Hệ thống giới hạn - Sửa đổi R-M IIG hỗ trợ cho việc tạo ra các protein có tính đặc hiệu mới

SỐ 37 - Tháng 3+4/2017
Website: yhoccongdong.vn 135
2017JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE
HỆ THỐNG GIỚI HẠN - SỬA ĐỔI R-M IIG HỖ TRỢ CHO 
VIỆC TẠO RA CÁC PROTEIN CÓ TÍNH ĐẶC HIỆU MỚI
Lê Thị Kim Tuyến1
TÓM TẮT
Hệ thống giới-hạn sửa đổi R-M II tồn tại ở thế giới vi 
khuẩn gồm có hai chức năng quan trọng là cắt giới hạn và 
methyltransferase. Enzym giới hạn II đã có vai trò thiết yếu 
cho sự thúc đẩy của sinh học phân tử. Tiếp theo là các 
methyltransferase đã trở thành enzym mà các nhà khoa học 
quan tâm đến, vì có thể có vai trò quan trọng trong quá trình 
điều hòa gen. Sau khi ADN được tổng hợp, trong các thay 
đổi ngoại di truyền (epigenetic) tạo ra các tín hiểu mở đóng 
gen, sự methyl hóa acid nucleic thông qua toàn bộ genom 
là rất phổ biến. Tiếp tục sàng lọc và phân tích các hệ thống 
R-MII ở vi khuẩn là cần thiết để phục vụ nghiên cứu sự điều 
hòa gen. Sự khám phá mới của các hệ thống R-M IIG mang 
cả hai chức năng cắt giới hạn và methyl hóa trên một protein 
duy nhất đã cho phép cải tiến sàng lọc enzym trong 
GenBank. Việc xác định tính đặc hiệu của một họ enzym 
R-M IIG tái tổ hợp cho phép tìm ra một số quy luật về tương 
tác giữa acid amin và nucleotid nhận biết. Trên cơ sở đó, 
protein có tính đặc hiệu mới đã được tạo ra thành công. 
Từ khóa: Hệ thống R-M II; enzym giới hạn; methyltransferase; 
xác định tính đặc hiệu; nghiên cứu in silico.
SUMMARY:
RESTRICTION-MODIFICATION SYSTEM IIG 
ALLOWS ENGINEERING OF NEW PROTEIN 
SPECIFICITIES
Restriction-Modification RM II systems, specific of the 
bacterial kingdom, have two important enzymatic functions 
which are restriction endonuclease and methyltransferase. 
Restriction enzymes had already an essential role in the 
developement of the molecular biology. Now scientists are 
interested in methyltransferases for their role in the gene 
regulation process. After the DNA synthesis, among the 
epigenetic modifications that could lead to turn the genes 
on and off, the methylation throughout the genom is usual. 
Thus, screening of R-M II systems in bacteria is still 
necessary to provide more tools for the DNA research. The 
new discovery of the R-M II G systems bearing the two 
endonuclease and methyltransferase on one unique protein 
has allowed the possibility to be screened in Genbank. From 
the specificity determination of recombined R-M IIG 
enzymes belonging to the same family, some rules could 
have been deduced to know the interactions between the 
amino acids and the nucleotides recognized. On that basis, 
proteins with new specificities has been successfully engineered.
Key words: R-M II system; restriction enzyme; 
methyltransferase; specificity determination; in silico 
research.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ khi khám phá các enzym giới hạn II vào năm 1968, 
chức năng cắt ADN ở các vị trí đặc hiệu đã cho phép phân 
tích ADN genom, một đại phân tử gồm vài triệu nucleotid 
ở các loài vi khuẩn và vài tỷ nucleotid ở các tế bào cao cấp. 
Các enzym giới hạn đã trở thành những công cụ có ích đã 
thúc đẩy sự phát triển của ngành sinh học phân tử [1], [2]. 
Có ba phương pháp nổi bật nhất được thiết lập nhờ có enzym 
này: 1) Bản đồ giới hạn ADN và tạo ra những dấu vết ADN 
đặc hiệu như dấu vân tay, không chỉ cho phép phân biệt giữa 
các loài sinh vật với nhau mà còn có thể phân biệt 2 cả thể 
cùng một loài; 2) Phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp 
dùng chức năng cắt đặc hiệu ADN để gắn gen vào vector 
nhằm biến nạp vào một vi trùng dễ mọc như Escherischia 
coli được dùng như một nhà máy sản xuất protein. 3) ADN 
genom được cắt giới hạn tạo ra những đoạn ADN đủ nhỏ để 
được giải trình tự, khi ghép lại với nhau đưa ra trình tự của 
toản bộ ADN genom khổng lồ. 
Trước đây, enzyme giới hạn chỉ được coi như là những 
công cụ dùng trong nghiên cứu. Nhưng nó tồn tại dưới hình 
thức là một hệ thống giới hạn - sửa đổi với methyltransferase 
cùng một tính đặc hiệu. Hiện nay, các methyltransferase còn 
được quan tâm nhiều hơn vì nó tham gia vào các biến đổi 
1. Trường đại học Thăng Long, Hà Nội - Email: [email protected]
Ngày nhận bài: 05/02/2017 Ngày phản biện: 18/02/2017 Ngày duyệt đăng: 25/02/2017
 V
IỆN
 SỨ
C K
HỎE CỘNG ĐỒ
NG
SỐ 37- Tháng 3+4/2017
Website: yhoccongdong.vn136
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ngoại di truyền (epigenetic), trên cơ sở đó việc tìm ra các hệ 
thống R-M II có tính đặc hiệu mới cần phải. Việc khám phá 
các protein R-M IIG làm thay đổi cách sàng lọc các protein 
có tính đặc hiệu mới với hiệu quả cao, thậm chí cho phép 
hiểu được quy luật tương tác giữa acid amin và nucleotide 
nhận biết. Quy luật được suy ra lần đầu tiên ở một họ protein 
giống MmeI và cho phép tạo ra các enzyme có tính đặc hiệu 
mới bằng đột biến gen tương tự ở các chỗ qui định.
Nghiên cứu sàng lọc enzyme giới hạn theo phương pháp 
cổ điển đến khả năng tạo ra enzyme mới bằng phương pháp 
đột biến gen được trình bày từng giai đoạn sau.
II. NỘI DUNG
2.1. Quá trình sang lọc enzyme giới hạn II nhiều đặc 
hiệu khác nhau
New England Biolabs là công ty đầu tiên vừa sản xuất 
enzym giới hạn II vừa sàng lọc những enzim có tính đặc hiệu 
mới. Từ 1968 đến 2005, một số phòng thí nghiệm ở nhiều 
nước, trong đó có Việt Nam [3], [4] đã cùng tham gia sàng 
lọc các enzym giới hạn từ các vi khuẩn thiên nhiên. Phương 
pháp đã dùng phổ biến gồm có giai đoạn mọc vi khuẩn thuần 
chủng, thử phản ứng dịch thô của tế bào phá vỡ với ADN 
chuẩn. Sự có mặt của enzym giới hạn hoạt tính được khẳng 
định khi thấy băng ADN cắt giới hạn. Phương pháp này 
không hiệu quả bằng phương pháp sinh học phân tử, dùng 
ADN dò để tìm gen. Nhưng những gen của enzym đã được 
tìm ra trong thời gian đó có độ giống nhau ít về trình tự, do 
vậy rất khó được nhận ra trực tiếp trên cả genom. Tuy nhiên 
enzym giới hạn II luôn thuộc một hệ thống sửa đổi-giới hạn 
II (R-M II) gồm một enzym giới hạn và một methyltransferase 
thường được mã bởi hai gen nằm sát gần nhau trên genom. 
Chính gen methyltransferase có những đặc điểm trình tự cho 
phép phân biệt các gen này trong cả genom [5]. Do đó, có thể 
phát hiện ra gen enzym giới hạn một cách gián tiếp, khi dò 
gen methyltransferase trước, biết rằng gen enzym giới hạn 
nằm sát bên cạnh, bên phải hoặc bên trái. 
New Englands Biolabs đã sản xuất hơn 250 enzym giới 
hạn có tính đặc hiệu khác nhau được phân phối khắp thế 
giới [6]. Danh sách này chủ yếu gồm enzym nhận ra trình 
tự nucleotid xuôi ngược và có số lượng enzym nhiều, không 
cần thiết bổ sung vào enzym mới khác nếu chỉ nhằm mục 
đích có thêm công cụ cho các phương pháp sinh học phân 
tử. Tuy nhiên, việc tiếp cận với enzym giới hạn không chấm 
dứt được vì nó là bộ phận không tách rời được của một hệ 
thống R-M. Hiện nay, các nghiên cứu thời sự thiên về sự điều 
hòa của các gen, hiểu được các cơ chế khiến protein được 
sản xuất ở mức độ cần thiết và đúng thời điểm để bảo đảm 
sự sống của tế bào. Cụ thể hơn, sự rối loạn trong quá trình 
điều hòa này có thể giải thích nguyên nhân của một số bệnh 
ung thư. Các loại điều hòa dẫn đến sự đóng mở của gen vậy 
cần phải có tín hiệu đặc biệt. Trình tự nucleotid của toàn bộ 
ADN genom cho phép xác định vị trí và tính chất các gen 
của một tế bào, tuy nhiên, sau khi ADN tổng hợp, có những 
thay đổi ngoại di truyền (epigenetic) xẩy ra được giả thuyết 
là tham gia vào sự điều hòa gen. Trong các hiện tượng ngoại 
di truyền, sự methyl hóa của nucleotid rất phổ biến, do vậy 
các methyltransferase chiếm một vai trò quan trọng. Vì lý do 
này, việc sàng lọc và phân tích các hệ thống R-M ở vi khuẩn 
tiếp tục có lợi ích nhằm tạo ra khả năng tìm những công cụ 
mới phục vụ việc nghiên cứu ADN. 
Sự phát hiện họ protein R-M IIG có trình tự giống nhau 
nhưng nhận ra các trình tự nucleotid khác nhau đã thay đổi 
cách sàng lọc các hệ thống giới hạn-sửa đổi nhanh và hiệu 
quả hơn.
2.2. Các protein R-M IIG mang cả hai chức năng sửa 
đổi và giới hạn 
Gần đây, một họ enzym giới hạn đã được khám phá, với 
đặc điểm khác so với enzym giới hạn cổ điển. Đại diện của 
họ enzym được tìm đầu tiên này là MmeI thuộc vi khuẩn 
Methylophilus methylotrophus. MmeI được mô tả như là 
một protein duy nhất mang hai chức năng giới hạn và methyl 
hóa ADN, nhận biết trình tự không đối xứng 5'-TCCRAC-3' 
cắt 20/18 N ngoài trình tự nhận biết. Nó có những đặc tính 
của endonuclease và methyltransferase tạo ra N6-methyl 
adenine, được nhận xét thông qua trình tự protein tại 3 khu 
vực chức năng:
- Ở phần đầu có đoạn cố định P(D)...(D/E)XK đánh dấu 
được vị trí hoạt động của sự phân huỷ liên kết phosphodiester trên 
acid nucleic, đặc điểm này thuộc về các endonuclease phụ 
thuộc vào kim loại. Cụ thể ở đây là VD70 (9X)E80MK82;
- Ở giữa có những đoạn cố định đặc hiệu của các 
methyltransferase tạo ra N6-methyl adenine, gồm có motif I, 
G312AHYTS, motif X, F359FDPACGCGNFL và motif IV, 
G480NPPF.
- Ở cuối, có vùng TRD (Target Recognition Domain) 
nhận ra trình tự nucleotid đích, trường hợp của MmeI là 
5'-TCCRAC-3'.
Hệ thống R-M này chỉ có một protein mang hai chức năng 
cùng lúc (được phân loại là R-M II G) là đơn giản hóa quá 
trình tự bảo vệ của vi khuẩn chống sự xâm nhập của ADN 
lạ. Với các hệ thống R-M II cổ điển, chức năng cắt và sửa 
đổi được mang trên 2 protein khác nhau, tức là mỗi protein 
có một vùng TRD riêng. Như vậy, khi xảy ra đột biến, làm 
thay đổi trình tự nhận biết đặc hiệu của endonuclease, thì khả 
năng có cùng thay đổi xảy ra với methyltransferase gần như 
không. Điều này dẫn đến sự chết của tế bào chủ vì ADN bị 
SỐ 37 - Tháng 3+4/2017
Website: yhoccongdong.vn 137
2017JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE
cắt ở những trình tự nucleotid mới nhận biết và không được 
methyl hóa. Trong khi đó, MmeI chỉ có một vùng chung 
TRD nhận ra ADN ở trình tự nucleotid đặc hiệu. Khi đột 
biến xảy ra trong vùng TRD duy nhất này làm thay đổi trình 
tự nhận biết, lúc đó chức năng giới hạn và sửa đổi dựa vào 
vùng TRD chung mới và tiếp tục phối hợp với nhau để đảm 
bảo ADN genom tế bào chủ được bảo vệ trong khi ADN lạ 
không được bảo vệ sẽ bị phân hủy. 
2.3. Nghiên cứu tương tác acid amin và nucleotide ở 
họ MmeI
Ở thế giới vi khuẩn, đột biến có thể xảy ra với tỷ lệ cao 
và chúng ta có thể đặt giả thuyết rằng trong thiên nhiên, các 
gen tương tự với MmeI có thể có những đột biến khác nhau 
trong vùng TRD dẫn đến các trình tự nucleotid khác nhau 
được nhận biết. Sự khám phá của họ enzym giống MmeI có 
thể chứng minh một phần nào rằng giả thuyết này là đúng. 
Dựa trên các phần mềm so sánh trình tự acid amin của MmeI 
để khai thác các trình tự đã được công bố ở GenBank, kết 
quả liệt kê nhiều enzym giả định giống MmeI, có độ giống 
nhau cao, thuộc về nhiều vi khuẩn khác nhau. Các tác giả 
[7] xin các ADN genom trong danh sách này, để phân tích 
gen giả định mã cho enzym thuộc họ MmeI. Gen được nhân 
lên bằng PCR và sản phẩm ADN khuếch đại được clon vào 
Escherischia coli. Khi tế bào tái tổ hợp biểu hiện enzyme giới 
hạn, các tính đặc hiệu được xác định cho thấy có nhiều trình 
tự được nhận ra (Bảng 1). 
Như vậy, mỗi protein phân tích có một vùng TRD nhận 
ra một trình tự nucleotid riêng biệt. Khi đối chiếu các trình 
tự acid amin của vùng TRD với các trình tự nucleotid được 
nhận ra, có những kết quả nổi bật. Số thứ tự của các nucleotid 
trong trình tự nhận biết 6 nucleotid được ghi như sau: 
nucleotid cuối cùng là số 6 và nucleotid đầu tiên là 1. Trong 
họ MmeI, các protein nhận biết nucleotid thứ 5 đều là A. 
Những quy luật đơn giản có thể được suy ra với nucleotid 
6, là C hoặc G (Hình 1). Một đôi acid amin được quan sát 
có tương quan cao với nucleotid số 6 này. Ở vị trí tương 
tự MmeI R808, nucleotid C được nhận ra bởi một arginine 
(R) và nucleotid G được nhận ra bởi aspartate (D). Ở vị trí 
tương tự MmeI E806 acid amin thứ 2 là glutamate (E) có 
một vai trò nhận ra nucleotid C với tỷ lệ 9/10 protein; acid 
amin thứ 2 có vai trò nhận ra nucleotid G là lysine (K) với 
cùng một tỷ lệ. 
Bảng 1 : Danh sách các enzym hạn chế họ MmeI đã xác định tính đặc hiệu
Tuy phức tạp hơn, quy luật có thể được suy ra với nucleotid 
số 3 như thấy ở Hình 2. Ở đây cũng nhận xét có một đôi acid 
amin tương quan với sự nhận ra nucleotid số 3 này, là G (10 
enzym), là C (7 enzym), là T (3 enzym) hoặc Y nhận ra 
pyrimidine C hoặc T (1 enzym). Những enzym nhận ra G đều 
có acid amin có điện tích dương (K hoặc R), ở vị trí tương tự 
MmeI E751, trong khi nucleotid C được nhận ra bởi acid amin 
D có điện tích âm (5/7) hoặc serine (R). Cái acid amin thứ 2 ở vị 
 V
IỆN
 SỨ
C K
HỎE CỘNG ĐỒ
NG
SỐ 37- Tháng 3+4/2017
Website: yhoccongdong.vn138
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
Hình 1: Đoạn trình tự acid amin các vùng TRD đối chiếu với nucleotid số 6 ở trình tự nhận biết trên ADN.
Hình 2: Đoạn trình tự acid amin các vùng TRD đối chiếu với nucleotid số 3 ở trình tự nhận biết trên ADN. 
trí tương tự Mme I N773 tham gia vào sự nhận biết của nucleotid 
G là acid amin D (7/10) hoặc S. Đối với những enzym nhận ra 
C, có một asparagine (N), một serine (S) hoặc một histidine (H).
SỐ 37 - Tháng 3+4/2017
Website: yhoccongdong.vn 139
2017JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE
2.4. Tương tác quan hệ acid amin và nucleotid ở họ 
MmeI dùng để tạo ra enzym R-M IIG có tính đặc hiệu mới.
Từ các tương tác đưa ra ở trên, sự nhận biết của 2 enzym 
MmeI (TCCRAG) và NmeAIII (GCCGAC) cùng một họ được 
thử nghiệm bằng cách tạo ra những đột biến trên gen tương tự 
[8]. Các thay đổi acid amin trên enzym được thực hiện để 
nghiên cứu sự nhận biết ở nucleotid số 6, số 3 và số 4. Kết quả 
cắt ADN chuẩn của những enzym thay đổi được thấy ở trên 
Hình 5. Để thay đổi sự nhận biết ở nucleotid số 6 từ MmeI để có 
nucleotid G thành nucleotid C, đột biến đôi được thực hiện để E 
thành K ở vị trí MmeI 806 (ghi tóm tắt là MmeI E806K) và để 
R thành D ở vị trí MmeI 808 (MmeI R808D). Một thử nghiệm 
được thực hiện với NmeIII để thay thế sự nhận biết ở nucleotid 
số 6 để có nucleotid C thành nucleotid G bằng tạo ra đột biến đôi 
NmeAIII K816E và NmeAIII D818R. Hai kết quả với MmeI 
(6G) và NmeAIII (6C) đã cho thấy những băng giới hạn của 
ADN chuẩn lambda cắt với enzym thay đổi này giống các băng 
lý thuyết cắt ở đứng vị trí TCCRAG và GCCGAG.
Khi thay đổi nucleotid 4 bằng đột biến đôi MmeI A774L, kết 
quả chỉ rằng enzym mới tạo ra có đặc hiệu chờ đợi là TCCGAC, 
với ít đoạn giới hạn hơn của hình vạch MmeI gốc mà nhận ra 
TCCRAG tức là TCCAAG và TCCGAC. Khi tạo ra đột biến 
đôi MmeI A774K, R810S, enzym có đặc hiệu mới là TCCCAC.
Những thay đổi phối hợp được thực hiện với MmeI ở cả hai 
vị trí nucleotid số 4 và số 6 như trên cùng lúc bằng tạo ra ba đột 
biến A774L, E806K và R808D. Kết quả dẫn đến một enzym 
với đúng đặc hiệu chờ đợi là TCCGAG. Những thay đổi phối 
hợp được thực hiện với NmeAIII ở 3 vị trí nucleotid số 3, 4 và 6 
cùng lúc bằng tạo ra 5 đột biến S761R, N783D, L784A, K816E 
và D818R. Trường hợp cuối cùng này cũng dẫn đến có một 
enzym có tính đặc hiệu mới là TCGRAC.
Hình 3: Đoạn trình tự acid amin các vùng TRD đối chiếu với nucleotid số 4 ở trình tự nhận biết trên ADN. 
Đối với nucleotid số 4 (Hình 3), có một enzym nhận ra 
nucleotid A, 5 enzym nhận ra nucleotid C, 9 enzym nhận 
ra nucleotid G, 4 enzym nhận ra R (nucleotid A hoặc G) và 2 
enzym nhận ra N (bất cứ nucleotid nào). Trong trường hợp này 
cũng thấy có sự tham gia của một đôi acid amin. Các purine (A, 
G hoặc cả hai là R) được nhận ra bởi acid amin R ở vị trí tương 
tự với MmeI R810. Acid amin thứ 2 ở vị trí tương tự MmeI 
A774 nhận ra nucleotid G, có thể là leucine (L), Methionine 
(M), acid glutamic (E) hoặc Threonine (T). 
 V
IỆN
 SỨ
C K
HỎE CỘNG ĐỒ
NG
SỐ 37- Tháng 3+4/2017
Website: yhoccongdong.vn140
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
III. KẾT LUẬN
Phương pháp này cho thấy một khả năng mới để khai 
thác các số liệu khổng lồ và phong phú của những trình tự 
genom ADN được công bố trên GenBank. Các gen được 
chọn in silico chỉ là những đoạn nucleotid được phân 
tích có dấu hiệu là mã cho protein về mặt lý thuyết. Như 
thế, danh sách các enzym thuộc họ MmeI mà xuất hiện 
trên màn hình máy tính chỉ được coi như là protein “giả 
thuyết” ở đây là “methyltransferase giả định”. Những ADN 
genom của chủng vi khuẩn nhất định đã được công bố trình 
được dùng để clon gen được chọn lọc. Chỉ có khi protein 
biểu hiện hoạt tính mới khẳng định được tính chất thực của 
gen [9]. Hiệu quả cao của phương pháp này là có sản phẩm 
tái tổ hợp hoạt tính. Mặt khác, việc khám phá họ các enzym 
giống MmeI đã cho phép sàng lọc thêm methyltransferase 
mới. Tính đặc hiệu của chúng chỉ xác định thông qua phản 
ứng giới hạn được phân tích in vitro. Quá trình nghiên cứu 
này cũng dẫn đến sự hiểu biết về vài qui tắc trong tương tác 
acid amin và nucleotid cuả riêng họ MmeI này. Trên cơ sở 
đó, enzym khác có tính đặc hiệu mới được tạo ra thành công.
Hình 5: Băng cắt ADN chuẩn lambda với MmeI và NmeIII nguyên vẹn hay thay đổi. 
A: Kết quả gel agarose. B kết quả lý thuyết.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. Loenen W.A.M., Dryden D.T.F., Raleigh E.A. và cộng sự. (2014). Highlights of the DNA cutters: a short history of the 
restriction enzymes. Nucleic Acids Res, 42(1), 3–19.
2. Roberts R.J (2005). How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A, 
102(17), 5905–5908.
3. Lê Thị Kim Tuyến và Vũ Hồng Nga (1997). Phát hiện và xác định một enzym giới hạn mới BciV I, tách từ Bacillus 
circulans. Tạp chí học Dự phòng, VII(4(34).
4. Lê Thị Kim Tuyến và Vũ Thị Kim Liên (1997). Sml I, một enzym giới hạn mới tách chiết từ chủng Stenotrophomonas 
maltophilia. Tạp chí học Dự phòng, VII(4 (34), 11–16.
5. Wilson G.G (1991). Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res, 19(10), 2539–2566.
6. Pingoud A, Wilson G.G, và Wende W (2014). Type II restriction endonucleasesa historical perspective and more. 
Nucleic Acids Res, 42(12), 7489–7527.
7. Morgan R.D, Dwinell E.A, Bhatia T.K và cộng sự (2009). The MmeI family: type II restriction–modification enzymes 
that employ single-strand modification for host protection. Nucleic Acids Res, 37(15), 5208–5221.
8. Morgan R.D và Luyten Y.A (2009). Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage 
specificity. Nucleic Acids Res, 37(15), 5222–5233.
9. Tuyến L.T.K, Hòa B.K, Thành V.N và cộng sự (2015). Biểu hiện và xác định enzyme giới hạn họ Mme tìm in silico. 
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(3), 831–836.