Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ vi khuẩn đường ruột của người khỏe mạnh

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 
DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508 
83 
H2O2 PRODUCTION IN Lactobacillus STRAINS ISOLATED FROM THE 
INTESTINAL MICROBIOME OF HEALTHY PEOPLE 
Ha Thi Thu1, Hoang The Hung2, Tran Xuan Thach1, Nguyen Thi Hoa1, La Thi Lan Anh3, 
Vu Thi Hien1, Nguyen Dinh Duy1, Dong Van Quyen1, Nguyen Thi Tuyet Nhung1,* 
1 Molecular Microbiology Department - Institute of Biotechnology (IBT) - Vietnam Academy 
of Science and Technology (VAST) 
2 Research Institute of Military Logistics Science - Military Academy of Logistics 
3 Graduate University of Science and Technology - VAST 
Received 20 October 2019, accepted 6 January 2020 
ABSTRACT 
Lactobacillus sp. in the digestive tract are capable of producing H2O2 to inhibit the growth of 
harmful bacteria and balance the gut microflora. In this study, we have isolated 115 strains of 
Lactobacillus spp. from stool samples of healthy people in Ha Noi. Of the 50 tested 
Lactobacillus strains, 9 strains were capable of producing H2O2, of which the Lac.VFE-14 strain 
produced highly H2O2 with a concentration of 2.183 mM, followed by Lac.VFE-08 strains (2.081 
mM) and Lac.VFE-04 (2.067 mM). All three strains grew well in MRS medium supplemented 
with bile salts or adjusted to low pH value. With 0.3% of bile salt, the survival rates of these 3 
strains were 99%, 95% and 97%, respectively. At pH 3.0, after 3 hours of cultivation, the 
survival rates of the three strains were 98.54%, 94.15% and 95.27%, respectively. In addition, 
each of the cell-free culture supernatants of these three strains that inhibit the growth of S. aureus 
ATCC-23235. The inhibition zone diameters of the three strains were 19.0±1.0 mm, 14.0±1.0 
mm and 11.7±1.3 mm, respectively. The results of 16S rRNA gene analyses showed that 
Lac.VFE-14, Lac.VFE-08 and Lac.VFE-04 had high similarity scores with L. plantarum ZZU 23 
(100%), L. rhamnosus JCM 1136 (99%) and L. plantarum S7 (98.65%), respectively. This study 
indicates that all three strains have the potential to be used as probiotics in the future. 
Keywords: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, bile salt, antimicrobial activity. 
Citation: Ha Thi Thu, Hoang The Hung, Tran Xuan Thach, Nguyen Thi Hoa, La Thi Lan Anh, Vu Thi Hien, Nguyen 
Dinh Duy, Dong Van Quyen, Nguyen Thi Tuyet Nhung, 2020. H2O2 production in Lactobacillus strains isolated from 
the intestinal microbiome of healthy people. Tap chi Sinh hoc (Journal of Biology), 42(1): 83–92. 
https://doi.org/10.15625/0866-7160/v42n1.14508. 
*Corresponding author email: nttnhung@ibt.ac.vn 
©2020 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 
TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 
DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508 
84 
KHẢ NĂNG SINH H2O2 CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Lactobacillus 
PHÂN LẬP TỪ HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT CỦA NGƯỜI KHỎE MẠNH 
Hà Thị Thu1, Hoàng Thế Hưng2, Trần Xuân Thạch1, Nguyễn Thị Hoa1, Lã Thị Lan Anh3, 
Vũ Thị Hiền1, Nguyễn Đình Duy1, Đồng Văn Quyền1, Nguyễn Thị Tuyết Nhung1,* 
1Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, 
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
2Viện Nghiên cứu Khoa học Hậu cần Quân sự, Học viện Hậu cần 
3Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
Ngày nhận bài 20-10-2019, ngày chấp nhận 6-1-2020 
TÓM TẮT 
Vi khuẩn Lactobacillus sp. trong đường tiêu hóa, có khả năng sinh H2O2 ức chế sự sinh trưởng vi 
khuẩn gây hại và làm cân bằng hệ vi khuẩn có ích. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập 
được 115 chủng vi khuẩn Lactobacillus từ mẫu phân của người khỏe mạnh tại Hà Nội. Trong số 
50 chủng Lactobacillus được kiểm tra, có 9 chủng có khả năng sinh H2O2, trong đó chủng 
Lac.VFE-14 sinh H2O2 mạnh nhất với nồng độ thu được là 2,183 mM, tiếp theo là các chủng 
Lac.VFE-08 (2,081 mM) và Lac.VFE-04 (2,067 mM). Ba chủng này đều sinh trưởng tốt trong 
môi trường MRS có bổ sung muối mật hay môi trường có độ pH thấp. Với 0,3% muối mật, tỷ lệ 
tế bào sống sót của 3 chủng nêu trên ương ứng là 99%, 95% và 97%. Ở pH 3, sau 3 giờ nuôi cấy, 
tỷ lệ tế bào sống sót của 3 chủng ương ứng là 98,54%, 94,15% và 95,27%. Bên cạnh đó, dịch 
nuôi đã loại bỏ tế bào của 3 chủng này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn 
Staphylococcus aureus ATCC-23235. Hoạt tính ức chế thể hiện qua đường kính vòng kháng 
khuẩn của 3 chủng ương ứng là 19,0±1,0 mm; 14,0±1,0 mm và 11,7±1,3 mm. So sánh trình tự 
16S của 3 chủng với các trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen cho thấy 3 chủng này có sự 
tương đồng cao lần lượt với L. plantarum ZZU 23; L. rhamnosus JCM 1136 và L. plantarum 
S7. Kết quả thu được cho thấy cả 3 chủng này đều có tiềm năng sử dụng làm probiotic trong 
tương lai. 
Từ khóa: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, muối mật, kháng khuẩn. 
*Địa chỉ liên hệ email: nttnhung@ibt.ac.vn 
MỞ ĐẦU 
Lactobacillus là một trong những vi 
khuẩn probiotic được sử dụng phổ biến, đem 
lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người. Sử 
dụng probiotic Lactobacillus làm cân bằng 
hệ vi sinh vật đường tiêu hóa trong cơ thể vật 
chủ, điều chỉnh phản ứng miễn dịch và chống 
lại hoạt động của các vi sinh vật gây bệnh 
(Markowiak, 2017). Các chủng Lactobacillus 
spp. có khả năng ức chế và tiêu diệt các vi 
sinh vật gây bệnh do sự cạnh tranh chất dinh 
dưỡng, khả năng sản sinh axit làm giảm pH 
môi trường, tạo biofilm và các chất kháng 
khuẩn trong đó có H2O2 (Bermudez et al., 
2012). 
H2O2 là một một chất oxi hóa mạnh, có 
khả năng dễ dàng chuyển đổi thành gốc 
hydroxyl, đây là một chất oxi hóa mạnh có tác 
dụng gây độc cho tế bào, ức chế sự sinh 
trưởng của nhiều loài vi khuẩn như 
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và 
Staphylococcus aureus (Boateng et al., 2011). 
H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 
85 
Một số thành viên trong nhóm vi khuẩn 
Lactobacillus có khả năng sản sinh H2O2 như: 
L. johnsonii, L. acidophilus, L. fermentum và 
L. gasseri (Hertzberger et al., 2014). Tùy 
thuộc vào từng chủng, khả năng sản xuất 
H2O2 của chúng khác nhau với nồng độ dao 
động trong khoảng từ 0,8 đến 6,4 mM 
(Belicová et al., 2013). Khả năng tạo H2O2 của 
chủng L. fermentum CS 12-1 là 3,5 mM 
(Kang et al., 2005), chủng L. johnsonii 
NCC533 là 1 mM (Hertzberger et al., 2014) 
hay các chủng Lactobacillus từ 0,059 đến 
0,176 mM (Zalán et al., 2005). 
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức 
chế sinh trưởng và tiết độc tố của vi khuẩn S. 
aureus (Eggers et al., 2018). Nghiên cứu của 
Misaghi et al. (2017) cho thấy, cả ba loài L. 
acidophilus, L. paracasei và L. fermentum đều 
có khả năng ức chế sinh trưởng của S. aureus. 
Ngoài ra, các chủng thuộc chi Lactobacillus 
này cũng ức chế biểu hiện gen Staphylococcal 
enterotoxin, một yếu tố gây độc chính của S. 
aureus. Bằng thử nghiệm lâm sàng, Eggers et 
al. (2018) cho thấy, những người sử dụng vi 
khuẩn probiotic L. rhamnosus HN001 có khả 
năng làm giảm từ 73 đến 83% số lượng vi 
khuẩn S. aureus đường ruột so với những 
người chỉ dùng giả dược. Hơn nữa, dịch nuôi 
đã loại bỏ tế bào Lactobacillus cũng ức chế 
sinh trưởng của S. aureus nhờ chúng có khả 
năng tiết ra môi trường những chất kháng 
khuẩn như ethanol, H2O2 và các bacteriocin 
(Chen et al., 2019). 
Từ những lý do nêu trên, trong nghiên cứu 
này, chúng tôi đã phân lập, sàng lọc và đánh 
giá khả năng sinh H2O2 của các chủng vi 
khuẩn Lactobacillus và kiểm tra khả năng 
kháng S. aureus của các chủng vi khuẩn này. 
Kết quả thu được sẽ bổ sung nguồn dữ liệu cho 
các nghiên cứu về khả năng sinh H2O2 cũng 
như các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn 
Lactobacillus sp được phân lập ở Việt Nam. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
NGHIÊN CỨU 
Nguồn mẫu phân lập 
Các mẫu phân từ từ những người khỏe 
mạnh tình nguyện tham gia nghiên cứu sống 
ở khu vực Hà Nội tự thu thập và để trong 
hộp vô trùng. Mẫu sau đó được giữ lạnh ở 
4oC và chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để 
phân tích. 
Phân lập vi khuẩn Lactobacillus 
Quá trình phân lập các chủng 
Lactobacillus từ mẫu phân thường gặp khó 
khăn vì sự hiện diện của các vi sinh vật cạnh 
tranh với số lượng lớn như: Bifidobacterium, 
Streptococcus và Enterococcus. Vì thế, chúng 
tôi đã lựa chọn môi trường MRS; pH 6,2 cho 
việc phân lập chủng Lactobacillus từ mẫu 
phân vì môi trường này cho số lượng khuẩn 
lạc tốt với kích thước và hình thái khuẩn lạc 
đặc trưng cho Lactobacilli (Corry et al., 
2003). Một gam mẫu phân sẽ được hòa trong 
9 mL nước muối sinh lý vô trùng. Dung dịch 
sau đó sẽ được pha loãng 10 lần liên tiếp cho 
đến 10-7. Mỗi một nồng độ pha loãng từ 10-5 
đến 10-7 sẽ được cấy gạt trên môi trường thạch 
MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) và được 
nuôi cấy trong điều kiện kị khí ở 37oC trong 
48 giờ. Các khuẩn lạc phát triển trên các đĩa 
MRS sẽ được lựa chọn và làm sạch bằng cách 
cấy ria trên đĩa MRS để thu nhận những 
khuẩn lạc riêng lẻ. Những khuẩn lạc này sẽ 
được giữ trên đĩa thạch MRS để sử dụng cho 
những nghiên cứu tiếp và được lưu trữ lâu dài 
ở (-)80oC trong dịch MRS có bổ sung 20% 
glycerol. Các mẫu vi khuẩn sẽ được kiểm tra 
hình thái dưới kính hiển vi, hoạt tính catalase 
và nhuộm Gram. Chỉ những khuẩn lạc âm tính 
với hoạt tính catalase và là Gram dương sẽ 
được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo. 
Phương pháp định tính và định lượng H2O2 
Phương pháp của Martín & Suárez (2010) 
được sử dụng để xác định sự có mặt của H2O2 
trong dịch nuôi các chủng vi khuẩn 
Lactobacillus đã phân lập (Martin & Suárez, 
2010). Vi khuẩn được cấy chuyển sang 5 mL 
môi trường MRS nuôi lắc 200 vòng/phút ở 
37oC trong 24 giờ. Tế bào vi khuẩn được loại 
bỏ bằng ly tâm, dịch nổi thu được bổ sung vào 
hỗn hợp có chứa enzyme HRP (horseradish 
peroxidase, Sigma, USA) và TMB (3,3’,5,5’-
Tetramethylbezidine, Sigma) trong đệm 
phosphate (pH 6) với tổng thể tích 1 mL. Ban 
đầu TMB ở dạng khử, không màu, khi có mặt 
của HRP và H2O2, TMB bị oxi hóa và chuyển 
thành màu xanh. 
Ha Thi Thu et al. 
86 
Phương pháp trên cũng được sử dụng để 
định lượng nồng độ H2O2 do các chủng vi 
khuẩn sản xuất được. Tiến hành dựng đường 
chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ H2O2 
và mật độ quang ở bước sóng 620 nm của sản 
phẩm màu sau phản ứng với TMB bằng cách 
sử dụng dung dịch chuẩn H2O2 100 mM. 
Nồng độ H2O2 do các chủng vi khuẩn 
Lactobacillus sinh ra được tính toán dựa vào 
đường chuẩn khi đo độ hấp thụ quang ở bước 
sóng 620 nm. Mỗi một thí nghiệm được lặp lại 
3 lần. 
Phương pháp xác định khả năng chịu muối 
mật và axit 
Các chủng vi khuẩn đã sàng lọc có khả 
năng sinh H2O2 được nuôi cấy trong bình 
chứa môi trường MRS có bổ sung muối mật 
Oxgall (Sigma) với nồng độ 0,3% và bình đối 
chứng không bổ sung muối mật. Bình nuôi 
cấy được ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ, 
sau đó kiểm tra khả năng sống sót của các 
chủng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng 
và cấy trên đĩa thạch, đếm số lượng khuẩn lạc. 
Sau 24 giờ nuôi cấy các chủng vi khuẩn 
Lactobacillus trong môi trường MRS, tiến 
hành thử nghiệm khả năng chịu axit bằng cách 
ủ ở pH 2 và pH 3 trong 3 giờ. Pha loãng và 
cấy trên đĩa thạch để xác định khả năng sống 
sót của các chủng vi khuẩn. 
Phương pháp định danh các chủng 
Lactobacillus bằng giải trình tự gen 16S 
rRNA 
16S rARN gồm các vùng bảo tồn và biến 
đổi cao, thường được sử dụng để nhận dạng 
loài và phân biệt loài (Tomas et al., 2013). 
Các chủng vi khuẩn được chọn lọc, sẽ được 
định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 
dựa theo kỹ thuật giải trình tự đoạn gen 16S 
rARN (Nanda et al., 2018). 
Xác định khả năng ức chế sinh trưởng trên 
vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus 
Một mL dịch tế bào vi khuẩn S. aureus 
ATCC-23235 được trải đều trên bề mặt đĩa 
petri chứa 15 mL môi trường thạch BHI 
(Brain Heart Infusion), sau đó hút bỏ dịch 
thừa. Để đĩa thạch vào tủ ấm 37oC trong 15 
phút. Dịch nuôi vi khuẩn Lactobacillus 24 giờ 
được ly tâm loại bỏ tế bào. Nhỏ 20 µL dịch ly 
tâm các chủng vi khuẩn Lactobacillus gồm 
Lac.VFE-04, Lac.VFE-08, Lac.VFE-14 hoặc 
dung dịch muối sinh lý (làm đối chứng) thành 
từng điểm riêng trên đĩa petri đã trải vi khuẩn 
S. aureus ATCC-23235. Ủ các đĩa petri đã 
được cấy vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí 
với nhiệt độ 37oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan 
sát hiện tượng và đo kích thước vòng kháng 
khuẩn quanh điểm nhỏ dịch ly tâm các chủng 
vi khuẩn Lactobacillus để xác định khả năng 
ức chế sinh trưởng của dịch nuôi đối với vi 
khuẩn S. aureus ATCC-23235. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Chúng tôi đã phân lập được trên môi 
trường MRS 115 chủng Lactobacillus. Các 
khuẩn lạc chủ yếu có dạng lồi, mịn (không 
nhăn), trắng đục, không màu, rìa trơn hoặc xẻ 
thùy. Trên môi trường MRS, các khuẩn lạc 
trên cùng một đường ria mọc đều nhau, phát 
triển đồng nhất về hình thái và màu sắc không 
lẫn khuẩn lạc lạ (hình 1). Các vi khuẩn này 
đồng nhất dưới kính hiển vi quang học, hình 
que, dương tính khi nhuộm Gram và âm tính 
với thử nghiệm catalase. 
Hình 1. Tế bào Lactobacillus (Lac.VFE-14) 
nhuộm gram quan sát dưới kính hiển vi 
điện tử 
Định tính và định lượng H2O2 
Phương pháp đo màu dựa trên HRP/TMB 
được chúng tôi sử dụng để xác định sự có mặt 
của H2O2 trong dịch nuôi vi khuẩn có độ nhạy 
H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 
87 
cao và độc tính thấp (Xianyu et al., 2013). Các 
phản ứng màu với TMB có độ nhạy rất cao, 
phát hiện được nồng độ H2O2 từ lượng rất 
thấp từ nanomolar đến millimolar) (Martin et 
al., 2010). 
phản ứng màu với TMB có độ nhạy rất cao, phát hiện được nồng độ H2O2 từ lượng rất thấp từ 
nanomolar đến millimolar) (Martin et al., 2010). 
Lac. 
VFE-04 
ĐC Lac. 
VFE-08 
Lac. 
VFE-14 
Hình 2. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi 
khuẩn Lactobacillus so với đối chứng 
Sau khi bổ sung HRP và TMB vào dịch 
nuôi vi khuẩn Lactobacillus đã ly tâm, môi 
trường chuyển ngay từ màu vàng sang xanh ở 
hầu hết các mẫu với độ đậm nhạt khác nhau 
tùy thuộc vào lượng H2O2 có mặt trong dịch 
nuôi của từng chủng vi khuẩn (hình 2). 
Kết quả kiểm tra khả năng sinh H2O2 của 
các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân lập 
được thể hiện trên bảng 1. Trong đó, chủng có 
khả năng sinh ra lượng H2O2 lớn nhất là 
Lac.VFE-14 đạt 2,183 mM, tiếp theo là 
Lac.VFE-08 và Lac.VFE-04 với nồng độ 
H2O2 tương ứng đạt 2,081 mM và 2,067 mM 
sau 24 giờ nuôi cấy. Lượng H2O2 sinh ra của 
các chủng đã phân lập được tương đối cao so 
với với các chủng ở các nghiên cứu trước đó. 
Nghiên cứu cho thấy khả năng sinh H2O2 
phụ thuộc vào từng loài cụ thể. Trong thí 
nghiệm của Hertzberger et al. (2014), khả năng 
sinh H2O2 của chủng L. johnsonni NCC 533 là 
1 mM, trong khi khả năng sản sinh H2O2 của L. 
plantarum 2142 là 0,16 mM còn L. casei 
Shirota là 0,056 mM (Zalán et al., 2005). 
Nguồn cacbon cũng có ảnh hưởng nhất định 
đến nồng độ H2O2. Khi sử dụng nguồn carbon 
là galactose, L. bulgaricus sản xuất được lượng 
H2O2 cao nhất là 0,02 mM, nhưng khi sorbitol 
được sử dụng, lượng H2O2 được tạo ra là 
0,0006 mM. Ngoài ra, nguồn nitơ hay yếu tố 
nhiệt độ cũng có khả năng tác động lên khả 
năng sinh H2O2 của vi khuẩn (Enitan et al ... vật tổng hợp được. 
Hình 3. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ H2O2 
và mật độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB 
Ha Thi Thu et al. 
88 
Bảng 1. Giá trị trung bình của 3 lần đo OD620nm và hàm lượng H2O2 có trong dịch nuôi 
Chủng vi khuẩn Giá trị OD620nm Nồng độ H2O2 (mM) 
Lac.VFE-04 0,976 ± 0,011 2,067 ± 0,008 
Lac.VFE-08 0,981 ± 0,012 2,081 ± 0,003 
Lac.VFE-09 0,621 ± 0,017 1,005 ± 0,012 
Lac.VFE-14 1,015 ± 0,014 2,183 ± 0,006 
Lac.VFE-16 0,557 ± 0,012 0,812 ± 0,012 
Lac.VFE-17 0,454 ± 0,013 0,504 ± 0,001 
Lac.VFE-48 0,560 ± 0,012 0,822 ± 0,002 
Lac.VFE-72 0,327 ± 0,011 0,125 ± 0,005 
Lac.VFE-76 0,294 ± 0,014 0,024 ± 0,001 
Khả năng chịu pH axit và muối mật của 
các chủng được chọn lọc 
Để đến được ruột non và đại tràng ở 
người, thực hiện chức năng sinh học, vi sinh 
vật cần phải vượt qua dạ dày, nơi có pH rất 
thấp (pH < 3) (Derrien etal., 2015). Khả năng 
chịu axit của các chủng vi khuẩn được khảo 
sát bằng cách xác định số lượng khuẩn lạc sau 
khi ủ vi khuẩn ở pH 2 và 3 trong 3 giờ. Kết 
quả được thể hiện ở bảng 2. Sau 3 giờ ủ ở pH 
3, tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn này 
khá cao, tương ứng 95,27%, 94,15% và 
98,54%. Ở pH 2, lượng tế bào còn sống so với 
đối chứng vẫn tương đối cao, với tỷ lệ sống 
của Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 
tương ứng 85,12%, 84,51% và 88,22%. 
Sau khi di chuyển qua dạ dày, vi sinh vật 
lại phải đối mặt với dịch mật. Sự tiếp xúc với 
mật là một thử thách cho các vi khuẩn xâm 
nhập vào đường tiêu hóa. Muối mật hoạt động 
như một chất tẩy rửa sinh học, làm phá hủy 
màng tế bào vi khuẩn, muốn tồn tại được vi 
khuẩn phải có khả năng chịu muối mật 
(Urdaneta et al., 2017). Vì thế khả năng chịu 
axit và muối mật là đặc tính quan trọng cần có 
của hệ vi khuẩn đường ruột. 
Bảng 2. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ của các chủng vi khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng 
Chủng 
Tỷ lệ sống sót sau khi ủ (%) 
0,3% muối mật pH 2 pH 3 
Lac.VFE-04 97,02 ± 1,12 85,12 ± 5,44 95,27 ± 3,21 
Lac.VFE-08 95,15 ± 1,14 84,51 ± 8,01 94,15 ± 5,69 
Lac.VFE-14 99,08 ± 1,02 88,22 ± 5,14 98,54 ± 6,68 
Nồng độ muối mật 0,3% được xem là 
nồng độ quan trọng để xác định khả năng chịu 
muối mật của các chủng vi khuẩn probiotic 
LAB (Belicová et al., 2013). Hầu hết các 
chủng được chúng tôi thử nghiệm đều duy trì 
khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường 
MRS có bổ sung muối mật 0,3%. So với đối 
chứng không có muối mật, tỷ lệ sinh trưởng 
của các chủng này dao động từ 90 đến 99%. 
Chủng Lac.VFE-14 có khả năng sinh trưởng 
tốt nhất với tỷ lệ 99,08%, gần như không có 
sự khác biệt so với đối chứng. Các chủng 
Lac.VFE-04 và Lac.VFE-08 có tỷ lệ sống sót 
tương ứng là 97,02% và 95,15% (bảng 2). 
Kết quả trên cho thấy, các chủng vi khuẩn 
trong nghiên cứu này có khả năng chịu axit và 
muối mật tốt so với với các chủng vi khuẩn 
lactic ở các nghiên cứu trước. Trong nghiên 
của Nguyễn Văn Thanh và nnk. (2007) cũng 
đã chỉ ra trong môi trường pH 3 và 4, tỷ lệ 
sống của các chủng L. acidophilus và L. casei 
là 41 và 65%. Trong điều kiện pH 2, tỷ lệ 
sống sót của 2 chủng vi khuẩn lactic L. casei 
VTCC186 và L. pentosus D3 trong sản phẩm 
kefir chanh dây là 39,36 và 52,01%. Các 
chủng này cũng có khả năng sinh trưởng trên 
môi trường có sự hiện diện của muối mật với 
nồng độ 0,3% (Quách Đức Tính và nnk., 
H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 
89 
2013). Một nghiên cứu khác (Shehata et al., 
2016) cho thấy, trong môi trường MRS có bổ 
sung 0,3% muối mật, tỷ lệ sống sót của các 
chủng vi khuẩn lactic dao động trong khoảng 
69,8 đến 85%. Các chủng này cũng có tỷ lệ 
sống sót từ 68 đến 88,3% sau 3 giờ ủ trong 
môi trường dịch dạ dày nhân tạo ở pH 2. Như 
vậy, có thể thấy, so với những chủng đã được 
nghiên cứu trước đây, 3 chủng Lac.VFE-04, 
Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 có khả năng chịu 
pH axit và muối mật vượt trội hơn hẳn. 
Kết quả định danh vi khuẩn theo phương 
pháp giải trình tự gen 16S rRNA 
Sau khi so sánh trình tự 16S rRNA của 3 
chủng chọn lọc được với các trình tự 16S 
rRNA đã được công bố trên ngân hàng gen 
(NCBI), cho thấy Lac.VFE-14 và Lac.VFE-04 
có mức độ tương đồng là 100% và 99% tương 
ứng so với chủng L. plantarum ZZU 23 và L. 
plantarum S7. Trong khi đó, Lac.VFE-08 có 
độ tương đồng lên tới 98,65% so với L. 
rhamnosus JCM 1136 (bảng 3). 
Bảng 3. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã được công bố trên ngân hàng gen (NCBI) 
của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14 
Kí hiệu chủng 
phân lập 
Tên chủng 
Mã số đăng ký trên 
NCBI 
Identify 
(Tương đồng) 
Lac.VFE -04 
L. plantarum S7 GU195646.1 99% 
L. plantarum T3R1C1 JX193637.1 99% 
L. plantarum ST-III CP002222.1 99% 
Lac.VFE -08 
L. rhamnosus JCM 1136 NR_113332.1 98,65% 
L. rhamnosus NBRC 3425 NR_043408.1 98,38% 
L. rhamnosus JCM 1136 NR_043408.1 98,38% 
Lac.VFE -14 
L.plantarum ZZU 23 AB830324.1 100% 
L. plantarum C KM507561.1 100% 
L. plantarum KLB 416 KM670024.1 100% 
Nhóm 1 
Nhóm 2 
Hình 4. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự 
gene 16S các chủng phân lập Lac. VFE-04, 
Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng 
phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree 
Với kết quả này, khi xây dựng cây phát 
sinh chủng loại để đánh giá mối quan hệ di 
truyền của các chủng phân lập với một số 
chủng thuộc chi Lactobacillus. Kết quả thu 
được cho thấy, các chủng được khảo sát chia 
thành 2 nhóm rõ rệt. Trong đó, nhóm 1 cho 
thấy chủng phân lập Lac. VFE-08 có mối 
quan hệ di truyền gần nhất với chủng L. 
rhamnosus JCM 1136 và các chủng thuộc chi 
Lactobacillus như L. paracasei, L. casei và L. 
zeae (hình 4). Nhóm 2, các chủng phân lập 
Lac. VFE-04, Lac. VFE-14 thể hiện mối quan 
hệ di truyền cao nhất với các chủng thuộc loài 
L. plantarum. 
Dựa trên kết quả cây phát sinh loài, 2 
dòng Lac.VFE-04 và Lac.VFE-14 có quan hệ 
gần với L. plantarum và Lac.VFE-08 là L. 
rhamnosus. 
Khả năng ức chế sinh trưởng trên vi khuẩn 
gây bệnh S. aureus 
S. aureus là một trong những tác nhân 
chính gây nhiễm trùng ở người cũng như động 
vật (Johansson et al., 2016; Ren et al., 2017). 
Việc sử dụng kháng sinh liều cao để tiêu diệt 
vi khuẩn này có nguy cơ gây kháng kháng 
sinh. Vì vậy, hiện nay sản phẩm probiotics 
đang được sử dụng như một liệu pháp thay thế 
Ha Thi Thu et al. 
90 
kháng sinh để chống lại vi khuẩn này (Eggers 
et al., 2018). 
Lactobacillus đã được biết đến từ lâu với 
khả năng sinh chất kháng khuẩn bao gồm 
H2O2, kháng sinh, các axit hữu cơ. Trong 
nghiên cứu này, dịch nuôi vi khuẩn đã loại bỏ 
tế bào của các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, 
Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 đều thể hiện khả 
năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn S. aureus 
ATCC-23235, khả năng ức chế của mỗi chủng 
là khác nhau được thể hiện trên hình 5. Hoạt 
tính ức chế sự sinh trưởng của S. aureus 
ATCC-23235 của các chủng vi khuẩn này 
được xác định bằng cách đo đường kính vòng 
kháng khuẩn trên đĩa petri. Chủng Lac.VFE-14 
có đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất là 
19,0 ± 1,0 mm, tiếp theo là các chủng 
Lac.VFE-08 với đường kính là 14,0 ± 1,0 mm 
vàLac.VFE-04 là 11,7 ± 1,3 mm. 
Hình 5. Khả năng ức chế sự sinh trưởng trên 
S. aureus của các chủng Lactobacillus 
Trong nghiên cứu về L. rhamnosus, 
Fornitano et al. (2019) cho thấy khả năng ức 
chế sự sinh trưởng của S. aureus cũng như 
làm giảm khả năng sản xuất enzyme gây độc 
coagulase (giảm từ 20,45 đến 22,73%). Đối 
với probiotic L. rhamnosus HN001, sau 4 tuần 
thử nghiệm trên các đối tượng binh sĩ dương 
tính với nhiễm S. aureus, số lượng S. aureus 
giảm 73 đến 83% so với nhóm dùng giả dược 
(Eggers et al., 2018). Nghiên cứu của Misaghi 
et al. (2017) cho thấy các vi khuẩn 
Lactobacillus gồm L. acidophilus, L. 
fermentum và L. paracasei ức chế sự sản xuất 
các Staphylococcal enterotoxin (SE) bao gồm 
SEA, SEC và SEE của vi khuẩn S. aureus. 
Như vậy, có thể thấy các chủng vi khuẩn 
Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 
trong nghiên cứu này có khả năng ức chế sự 
sinh trưởng của S. aureus ATCC-23235, có 
tiềm năng trong tương lai để hỗ trợ điều trị 
bệnh nhiễm trùng do S. aureus. 
KẾT LUẬN 
Chúng tôi đã phân lập được 115 chủng 
Lactobacillus trên môi trường MRS từ các 
mẫu phân của những người khỏe mạnh. 
Trong đó, ba chủng biểu hiện hoạt tính sinh 
H2O2 mạnh nhất lần lượt là Lac.VFE-14 
(2,183 mM), Lac.VFE-08 (2,081 mM) và 
Lac.VFE-04 (2,067 mM). Kết quả trình tự 
16S rARN của 3 chủng cho thấy Lac.VFE-14 
có độ tương đồng 100% với L. plantarum 
ZZU 23; Lac.VFE-04 có độ tương đồng 99% 
với L. plantarum S7 và Lac.VFE-08 có độ 
tương đồng 98,65% với L. rhamnosus JCM 
1136. Sản phẩm tiết của các chủng này có tác 
dụng ức chế vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. 
Các chủng này có tiềm năng dùng cho sản 
xuất probiotic nhờ khả năng chịu được môi 
trường pH axit và muối mật cũng như khả 
năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn S. 
aureus ATCC-23235. 
Lời cảm ơn: Công trình này được thực hiện 
nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số 
CT0000.03/18-19 do TS. Nguyễn Thị Tuyết 
Nhung làm chủ nhiệm. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Belicová A., Mikulášová M., Dušinský R., 
2013. Probiotic potential and safety 
properties of Lactobacillus plantarum 
from Slovak Bryndza cheese. BioMed 
research international, 2013(ID 760298): 
8 pp. 
Bermudez-Brito M., Plaza-Díaz J., Muñoz-
Quezada S., Gómez-Llorente C., Gil A., 
2012. "Probiotic mechanisms of action." 
H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 
91 
Annals of Nutrition and Metabolism, 
61(2): 160–174. 
Boateng, M., S. Price, K. Huddersman and S. 
E. Walsh ., 2011. Antimicrobial activities 
of hydrogen peroxide and its activation by 
a novel heterogeneous Fenton’s‐like 
modified PAN catalyst. Journal of applied 
microbiology, 111(6): 1533–1543. 
Chen C., Lai C., Huang L., Huang Y., Toh S., 
Weng C., Chuang C., Lu C., H.-J. Tang ., 
2019. Antimicrobial activity of 
Lactobacillus species against carbapenem-
resistant Enterobacteriaceae. Frontiers in 
microbiology, 10: 789. 
Corry J.E.L., Curtis G.D.W., Baird R. M., 
2003. Handbook of Culture Media for 
Food Microbiology. Elsevier Science, 37. 
Davoodabadi A., Dallal M. M. S., Foroushani 
A. R., Douraghi M., Harati F. A., 2015. 
Antibacterial activity of Lactobacillus spp. 
isolated from the feces of healthy infants 
against enteropathogenic bacteria. 
Anaerobe, 34: 53–58. 
Derrien M., van Hylckama Vlieg J. E., 2015. 
Fate, activity, and impact of ingested 
bacteria within the human gut microbiota. 
Trends in microbiology, 23(6): 354–366. 
Thi Bich Thuy Do, Thi Diem Huong Nguyen, 
2018. Determination of salt intolerance 
and probiotic properties of lactic acid 
bacteria isolated from gut of Decapterus 
lajang. HUAF journal of agricultural 
science & technology, Hue University - 
University of Agriculture and Forestry, 
2(2): 799–806 [in Vietnamese]. 
Eggers S., Barker A. K., Valentine S., Hess 
T., Duster M., Safdar N., 2018. Effect of 
Lactobacillus rhamnosus HN001 on 
carriage of Staphylococcus aureus: results 
of the impact of probiotics for reducing 
infections in veterans (IMPROVE) study. 
BMC infectious diseases, 18(1): 129. 
Enitan A., Adeyemo J., Ogunbanwo S., 2011. 
Influence of growth conditions and 
nutritional requirements on the production 
of hydrogen peroxide by lactic acid 
bacteria. African journal of microbiology 
research, 5(15): 2059–2066. 
Fornitano A., Amêndola I., Santos S., 2019. 
Lactobacillus rhamnosus versus 
Staphylococcus aureus: influence on 
growth and expression of virulence 
factors. J Dent Maxillofacial Res, 2(2): 
29–33. 
Hertzberger R., Arents J., Dekker H. L., 
Pridmore R. D., Gysler C., Kleerebezem 
M., de Mattos M. J. T., 2014. H2O2 
production in species of the 
Lactobacillus acidophilus group: a 
central role for a novel NADH-
dependent flavin reductase. Appl. 
Environ. Microbiol., 80(7): 2229–2239. 
Johansson M. A., Björkander S., Mata 
Forsberg M., Qazi K. R., Salvany Celades 
M., Bittmann J., Eberl M., Sverremark-
Ekström E., 2016. Probiotic lactobacilli 
modulate Staphylococcus aureus-induced 
activation of conventional and 
unconventional T cells and NK cells. 
Frontiers in immunology, 7: 273. 
Kang D.-K., Oh H., Ham J.-S., Kim J., Yoon 
C., Ahn Y., Kim H., 2005. Identification 
and characterization of hydrogen 
peroxide-generating Lactobacillus 
fermentum CS12-1. Asian-australasian 
journal of animal sciences, 18(1): 90–95. 
Nanda., Chaudhary., Kumar., 2018. Molecular 
Approaches for Identification of 
Lactobacilli from Traditional Dairy. 
Advances in Animal Biotechnology and its 
Applications, 181–196. 
Van Thanh Nguyen, Thu Hoa Tran, Vu Tuong 
Vy Nguyen, 2007. Investigation of acid, 
bile salt and antibiotic tolerance of some 
oral probiotics. Pharmaceutical journal, 
378: 255–263 [in Vietnamese]. 
Markowiak P., Śliżewska K., 2017. Effects of 
probiotics, prebiotics, and synbiotics on 
human health. Nutrients, 9(9): 1021. 
Martín R., Suárez J. E., 2010. Biosynthesis 
and degradation of H2O2 by vaginal 
lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol., 
76(2): 400–405. 
Ha Thi Thu et al. 
92 
Misaghi A., Parsaeimehr M., Akhondzadeh 
A., Gandomi H., Azizkhani M., 2017. The 
inhibitory effects of Lactobacillus 
fermentum, Lactobacillus acidophilus and 
Lactobacillus paracasei isolated from 
yoghurt on the growth and enterotoxin A 
gene expression of S. aureus. Iranian 
Journal of Veterinary Medicine, 11(2): 
191–201. 
Tomas Vetrovsky, Petr Baldrian ., 2013. The 
Variability of The 16S rRNA Gene in 
Bacterial Genomes and Its Consequences 
for Bacterial Community Analyses. Plos 
One 8: (2). 
Duc Tinh Quach, Thanh Trung Tong, Ngoc 
Duy Nguyen, Thuy Huong Nguyen, 2013. 
 Investigation of some probiotic properties 
of traditional and Lactobacillus casei 
VTCC186-supplemented Kefir. Science & 
Technology Development, 16(3): 40–47 
[in Vietnamese]. 
Ren D., Gong S., Shu J., Zhu J., Rong F., 
Zhang Z., Wang D., Gao L., Qu T., Liu 
H., 2017. Mixed Lactobacillus plantarum 
strains inhibit Staphylococcus aureus 
induced inflammation and ameliorate 
intestinal microflora in mice. BioMed 
research international., 
2017(ID 7476467): 7 pages. 
Shehata M., El Sohaimy S., El-Sahn M. A., 
Youssef M.,2016. Screening of isolated 
potential probiotic lactic acid bacteria for 
cholesterol lowering property and bile salt 
hydrolase activity. Annals of Agricultural 
Sciences, 61(1): 65–75. 
Urdaneta V., Casadesús J., 2017. Interactions 
between bacteria and bile salts in the 
gastrointestinal and hepatobiliary tracts. 
Frontiers in medicine, 4: 163. 
Xianyu Y., Zhu K., Chen W., Wang X., Zhao 
H., Sun J., Wang Z., Jiang X., 2013. 
Enzymatic assay for Cu (II) with 
horseradish peroxidase and its application 
in colorimetric logic gate. Analytical 
chemistry, 85(15): 7029–7032. 
Zalán Z., Németh E., Baráth Á., Halász A., 
2005. Influence of growth medium on 
hydrogen peroxide and bacteriocin 
production of Lactobacillus strains. Food 
Technology and Biotechnology, 43(3): 
219–225.