Khảo sát một số phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposome amphotericin B

T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 
 39 
KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GIẢM KÍCH THƯỚC 
TIỂU PHÂN LIPOSOME AMPHOTERICIN B 
 Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Văn Lâm** 
 Nguyễn Thái Sơn***; Phạm Thị Minh Huệ** 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: khảo sát một số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP) liposome 
amphotericin B (AmB). Phương pháp: liposome AmB được bào chế theo phương pháp hydrat 
hóa film và giảm KTTP bằng các phương pháp đùn tay qua màng, siêu âm và đồng nhất hóa áp 
suất cao kết hợp đùn qua màng. Kết quả: liposome AmB giảm KTTP bằng phương pháp đùn 
tay với thiết bị mini extruder có độ đồng nhất cao (PDI 200 nm; 
phương pháp dùng que siêu âm sau 4 phút có KTTP < 200 nm và phân bố KTTP đồng nhất 
(PDI 500 nm) và 
phân bố KTTP không đồng nhất (PDI > 0,5); phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp 
đùn qua màng với điều kiện áp suất đồng nhất hóa là 5000 psi, số chu kỳ đồng nhất hóa là 2, 
màng polycarbonat 400 nm, số lần đùn là 2 cho liposome AmB có hình cầu, đa số có 1 lớp, 
KTTP < 200 nm và phân bố KTTP tương đối đồng nhất (PDI < 0,3). Kết luận: đã khảo sát được 
một số phương pháp làm giảm KTTP liposome AmB. Trong đó, phương pháp đồng nhất hóa áp 
suất cao kết hợp đùn qua màng cho kết quả tốt nhất. Đây là cơ sở để nghiên cứu giai đoạn tiếp 
theo bào chế thuốc tiêm liposome AmB. 
* Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Kích thước tiểu phân; Giảm kích thước. 
Evaluating Methods of Particle Size Reduction of Liposome 
Amphotericin B 
Summary 
Objectives: To evaluate several methods for particle size reduction of liposome AmB. 
Materials and methods: Liposome AmB was prepared by using film hydration and its particle 
size was reduced by manual trans-membrane extrusion method, ultrasonification and combination of 
high pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion method. Results: 
Liposome AmB particle size reduction using manual trans-membrane extrusion method with 
miniextruder device resulted in high uniformity (PDI < 0.2) but the particle size was still greater 
than 200 nm; using ultrasonification probe method in 4 minutes enabled particle size to be 
smaller with less than 200 nm and particle size distributed evenly (PDI < 0.2); using ultrasonic 
method made particle size larger (above 500 nm) and particle size distributed unevenly (PDI > 0.5); 
* Học viện Quân y 
** Đại học Dược Hà Nội 
*** Bệnh viện Quân y 103 
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang ([email protected]) 
Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/08/2016 
 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2016 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 
 40
combination of high-pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion 
method, repeated twice at 5,000 psi, 400 nm sized polycarbonate membranes, resulted in 
spherical liposome Am B particle size of less than 200 nm, mostly 1 layer and particle size 
distributed relatively evenly (PDI < 0.3). Conclusion: Several methods of particle size reduction 
of liposome amphotericin have been evaluated and combination of high-pressure homogenization 
method with manual transmembrane extrusion method gave the best result. This is the basement 
for further studies in preparing liposome AmB injection. 
* Key words: Liposome; Amphotericin B; Particle size; Reduction. 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Liposome là hệ mang thuốc có nhiều 
ưu điểm nổi bật về kiểm soát giải phóng 
và khả năng đưa thuốc tới cơ quan đích... 
[2]. Để bào chế liposome, có nhiều phương 
pháp khác nhau, trong đó phương pháp 
hydrat hóa film thường được sử dụng do 
có các ưu điểm như: kỹ thuật bào chế 
tương đối đơn giản, dễ thực hiện, áp dụng 
cho tất cả các loại phospholipid, hiệu suất 
liposome hóa với dược chất tan trong lipid 
khá cao... Tuy nhiên, một trong những 
hạn chế của phương pháp là liposome 
thu được thường có kích thước lớn, 
nhiều lớp và không đồng nhất (khoảng 
50 - 1.000 nm) [2, 4]. Vì thế, nếu muốn 
đưa liposome vào dạng bào chế thuốc 
tiêm, cần tiếp tục xử lý để thu được 
liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất 
hơn, nhằm giúp quá trình lọc vô khuẩn 
thuận lợi, tăng cường đưa thuốc tới đích, 
Liposome AmB đã được nghiên cứu 
bào chế theo phương pháp hydrat hóa 
film [1]. Nghiên cứu này nhằm: Trình bày 
kết quả khảo sát một số phương pháp làm 
giảm KTTP và đồng nhất hóa liposome 
AmB. Đây là giai đoạn có vai trò quan trọng 
và có ý nghĩa quyết định đến quá trình 
nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế thuốc 
tiêm có chứa liposome AmB. 
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
1. Nguyên liệu và thiết bị. 
- Nguyên liệu: AmB, phosphatidylcholin 
đậu nành hydrogen hóa (HSPC), distearoyl 
phosphatidylglycerol (DSPG), cholesterol 
(Chol) và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn 
USP, tiêu chuẩn nhà sản xuất hoặc tinh 
khiết hóa học. 
- Thiết bị: hệ thống cất quay Rovapor 
R-210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32, 
dung tích 2.000 ml (Buchi, Đức); thiết bị 
đùn mini extruder (Eastern Scientific, Mỹ); 
thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin, 
Canada); bể siêu âm Wiseclean 40 kHz 
(Hàn Quốc); máy siêu âm que UP200Ht 
(Hielscher, Đức); hệ thống thiết bị phân 
tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Anh); 
kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 
JEOL 1010 (Nhật Bản) và các thiết bị, 
dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn nghiên cứu. 
2. Phương pháp nghiên cứu. 
* Phương pháp bào chế liposome AmB: 
Liposome AmB được bào chế theo 
phương pháp hydrat hóa film với các thành 
phần chính gồm AmB, HSPC, DSPG, Chol 
[1]. 
T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 
 41 
* Phương pháp giảm KTTP và đồng nhất 
hóa liposome AmB: 
- Phương pháp đùn ép qua màng 
polycarbonat bằng thiết bị mini extruder 
[2, 3]. 
- Phương pháp siêu âm: bằng bể siêu 
âm hoặc que siêu âm [2]. 
- Phương pháp đồng nhất hóa áp suất 
cao kết hợp đùn qua màng [2]. 
 * Phương pháp đánh giá đặc tính của 
liposome AmB: 
- KTTP và độ đồng nhất: sử dụng 
phương pháp tán xạ ánh sáng động với 
thiết bị Zetasizer ZS90. 
- Hình thái cấu trúc tiểu phân: bằng 
phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền 
qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản. 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 
BÀN LUẬN 
Tiến hành bào chế các mẫu liposome 
AmB theo phương pháp hydrat hóa film 
thu được kết quả có KTTP khoảng 738 - 
1.026 nm, phân bố KTTP khoảng 0,451 - 
0,868. Các mẫu liposome AmB này được 
dùng để khảo sát các biện pháp làm giảm 
KTTP và đồng nhất hóa. 
1. Kết quả khảo sát phương pháp đùn 
qua màng bằng thiết bị mini extruder. 
Liposome AmB sau khi bào chế được 
đùn ép lần lượt qua màng polycarbonat 
kích thước 1.000 - 400 - 200 nm bằng thiết 
bị đùn tay mini extruder. Mỗi mẫu đùn 
29 lần và giữ ở nhiệt độ 60oC trong suốt 
quá trình đùn bằng bể điều nhiệt. 
Bảng 1: KTTP và phân bố KTTP của các 
mẫu liposome AmB trước và sau khi đùn tay. 
Trước đùn Sau đùn 
KTTP (d.nm) PDI KTTP (d.nm) PDI 
738,8 0,495 207,5 0,122 
750,0 0,566 211,6 0,111 
761,6 0,686 233,5 0,227 
Các mẫu liposome AmB sau đùn có 
chỉ số PDI thấp (từ 0,111 - 0,227) cho 
thấy phân bố KTTP đồng nhất. Tuy nhiên, 
KTTP vẫn còn lớn (> 200 nm), thể tích 
mỗi lần đùn tay chỉ được 1 ml nên khó áp 
dụng ở quy mô lớn. 
2. Kết quả khảo sát phương pháp 
siêu âm. 
* Phương pháp sử dụng que siêu âm: 
Liposome AmB sau khi bào chế cho 
vào cốc có mỏ. Sau đó, siêu âm bằng 
máy siêu âm que UP200Ht. Sau thời gian 
1, 2, 3 đến 10 phút, lấy mẫu đo KTTP 
và phân bố KTTP. 
Bảng 2: KTTP và phân bố KTTP của 
các mẫu liposome AmB sử dụng que siêu 
âm (n = 3). 
Thời gian 
siêu âm (phút) 
KTTP 
(d.nm) PDI 
Ban đầu 566,0 ± 11,5 0,607 ± 0,019 
 256,7 ± 5,3 0,453 ± 0,031 
2 202,9 ± 4,3 0,411 ± 0,031 
3 175,4 ± 4,5 0,303 ± 0,008 
4 148,1 ± 0,1 0,255 ± 0,008 
5 146,6 ± 1,3 0,212 ± 0,025 
6 139,1 ± 0,1 0,220 ± 0,028 
7 139,4 ± 0,1 0,227 ± 0,001 
8 140,6 ± 0,4 0,248 ± 0,004 
9 141,3 ± 4,7 0,253 ± 0,001 
10 145,9 ± 1,0 0,272 ± 0,007 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 
 42
Với phương pháp sử dụng que siêu 
âm, sau 4 phút, các mẫu đã cho kết quả 
có KTTP < 200 nm, phân bố KTTP tương 
đối đồng nhất (PDI < 0,3). Hạn chế của 
phương pháp là thường đưa các tạp chất 
vào chế phẩm [2] và chỉ áp dụng ở quy 
mô nhỏ. 
* Phương pháp sử dụng bể siêu âm: 
Liposome AmB sau khi bào chế cho 
vào cốc có mỏ và tiến hành siêu âm 
trong bể Wiseclean (40 kHz) với quy trình 
siêu âm ngắt quãng: siêu âm 30 giây, 
nghỉ 30 giây (mẫu A1); siêu âm 1 phút, 
nghỉ 1 phút (mẫu A2); siêu âm 2 phút, 
nghỉ 2 phút (mẫu A3) (trong quá trình siêu 
âm sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt 
cục bộ hỗn dịch liposome). Sau 20 phút, 
lấy mẫu đo KTTP và phân bố KTTP. 
Bảng 3: KTTP và phân bố KTTP của các 
mẫu liposome AmB sử dụng bể siêu âm 
(n = 3). 
Mẫu KTTP (d.nm) PDI 
A1 522,13 ± 26,05 0,727 ± 0,075 
A2 507,97 ± 33,62 0,713 ± 0,104 
A3 662,30 ± 59,01 0,542 ± 0,051 
Sau 20 phút, các quy trình siêu âm 
đều cho liposome AmB có KTTP lớn 
(> 500 nm) và phân bố KTTP không đồng 
nhất (PDI > 0,5). Điều này cho thấy, hiệu 
quả của việc giảm KTTP liposome AmB 
bằng bể siêu âm cho kết quả thấp. Chỉ có 
thể ứng dụng để sơ bộ giảm KTTP 
liposome trước khi áp dụng các phương 
pháp khác. 
3. Kết quả khảo sát phương pháp 
đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn 
qua màng. 
Liposome AmB sau khi bào chế được 
tiến hành đồng nhất hóa và đùn qua màng 
bằng máy Emulsiflex-C5 dưới áp lực của 
bình khí N2 lỏng, áp suất 5.000 psi (350 bar). 
Khảo sát số lần đùn khác nhau để tìm 
ra điều kiện phù hợp. Sau đó, kết hợp 
đùn qua màng 400 nm ở áp suất 500 psi 
(35 bar). 
* Ảnh hưởng của số chu kỳ đồng nhất 
hóa: 
Bảng 4: KTTP và phân bố KTTP của các 
mẫu liposome AmB theo số chu kỳ đống 
nhất hóa. 
Số chu kỳ KTTP (d.nm) PDI 
0 882,6 0,508 
1 174,0 0,408 
2 149,2 0,364 
3 141,9 0,376 
4 135,1 0,382 
5 130,5 0,371 
6 121,1 0,376 
7 112,5 0,306 
8 110,0 0,294 
Sau chu kỳ thứ nhất, KTTP liposome 
AmB đã giảm xuống dưới 200 nm. Tuy nhiên, 
phân bố KTTP chưa đồng nhất (PDI > 0,4). 
Từ chu kỳ thứ 2 trở đi, KTTP liposome 
AmB có xu hướng giảm dần và PDI duy 
trì khoảng 0,3. Vì vậy, cần kết hợp mẫu 
đã giảm KTTP với đùn qua màng để tăng 
độ đồng nhất. 
T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 
 43 
* Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần đùn qua màng: 
Các mẫu liposome AmB sau khi đồng nhất hóa, tiến hành đùn qua màng polycarbonat 
400 nm ở áp suất 500 psi. 
Bảng 5: KTTP và phân bố KTTP các mẫu liposome AmB theo số lần đùn qua màng. 
Số lần KTTP (d.nm) PDI 
0 149,2 0,364 
1 134,3 0,337 
2 134,9 0,281 
3 131,8 0,274 
4 131,6 0,275 
Sau khi đùn qua màng 400 nm, ở chu kỳ thứ 2, PDI giảm xuống < 0,3, mẫu đã đồng 
nhất hơn. Sự khác biệt về KTTP và phân bố KTTP của mẫu giữa chu kỳ thứ 2 và các 
chu kỳ tiếp theo không rõ rệt. 
Hình ảnh chụp TEM các mẫu sau khi đồng nhất áp suất cao và đùn qua màng cho 
thấy các tiểu phân vẫn có cấu trúc hình cầu, đa số có một lớp, KTTP nhỏ và đồng nhất 
(hình 1). 
 (a) Ban đầu (b) Sau giảm KTTP 
Hình 1: Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm KTTP bằng 
phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp với đùn qua màng (b). 
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 
 44
KẾT LUẬN 
Đã tiến hành khảo sát các phương pháp 
giảm KTTP liposome AmB, cụ thể: 
- Với phương pháp đùn tay bằng thiết 
bị mini extruder, liposome AmB có độ 
đồng nhất cao (PDI < 0,2) nhưng KTTP 
vẫn lớn hơn 200 nm. 
- Với phương pháp siêu âm dùng que 
siêu âm, sau 4 phút đã cho liposome AmB 
có KTTP nhỏ hơn 200 nm và phân bố KTTP 
đồng nhất (PDI < 0,2). 
- Với phương pháp siêu âm dùng bể 
siêu âm, các quy trình siêu âm khác nhau 
đều cho liposome AmB có KTTP lớn 
(> 500 nm) và phân bố KTTP không đồng 
nhất (PDI > 0,5). 
- Với phương pháp đồng nhất hóa áp 
suất cao kết hợp đùn qua màng, áp suất 
đồng nhất hóa là 5.000 psi, số chu kỳ đồng 
nhất hóa là 2, màng polycarbonat 400 nm, 
số lần đùn là 2 đã cho liposome AmB có 
hình cầu, đa số có 1 lớp, KTTP < 200 nm 
và phân bố KTTP tương đối đồng nhất 
(PDI < 0,3). 
Kết quả khảo sát này sẽ là cơ sở để 
tiến hành các giai đoạn tiếp theo trong 
quá trình nghiên cứu bào chế thuốc tiêm 
liposome AmB. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Phạm Thị Minh Huệ, Nguyễn Văn Lâm, 
Nguyễn Tuấn Quang. Nghiên cứu bào chế 
liposome doxorubicin và AmB bằng phương 
pháp hydrat hóa film. Tạp chí Khoa học và 
Công nghệ Việt Nam. 2014, số 23, tr.61-64. 
2. Võ Xuân Minh, Phạm Thị Minh Huệ. Kỹ 
thuật nano và liposome ứng dụng trong dược 
phẩm, mỹ phẩm. NXB Y học. 2013, tr.60-73. 
3. Hope M J, Nayar R, Mayer L D, Cullis P. 
R. Reduction of liposome size and preparation 
of unilamellar vesicles by extrusion techniques. 
Liposome Technology. 1993, 1, pp.123-139. 
4. Wagner A et al. Liposomes technology 
for industrial purposes. J Drug Del. 2011, 4, 
pp.1-9.