời knockout hai hay nhiều gen không 
mong muốn, ứng dụng trong liệu pháp gen và 
liệu pháp miễn dịch trên lâm sàng, đặc biệt là 
trên bệnh ung thư và bệnh di truyền. 
Lời cảm ơn
Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn 
Bộ môn Y Sinh học – Di truyền, Trường Đại học 
Y Hà Nội, Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh 
viện Đại học Y Hà nội và sự giúp đỡ của giáo 
sư Atsushi Hirao, Trung tâm Ung thư, Đại học 
Kanazawa, Nhật Bản đã cung cấp các nguồn 
vật liệu cho nghiên cứu.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gaj T, Sirk SJ, Shui S-L, Liu J. 
Genome-Editing Technologies: Principles and 
Applications. Cold Spring Harb Perspect Biol. 
2016;8(12):a023754. doi:10.1101/cshperspect.
a023754
2. Doudna JA, Charpentier E. The new 
frontier of genome engineering with CRISPR-
Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096. 
doi:10.1126/science.1258096
3. Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex 
genome engineering using CRISPR/Cas 
systems. Science. 2013;339(6121):819-823. 
doi:10.1126/science.1231143
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
6 TCNCYH 126 (2) - 2020
4. Heckl D, Kowalczyk MS, Yudovich D, 
et al. Generation of mouse models of myeloid 
malignancy with combinatorial genetic lesions 
using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat 
Biotechnol. 2014;32(9):941-946. doi:10.1038/
nbt.2951
5. Xue W, Chen S, Yin H, et al. CRISPR-
mediated direct mutation of cancer genes in the 
mouse liver. Nature. 2014;514(7522):380-384. 
doi:10.1038/nature13589
6. Wang T, Birsoy K, Hughes NW, et al. 
Identification and characterization of essential 
genes in the human genome. Science. 
2015;350(6264):1096. doi:10.1126/science.
aac7041
7. Ikushima H, Todo T, Ino Y, Takahashi 
M, Miyazawa K, Miyazono K. Autocrine TGF-β 
Signaling Maintains Tumorigenicity of Glioma-
Initiating Cells through Sry-Related HMG-Box 
Factors. Cell Stem Cell. 2009;5(5):504-514. 
doi:10.1016/j.stem.2009.08.018
8. Earwaker P, Anderson C, Willenbrock 
F, Harris AL, Protheroe AS, Macaulay VM. 
RAPTOR up-regulation contributes to resistance 
of renal cancer cells to PI3K-mTOR inhibition. 
PloS One. 2018;13(2):e0191890-e0191890. 
doi:10.1371/journal.pone.0191890
9. Vu HT, Kobayashi M, Hegazy AM, 
et al. Autophagy inhibition synergizes with 
calcium mobilization to achieve efficient 
therapy of malignant gliomas. Cancer Sci. 
2018;109(8):2497-2508. doi:10.1111/cas.13695
10. Ghosh J, Kapur R. Regulation of 
Hematopoietic Stem Cell Self-Renewal and 
Leukemia Maintenance by the PI3K-mTORC1 
Pathway. Curr Stem Cell Rep. 2016;2(4):368-
378. doi:10.1007/s40778-016-0067-z
11. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, et al. 
CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing 
and cancer modeling. Cell. 2014;159(2):440-
455. doi:10.1016/j.cell.2014.09.014
Summary
A STUDY ON GENE EDITING BY CRISPR/CAS9 SYSTEM
IN CANCER CELL LINE
CRISPR/Cas9 system is one of the most high efficiency tool that could allow for clinical 
utilization to editing the gene of interest. The aim of study is editing RAPTOR and Atg5 gene on 
chronic myeloid leukemia cell line K562 and human glioma cell line TGS04 by using CRISPR/
Cas9 system. The targeted sequences of sgRNA were designed and inserted into the pX330 
plasmid. The pX330- inserted target sgRNA plasmids were transfected to targeted cells by 
electroporation. RAPTOR and Atg5 gene disruption were confirmed by PCR, sequencing 
and Western blotting. The results showed that CRISPR/Cas9 system could delete exon3 on 
RAPTOR gene; knockout Atg5 gene consequently significantly simultaneously increase and 
decrease protein expression levels of LC3I and LC3II. Therefore, CRISPR/Cas9 system could 
edit gene of interest resulting in alteration of proteins and other products in their pathway.
Keywords: CRISPR/Cas9, gene therapy, cancer cell line.