Giáo trình Công nghệ tế bào thực vật (Phần 1)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 
TRƯỜNG CAO ĐẲNG NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BẮC BỘ 
****. 
GIÁO TRÌNH 
CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 
HÀ NỘI 2012 
Chƣơng 1. KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 
1.1. Giới thiệu chung 
Công nghệ tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của công 
nghệ sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh 
vực công nghệ sinh học nông nghiệp. Hiện nay, từ những thành tựu của công nghệ 
sinh học trong nuôi cấy mô tế bào, nuôi cấy hạt phấn và có thể ứng dụng rất nhiều vào 
lĩnh vực trồng trọt, nhƣ: 
- Nhân nhanh vô tính các giống cây quý: từ một mẫu nuôi cấy ngƣời ta có thể tạo ra 
hàng triệu cây con nhƣ nhau nếu đủ thời gian cấy chuyển. Tuy nhiên, hệ số cấy 
chuyển phụ thuộc tuỳ giống, càng cấy chuyển nhiều lần càng tạo nhiều biến dị. Ví dụ, 
các nhà khoa học đã kết luận từ một chồi dứa đƣa vào nuôi cấy trong ống nghiệm có 
thể nhân ra hàng triệu cây dứa giống; từ một chồi chuối đƣa vào nuôi cấy có thể nhân 
ra 2.000 cây chuối giống, nếu qua số này sẽ có tỷ lệ biến dị cao. 
- Cải lƣơng giống cây trồng bằng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (meristerm): để phục 
tráng những giống cây quý đã nhiễm virus ngƣời ta có thể nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 
để nhân nhanh. Qua một số lần nuôi cấy theo kiểu này sẽ tạo ra đƣợc những cây hoàn 
toàn sạch bệnh từ cây đã nhiễm virus. 
- Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy tế bào hạt phấn: Ngƣời ta đã ứng 
dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn để tạo những cây đơn bội từ bao phấn 
hoặc hạt phấn, sau đó lƣỡng bội hoá và tạo thành dòng đồng hợp tử. Kĩ thuật này đã 
thành công nhiều ở những cây họ cà. 
- Khắc phục lai xa bằng cách thụ phấn trong ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi: 
Nhờ nuôi cấy trong ống nghiệm đã khắc phục tính bất hợp giao tử trƣớc và sau khi thụ 
tinh đối với lai giữa các cây khác nhau khá xa về mặt di truyền. 
- Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô tế 
bào thực vật mà ngƣời ta đã tạo thành cây lai từ 2 giống khác nhau khá xa về mặt di 
truyền bằng cách dùng các enzim để hoà tan màng tế bào rồi cho các tế bào trần 
(không còn màng) vào nuôi cấy chung trong môi trƣờng nhân tạo và chúng phát triển 
thành khối mô sẹo (callus), từ đó chuyển khối callus này sang các môi trƣờng phân 
hoá chức năng tế bào và để nuôi cấy thành cây lai. 
Sơ lược lịch sử phát triển 
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dƣới kính hiển vi và đƣa ra 
khái niệm "tế bào - Cell". Anton Van Leuwen Hoek (1632-1723) thiết kế kính hiển vi 
khuyếch đại đƣợc 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn, tế bào tinh trùng trong 
tinh dịch ngƣời và động vật. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề 
xƣớng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào: 
+ Mọi cơ thể sống đƣợc cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào. 
+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất 
của sự sống. 
+ Tế bào chỉ đƣợc tạo ra từ tế bào tồn tại trƣớc đó. 
Năm 1875, Oscar Hertwig chứng minh bằng quan sát trên kính hiển vi rằng sự 
thụ thai là do sự hợp nhất của nhân tinh trùng và nhân trứng. Sau đó, Hermann P., 
Schneider F.A và Butschli O. đã mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào. Năm 
1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục. 
Từ một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ thể sống hoàn 
chỉnh. Khả năng này của tế bào thực vật đƣợc gọi là tính toàn năng. Năm 1902, 
Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhƣng không thành 
công. Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định đƣợc vai trò của IAA, 1 hoocmon thực 
vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trƣởng và phân chia tế 
bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi 
cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thƣợng tầng (cambium) ở cà rốt và 
thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trƣởng liên tục. Năm 1941, Overbeek và cs đã sử 
dụng nƣớc dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura. Năm 1955, Miller và cs 
đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan 
trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Đến năm 1957, Skoog và 
Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi 
trƣờng đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: 
nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hƣớng tạo chồi. 
Ngƣợc lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hƣớng 
tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và 
rễ, tạo cây hoàn chỉnh. 
Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng 
nhất trên cây và thƣờng không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trƣởng. Năm 1952, 
Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh 
sinh trƣởng. Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành phƣơng pháp loại 
trừ bệnh virus đƣợc dùng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng khác nhau. Năm 1952, 
Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Kỹ thuật vi ghép 
sau đó đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tƣơng tự 
virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng phƣơng pháp vô tính khác nhau, đặc biệt là 
tạo giống cây ăn quả sạch bệnh. Năm 1960, Morel đã thực hiện bƣớc ngoặt cách mạng 
trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng trong nhân nhanh các loại địa lan 
Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật. 
Năm 1960, Cocking lần đầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế bào và đã 
tạo ra số lƣợng lớn tế bào trần. Kỹ thuật này sau đó đã đƣợc hoàn thiện để tách nuôi tế 
bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau. Năm 1971, Takebe và cs đã tái sinh đƣợc cây từ 
tế bào trần mô thịt lá (mesophill cell) ở thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cs lần đầu tiên 
thực hiện lai tế bào sôma giữa các loài, tạo đƣợc cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài 
thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Năm 1978, Melchers và cs tạo đƣợc cây 
lai soma "Cà chua Thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. Đến nay, việc tái 
sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài 
thực vật. 
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo đƣợc cây 
đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura. Kỹ thuật này sau đó đã đƣợc nhiều 
tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội 
kép (2x), cố định ƣu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo 
giống thuần mang tính trạng ƣu thế lai). 
Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật 
quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs đã nuôi cấy tế bào 
thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20,000 lít. Năm 1978, Tabata và cs đã nuôi tế 
bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin. Họ đã chọn lọc đƣợc 
dòng tế bào cho sản lƣợng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985, 
Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở 
Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự 
nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong 
các bioreactor dung tích lớn đã đƣợc thƣơng mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất 
sinh dƣợc. 
Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biến trong nuôi cấy 
mô và tế bào với phổ biến dị và tần số biến dị cao, Larkin và Scowcroft đã đƣa ra 
thuật ngữ "biến dị dòng soma" (Somaclonal Variation) để chỉ các thay đổi di truyền 
tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro. Từ các dòng tế bào hoặc cây biến 
dị di truyền ổn định có thể nhân nhanh, tạo ra các dòng và giống đột biến có năng 
suất, hàm lƣợng hoạt chất hữu ích cao, kháng một số các điều kiện bất lợi nhƣ bệnh, 
mặn, hạn,. 
1.2. Học thuyết tế bào 
Năm 1662, Robert Hooke đã thiết kế kính hiển vi đơn giản đầu tiên và quan sát 
đƣợc cấu trúc của miếng bấc bần bao gồm nhiều hạt nhỏ, ông gọi các hạt nhỏ đó là tế 
bào (cells). Năm 1675, Anton Van Leeuwenhoek xác nhận cơ thể động vật cũng bao 
gồm các tế bào. Ông quan sát dƣới kính hiển vi thấy máu động vật có chứa các hồng 
cầu và ông gọi đó là các tế bào máu. Nhƣng mãi đến năm 1838, Matthias Jacob 
Schleiden (nhà thực vật học) và 1839, Theodor Schwann (nhà động vật học) mới 
chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Schleiden và Schwann khẳng định rằng: Mỗi 
cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn toàn độc lập, riêng rẽ và tách 
biệt, đó chính là tế bào. Có thể nói Schleiden và Schwann là hai ông tổ của học thuyết 
tế bào. Tuy nhiên, cả hai ông không phải là các tác giả đầu tiên phát biểu một nguyên 
tắc nào đó, mà chỉ là diễn đạt nguyên tắc ấy rõ ràng và hiển nhiên tới mức nó đƣợc 
phổ biến rộng rãi và cuối cùng đã đƣợc đa số các nhà sinh học thời ấy thừa nhận. 
1.2.1. Tính toàn năng của tế bào (cell totipotency). 
Haberlandt (1902) là ngƣời đầu tiên đề xƣớng ra phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 
thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi một tế bào bất 
kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một 
cá thể hoàn chỉnh.Nhƣ vậy mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ 
toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện 
thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Hơn 
50 năm sau, các nhà thực nghiệm về nuôi cấy mô và tế bào thực vật mới đạt đƣợc 
thành tựu chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Tính toàn 
thế của tế bào thực vật đã đƣợc từng bƣớc chứng minh. Nổi bật là các công trình: 
Miller và Skoog (1953) tạo đƣợc rễ từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc lá, Reinert và 
Steward (1958) đã tạo đƣợc phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong 
dung dịch, Cocking (1960) tách đƣợc tế bào trần và Takebe (1971) tái sinh đƣợc cây 
hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần của lá cây thuốc lá. Kỹ thuật tạo dòng (cloning) các 
tế bào đơn đƣợc phân lập trong điều kiện in vitro đã chứng minh một thực tế rằng các 
tế bào soma, dƣới các điều kiện thích hợp, có thể phân hóa để phát triển thành một cơ 
thể thực vật hoàn chỉnh. Sự phát triển của một cơ thể trƣởng thành từ tế bào đơn (hợp 
tử) là kết quả của sự hợp nhất sự phân chia và phân hóa tế bào. Để biểu hiện tính toàn 
thế, các tế bào phân hóa đầu tiên trải qua giai đoạn phản phân hóa (dedifferentiation) 
và sau đó là giai đoạn tái phân hóa (redifferentiation). Hiện tƣợng tế bào trƣởng thành 
trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra mô callus không phân hóa (undifferentiation) 
đƣợc gọi là phản phân hóa, trong khi khả năng để các tế bào phản phân hóa tạo thành 
cây hoàn chỉnh (whole plant) hoặc các cơ quan thực vật đƣợc gọi là tái phân hóa. Ở 
động vật, sự phân hóa là không thể đảo ngƣợc trở lại. Nhƣ vậy, sự phân hóa tế bào là 
kết quả cơ bản của sự phát triển ở những cơ thể bậc cao, nó thƣờng đƣợc gọi là 
cytodifferentiation. 
1.2.3. Thể bội và gen 
Gen quyết định các tính trạng ở thực vật. Có tính trạng tƣơng ứng với một gen 
nhƣng cũng có nhiều tính trạng liên quan đến nhiều gen, các tính trạng đó gọi là tính 
trạng đơn gen và tính trạng đa gen. 
Hai gen nằm trên một vị trí nhất định trên nhiễm sắc thể tƣơng đồng gọi là allen. Tuy 
cùng tham gia quyết định một tính trạng nhƣng mỗi allen qui định một đặc điểm riêng. 
Ví dụ màu hoa, một allen có thể mang thông tin di truyền cho hoa màu đỏ , allen kia 
cho hoa màu trắng.Trƣờng hợp này ta có cá thể dị hợp tử về tính trạng màu hoa, nếu 
cả 2 allen đều mang thông tin di truyền cho màu đỏ thì ta có cá thể đồng hợp tử. Đối 
với cá thể dị hợp tử, một allen có thể là allen trội, allen còn lại là allen lặn. Allen trội 
quyết định tính trạng. Có trƣờng hợp trội hoàn toàn và trội không hoàn toàn. Trội 
không hoàn toàn khi tổ hợp 2 allen sẽ cho tính trạng trung gian. 
Thể bội là danh từ chỉ số bộ nhiễm sắc thể có trong tế bào, mô, cá thể thực vật 
với qui định chung là ở các tế bào sinh sản có 1 bộ nhiễm sắc thể đƣợc gọi là thể đơn 
bội. Hợp tử, sản phẩm dung hợp của 2 giao tử đơn bội, có thể là nhị bội với số nhiễm 
sắc thể 2n. Tất cả các tế bào soma hình thành do sự phân chia hợp tử đều là nhị bội. 
Trên thực tế có thể tìm thấy cùng lúc nhiều mức bội thể khác nhau ở các mô khác 
nhau của cơ thể thực vật.(4n, 8n) Đólà hiện tƣợng đa bội hóa do nội giảm phân. 
Khoảng một nửa thực vật bật cao ở mức đa bội thể. Số nhiễm sắc thể cơ bản của loài 
là X ( là số đơn bội nhỏ nhất trong dãy đa bội), các cá thể có X nhiễm sắc thể đƣợc gọi 
là thể nhất bội để phân biệt với thể đơn bội. 
Ví dụ : cây lúa mì có 2n=42 . Trên thực tế nó là thể lục bội 6X, trong đó số nhiễm sắc 
thể cơ bản của loài là X=7. Thể đơn bội của cây lúa có n=3X=21 nhiễm sắc thể. 
1.2.4. Thể bào tử và thể giao tử 
Thể bào tử gồm có hợp tử và tất cả các tế bào sản sinh từ hợp tử kể cả hạt phấn 
trong túi phấn và noãn. Thể giao tử gồm có hạt phấn đã nảy mầm và tất cả các tế bào 
do nó sản sinh ra, bao gồm các giao tử. Khi 2 giao tử khác giống dung hợp, thể bào tử 
2n đƣợc tái lập. Ở thực vật bậc cao, thể giao tử thƣờng không quá 3 tế bào trong đó 2 
tế bào là các giao tử. 
Ở thực vật bậc cao, thể giao tử ( trong các trƣờng hợp đặc biệt, có thể phát triển 
thành bào tử đơn bội) chứa n nhiễm sắc thể. Thể bào tử đơn bội có thể ra hoa nhƣng 
các bào tử hình thành không có sức sống. Tạo thể bào tử đơn bội và những cây đơn 
bội kép là mục đích của nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. 
1.2.5. Sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính 
Sinh sản vô tính là hiện tƣợng 1 cơ thể tạo ra các cơ thể mới từ một phần cơ 
quan sinh dƣỡng của mình, không hề có sự tham của các yếu tố quy định giới tính, cơ 
thể con sinh ra hoàn toàn giống hệt cơ thể mẹ. Sinh sản vô tính có rất nhiều hình thức. 
Ở sinh vật đơn bào có phân đôi tế bào. Một số cơ thể đa bào bậc thấp thì một tế bào 
sinh dƣỡng phân chia tạo ra một nhánh mới và sau đó tách ra khỏi cơ thể chính nhƣ ở 
thủy tức chẳng hạn, cũng có thể một mẫu của cơ thể mẹ đứt ra rồi nó mọc ra một cơ 
thể khác kiểu nhƣ tảo lam. Một số khác thì có hẳn một loại tế bào sinh sản riêng 
nhƣng mà vẫn hoàn toàn không có tính chất giới tính gì cả mà chỉ là từ cơ thể mẹ tạo 
ra mà thôi. Đó chính là hiện tƣợng sinh sản vô tính bằng bào tử. Bào tử ở các cơ thể 
đơn bào có thể là khi môi trƣờng bất lợi thì chúng tự rút nƣớc ra khỏi tế bào, trở thành 
dạng tiềm sinh đợi thời cơ để sống lại. Ở sinh vật đa bào thì túi đựng các tế bào gọi là 
bào tử vô tính. Đến mùa sinh sản chúng sẽ phát tán các tế bào đó ra môi trƣờng xung 
quanh. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi bào tử tạo ra một cơ thể mới. Ở thực vật thì 
khác, nó tồn tại cả hai kiểu sinh sản vô tính và hữu tính. Sinh sản vô tính ở đây cũng là 
từ một phần của cơ thể mẹ tách ra và tạo ra một cơ thể mới. 
Sinh sản hữu tính phải có sự tham gia của các yếu tố quy định giới tính, bao 
gồm đực và cái. Cá ... ler E. cs, 1990). 
4.6.4. Biến dị tế bào soma trong quá trình nuôi cấy phôi ở ngô và khả năng ứng 
dụng thực tiễn: 
Quan sát cây con nhận đƣợc từ mô sẹo phôi non và thế hệ con cái cho thấy phổ 
biến dị di truyền rất rộng. Green C. E. cs (1977) lần đầu tiên mô tả các cây nhận đƣợc 
từ mô sẹo phôi hoá (embryogenic callus) ở ngô với nhiều biến dị đặc điểm hình thái 
(thân, lá) và độ hữu thụ. Phân tích tế bào cho thấy có một cây khảm đa bội với nhiễm 
sắc thể số 5 trong tế bào đƣợc nhân lên nhiều lần và một cây có đoạn tứ bội. Tiếp theo 
các công trình nghiên cứu đầu tiên này, một loạt các công bố khác đã khẳng định tần 
số biến dị cao xảy ra với các tính trạng hình thái và nông học quan trọng nhƣ cao cây, 
độ dài bắp, số hàng trên bắp, độ chín sớm (Nesticky M. cs 1984; Glaser V.P,1984; 
Glaser V.P,1984). Một số dòng ngô mới có nhiều ƣu việt so với giống ban đầu đã 
nhận đƣợc từ cây tái sinh. Một vài giống lai tạo ra với sự tham gia của các dòng mới 
này có năng suất cao hơn nhiều so với giống lai đối chứng (Earle E.D. và Gracen V. 
E, 1985; Gracen V.E. và Earle E. D,1985). Các nhà di truyền và chọn giống đặc biệt 
quan tâm tới các biến dị xảy ra trong nội bào quan (tế bào chất). Các polypeptid tham 
gia vào quá trình hô hấp, quang hợp, tổng hợp ATP đƣợc mã hoá bởi các gen ty thể và 
lục lạp. Các tính trạng khác nhƣ bất dục đực tế bào chất, khả năng chống chịu các chất 
kháng sinh và độc tố cũng do ADN nội bào quan, trong đó có ADN ty thể quy định 
(Cornu A. cs, 1981; Kool A. T. cs ,1986). Cornu (1981) cho biết khi nuôi cấy phôi 
non của các dòng ngô bất dục đực kiểu T đã nhận đƣợc cây hữu thụ và kháng độc tố 
nấm Drechslera maydis gây bệnh. Phân tích cho hay đã có những thay đổi cấu trúc ở 
ADN ty thể dẫn đến khôi phục khả năng hữu dục ở dòng bất dục. Quá trình khôi phục 
khả năng hữu thụ và khả năng chống chịu không phụ thuộc vào sự có hay không có 
độc tố gây bệnh của nấm Drechslera maydis trong môi trƣờng chọn lọc (Brettell cs 
1979; Brettell cs 1980). Những biến dị tế bào soma đã xảy ra trong nuôi cấy mô, mặc 
dù không có sự can thiệp của tác nhân gây đột biến và môi trƣờng chọn lọc (Brettall 
và Ingram, 1979). Tính trạng bất dục đực tế bào chất và cảm ứng với độc tố T có thể 
xảy ra do một thay đổi di truyền độc nhất trong tế bào chất và thay đổi này có thể 
đƣợc phục hồi lại với tần số cao. Vậy có thể tạo ra các dòng bất dục đực kiểu T chống 
chịu độc tố gây bệnh T bằng nuôi cấy mô hay không? Kết quả lai tạo cho thấy sự khôi 
phục khả năng hữu thụ của các dòng bất thụ đực tế bào chất in vitro là do những thay 
đổi trong tế bào chất (Gracen V. E. và Earle E. D., 1985). Sự phục hồi liên quan đến 
sự mất ADN tƣơng tự nhƣ plasmid S1 và S1 ở ty thể (Escorte cs,1985). Sự biến mất 
của các plasmid tự do S1 và S2 trong ty thể có thể do chúng lại gắn vào ADN ty thể. 
Quá trình hồi phục quan sát thấy trong nuôi cấy phôi non ở ngô đã mở ra mô hình mới 
cho việc nghiên cứu cơ chế phân tử của hiện tƣợng bất dục đực tế bào chất. Một thay 
đổi lý thú khác là sự chuyển ngƣợc lại từ hữu thụ thành bất thụ tế bào chất. Gracen và 
Earle (1985) thông báo đã nhận đƣợc một dạng bất dục đực kiểu C mới hoặc một loại 
bất dục đực tế bào chất hoàn toàn mới nhờ nuôi cấy mô phôi non. Phát hiện này mở ra 
triển vọng sử dụng nuôi cấy phôi non để tạo ra các dạng bất dục đực tế bào chất cho 
sản xuất hạt lai. 
4.6.5. Biến dị ở các cây nhân vô tính: 
Những thay đổi di truyền ở gen nhân, lục lạp, ty thể xảy ra trên cây tạo ra các 
cây khảm di truyền. Bằng phƣơng pháp nhân vô tính có thể tạo các dòng vô tính đột 
biến từ các bộ phận khác nhau trên các cây đột biến khác nhau. 
Bảng 4.3. Sự khác nhau về biến dị di truyền ở các cây sinh sản vô tính và hữu tính 
Cây sinh sản vô tính Cây sinh sản hữu tính 
Bảo tồn đa dạng về số lƣợng nhiễm sắc 
thể - các mức lệch bội và tam bội khác 
nhau. Ví dụ, các giống mía có số lƣợng 
NST rất khác nhau, dao động từ 40, 48, 
55,64, 72,77, 78, 80, 96... đến 130NST 
Bảo tồn và di truyền số nhiễm sắc thể là 
chẵn (quá trình meios không bị phá vỡ) 
Có thể tách đƣợc các dạng đột biến từ mô 
và tế bào sinh dƣỡng - tế bào sôma (Thân, 
củ, rễ, chồi,mắt ghép...), ví dụ các giống 
đa bội hoá hoặc các giống bất dục đực 
không hạt thu nhận đƣợc từ các đột biến 
tự nhiên ở mắt ghép cam chanh. 
Chỉ các đột biến xảy ra trong giao tử mới 
di truyền đƣợc 
Trong điều kiện in vitro , có thể tách ra 
các tế bào đơn riêng biệt, cụm tế bào, mô 
và cơ quan có đột biến →? tái sinh chúng 
thành cây đột biến hoàn chỉnh - Nhân tiếp 
bằng phƣơng pháp vô tính →? Tạo dòng 
vô tính đột biến 
Trong điều kiện in vitro , có thể tách ra 
các tế bào đơn riêng biệt, cụm tế bào, mô 
và cơ quan có đột biến →? Tái sinh chúng 
thành cây đột biến hoàn chỉnh - Nhân tiếp 
bằng phƣơng pháp vô tính →? Tạo dòng 
vô tính đột biến. 
4.6.6. Các hướng ứng dụng của hiện tượng biến dị tế bào sôma 
Nhƣ đã phân tích ở trên, việc gây tạo và chọn lọc các đột biến tế bào sôma xảy 
ra trong nuôi cấy in vitro có nhiều ứng dụng đa dạng: 
- Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với 
năng suất cao (xem công nghệ bioreactor) 
- Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý, ví dụ, các nhà khoa học 
ở Đài Loan đã chọn tạo đƣợc giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do nấm 
Fusarium gây ra. ở nƣớc ta, Viện Công nghệ sinh học đã tạo đƣợc giống lúa mới DR2 
có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phƣơng pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in 
vitro từ một giống lúa không có khả năng chống chịu. Giống này đã đƣợc công nhận 
là giống quốc gia. 
4.7. Qui trình tạo cây đơn bội 
4.7.1. Qui trình tạo cây đơn bội thuốc lá từ hạt phấn phân lập 
4.7.1.1. Cảm ứng 
a. Tạo cây đơn bội 
Nụ hoa đƣợc xử lý bằng ly tâm 2.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 5-
10oC sau khi cắt để 48 giờ ở 2-5oC. 
b. Tạo cây nhị bội 
Nụ hoa đƣợc ngâm trong dung dịch colchicine 0,04% và dimethyl sulfoxide (chất dẫn 
nạp) 2% trong thời gian 24 giờ ở 2-5oC và hút chân không. Sau đó rửa sạch dung dịch 
colchicine và xử lý lạnh tiếp 24 giờ. 
4.7.1.2. Nuôi bao phấn 
Bao phấn đƣợc tách từ nụ, nuôi 3 ngày trong môi trƣờng khoáng Halperin chứa đƣờng 
sucrose 2% và Fe-EDTA (5mL/L: Na2EDTA 754mg + FeSO4.7H2O 557 mg pha 
trong 100 mL nƣớc sôi), pH 5,8. Nuôi 50 bao phấn trong 5 mL môi trƣờng lỏng. 
4.7.1.3. Tách và nuôi hạt phấn 
Ép bao phấn bằng đũa thủy tinh, lọc hạt phấn bằng lƣới có mắt ( = 48 µm) và đƣa 
vào ống ly tâm vô trùng có bông ở đáy. Ly tâm 850 vòng/phút và rửa hai lần bằng môi 
trƣờng mới. Nuôi hạt phấn với nồng độ 104 hạt phấn/mL, mỗi đĩa petri đƣờng kính 5 
cm nuôi 2,5 mL dung dịch, dán giấy parafilm và để ở nơi có ánh sáng nhạt. Sau 30 
ngày sẽ xuất hiện phôi non. 
4.7.2. Nuôi cấy hạt phấn lúa 
4.7.2.1.Phương pháp 
a. Thiết kế thí nghiệm: 
Trong thí nghiệm có thể dùng các dòng lúa có kiểu di truyền khác nhau, nuôi cấy túi 
phấn của các loái lúa khác nhau, khảo sát tần suất tạo mô sẹo và tái sinh. Nuôi cấy 
trên đĩa petri là chủ yếu và mối đĩa petri là mỗi lần lặp lại, có ít nhất 4 lần lặp lại. 
b. Xử lý vật liệu: 
Các giống lúa đƣợc trồng trên vƣờn ƣơm. Thu hạt của các giống trên. Các dòng lúa 
này đƣợc trồng trong chậu và đƣợc đặt trong vƣờn ƣơm. Túi phấn đƣợc thu nhận vào 
ngày thứ 60 hoặc 90 sau trồng. Các dòng lúa đƣợc gieo trồng cách khoảng nhau 1 tuần 
và tiến hành trong 5 lần để tránh các giống có thời gian chín khác nhau. Mỗi dòng cần 
1-2 tép có mang tƣợc hoa thụ phấn ở giai đoạn chín. 
c. Quy trình 
- Thu thập và xử lý vật liệu (túi phấn) 
• Giai đoạn chín của cây lúa ở ngay thời điểm thích hợp cho nuôi cấy túi phấn là 
giai đoạn phân tử có nhân phân chiađồng nhất trƣớc khi hạt phấn đi vào quá trình 
phân chia giảm nhiễm. Mẫu đƣợc lấy là đoạn thân giữa lá cờ và lá đòng (2-5 cm). 
Đoạn thân đƣợc đặt trong bao nylon và dán kín lại và giữ trong lạnh trong suốt thời 
gian thu thập mẫu và vận chuyển. 
Hình 4.1 Nuôi cấy bao phấn lúa 
. Xử lý lạnh túi phấn trƣớc khi đƣa vào nuôi cấy để tăng hiệu suất tạo mô sẹo. 
Trƣớc khi xử lý, bẹ lá đƣợc tách rời khỏi thân tránh gây thƣơng tổn hay dập đoạn thân. 
• Đoạn thân đƣợc giữ trong túi nylon và dán kín lại cùng ghi chú cẩn thận. Túi 
nylon đƣợc đặt trong bao giấy nhôm và đặt trong tối để tiến hành xử lý lạnh với ánh 
sáng giảm hẳn. Đoạn thân xử lý ở 5oC trong 5-7 ngày trƣớc khi nuôi cấy túi phấn. 
- Sự hình thành mô sẹo và tái sinh 
• Sau khi xử lý lạnh đoạn thân có chứa túi phấn, đoạn thân đƣợc khử trùng với 
Natrihypoclorit 2,5 % trong 20 phút. 
• Đoạn thân đƣợc lấy ra sau khi khử trùng và đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất vô 
trùng. 
• Chùm hoa lúa đƣợc tách ra khỏi thân và đƣợc đặt trên đĩa petri. 
• Dùng kéo đƣợc vô trùng cắt phần chân hoa lúa. 
• Dùng que inox vô trùng có đầu móc vô trùng để tách túi phấn bên trong hoa lúa 
ra. 
• Túi phấn đƣợc cấy trên môi trƣờng N6 tạo mô sẹo. Cấy khoảng 120 túi phấn 
trên 1 đĩa petri (100 x 15 mm). Mỗi giống cấy ít nhất 3 đĩa petri. Đĩa đƣợc ghi chú cẩn 
thận về ngày cấy, giống, môi trƣờng và ngƣời cấy. 
• Đĩa petri đƣợc dán kín bằng parafilon. Dán 2-3 lớp parafilon để tránh mất mát 
môi trƣờng. 
• Đĩa đƣợc đặt trong phòng dƣỡng cây ở 27oC. 
• Trong 2 tuần đầu tiên thì cứ cách 5 ngày ghi nhận số liệu về sự phát sinh mô 
sẹo. Khi mô sẹo phát triển đến đƣờng kính 2 mm thì tách mô sẹo và cấy trên môi 
trƣờng tái sinh MS. Túi phấn còn lại chƣa hình thành mô sẹo hay mô sẹo chƣa phát 
triển đến mức tối thiểu (D = 2 mm) còn lại trong đĩa petri đƣợc dán kín lại. Tiếp tục 
theo dõi trong 3 tháng. 
• Cấy 5-10 mấu mô sẹo trên 1 đĩa petri (100 x 15 mm) có chứa môi trƣờng tái 
sinh MS. Đĩa petri đƣợc dán kín và đặt trong phòng dƣỡng cây có cƣờng độ chiếu 
sáng 50-60 mol/m2/s ở 27oC có quang chu kỳ 16 giờ sáng và 8 giờ tối. 
• Cụm cấy tái sinh đƣợc tách rời tứng cây riêng biệt khi cây cao 1 cm và đƣợc 
cất trên môi trƣờng tái sinh MS. 
• Cây tái sinh đƣợc cấy chuyển sang chậu trong vƣờn ƣơm cây khi cây cao 5 cm, 
cây đƣợc đánh dấu. 
• Duy trì cây tái sinh trong chậu có lớp nƣớc mỏng phủ 1 mặt cho đến khi cây 
chín. 
• Khi cây lúa chín, thu hạt đặt trong bao giấy và đƣợc đặt trong 1 bao kín và làm 
khô ở 40oC với độ ẩm còn lại 12%. Thời gian làm khô 1-3 ngày. Hạt khô có thể tồn 
trữ nhiều năm ở -20oC. Nếu làm khô ở 50oC và kéo dài 5 ngày thì sẽ làm mất khả 
năng nảy mầm của hạt. 
d. Quan sát và đo đếm 
- Sự hình thành mô sẹo 
Sau 2 tuần nuôi cấy, theo dõi sự hình thành mô sẹo cách khoảng 5 ngày ghi ngày phát 
sinh mô sẹo và số lƣợng mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh trên mỗi 
giống trong vòng 90 ngày nuôi cấy. Xác định tổng số túi phấn đƣợc nuôi cấy hình 
thành mô sẹo trên mỗi giống ở thời điểm 30, 60 và 90 ngày nuôi cấy. Xác định sự 
hình thành mô sẹo bằng tỉ lệ túi phấn nuôi cấy phát sinh mô sẹo và phân tích ANOVA 
để đánh giá: 
1. Tổng số lƣợng mô sẹo hình thành của các loài 
2. Sự hình thành mô sẹo ở giai đoạn 30, 60 và 90 ngày sau cấy 
Phân tích sự khác nhau giữa các giống và các loài phụ, 
Hình 4.2 Mô sẹo từ bao phấn lúa 
- Tái sinh 
Kiểm tra việc nuôi cấy mô sẹo hàng tuần. Ghi nhận ngày cấy và số lƣợng mô sẹo tái 
sinh thành cây trong 8 tuần, ghi nhận cây có lá xanh hay cây bạch tạng . Ghi nhận 
tổng số lƣợng mô sẹo của mỗi giống hình thành cây xanh hay cây bạch tạng ở các thời 
điểm 2, 4, 6 và 8 tuần sau khi cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh. Ghi nhận tỉ lệ tái 
sinh cây từ mô sẹo, thống kê số lƣợng mô sẹo tái sinh đƣợc trong 1 đĩa. Thống kê số 
cây xanh tái sinh và cây bạch tạng và tổng lƣợng cây tái sinh đƣợc ở thời điểm 2, 4, 6 
và 8 tuần sau cấy. Dùng ANOVA phân tích kết quả. Phân tích sự khác nhau và giống 
nhau giữa các giống và các loài phụ. 
4.7.3. Nuôi cấy bao phấn cây thuốc lá 
4.7.3.1. Nguyên liệu thực vật 
Sử dụng bao phấn của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) để nuôi cấy đơn bội. 
4.7.3.2. Môi trường nuôi cấy 
Bảng 4.4.Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy bao phấn thuốc lá 
Thành phần 
môi trƣờng 
Tạo cây 1n Tạo Callus 1n Tạo chồi 1n Tạo rễ 1n 
Nitsch đầy đủ 
(Nt1,+Nt2,Nt3, 
Nt4 và Nt5) 
 + + + 
Saccharose (%) 2 2 2 2 
Agar (%) 0.8 0.8 0.8 0.8 
IAA (mg/L) 0.1 - - 0.1 
2,4-D (mg/L) - 0.1 – 0.5 - - 
KIN (mg/L) 0.1 0.1 0.1 - 1 - 
BAP (mg/L) - - 0.1 - 1 - 
Chú ý 
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị trong ống nghiệm (làm thạch nghiêng). 
4.7.3.3. Nuôi cấy bao phấn 
Nụ thuốc lá hái ở giai đoạn cánh hoa sắp ló ra khỏi lá đài (nụ dài khoảng 10-15 mm) 
đƣợc khử trùng theo thứ tự: 2 phút trong cồn 70%, 5 phút trong dung dịch HgCl2 
0,05% và rửa bằng nƣớc cất vô trùng từ 4-5 lần. Trong điều kiện vô trùng, dùng 
forceps và dao mổ tách nụ lấy các bao phấn cấy vào ống nghiệm chứa môi trƣờng 
dinh dƣỡng đã chuẩn bị sẵn (Bảng 4.1, cột 2). Mỗi ống nghiệm cấy 5-10 bao phấn và 
đặt ở nhiệt độ 25- 27oC, chiếu sáng từ 10-12 giờ/ngày với cƣờng độ chiếu sáng 2000-
3000 lux. 
Sau 6-8 tuần nuôi, vỏ bao phấn sẽ nứt ra và xuất hiện các cây thuốc lá đơn bội, cấy 
chuyển những cây thuốc lá này sang những bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL 
của cùng một loại môi trƣờng để cây đơn bội phát triển. 
Chú ý: Các thí nghiệm nuôi cấy đơn bội chỉ thành công với điều kiện hạt phấn phải ở 
giai đoạn tứ tử hoặc đơn nhân, do đó thƣờng ngƣời ta phải làm tiêu bản hiển vi để 
quan sát sự phát triển của hạt phấn, chọn giai đoạn thích hợp rồi mới tiến hành nuôi 
cấy. 
4.7.3.4. Nhị bội hóa thông qua giai đoạn callus 
Thân của cây thuốc lá đơn bội nuôi cấy trong ống nghiệm đƣợc cắt thành từng đoạn 
dài 5 mm và cấy lên môi trƣờng tạo callus (Bảng 4.1, cột 3). Sau 7-10 ngày, từ đoạn 
thân cây thuốc lá 1n sẽ hình thành một khối callus nhỏ đƣợc gọi là callus sơ cấp. Tế 
bào callus sơ cấp thƣờng dễ tái sinh thành chồi khi gặp điều kiện thuận lợi. Các cây tái 
sinh từ tế bào callus nuôi cấy trên môi trƣờng ở bảng 4.1, cột 4 có độ biến động về số 
lƣợng nhiễm sắc thể rất lớn. 
- Phƣơng pháp kiểm tra nhiễm sắc thể 
Mảnh lá non (1-2 mm) hoặc đầu rễ (2 mm) đƣợc tách ra từ cây thuốc lá đơn bội nuôi 
cấy trong ống nghiệm, cố định bằng hỗn hợp cồn: acetic (3:1) trong 24 giờ. Mẫu đƣợc 
bảo quản ở cồn 70%, nhuộm nhiễm sắc thể bằng acetocarmin. Đếm số lƣợng nhiễm 
sắc thể dƣới kính hiển vi. 
Kết quả phân tích số lƣợng nhiễm sắc thể của các cây tái sinh từ quần thể tế bào callus 
đơn bội là không đồng nhất, cho thấy: cây 1n chiếm tỷ lệ khoảng 21,9 %, cây 2n 
khoảng 61,5 % và khoảng 11,5 % là những cây có mức bội thể cao hơn nhị bội. 
CÂU HỎI ÔN TẬP 
1. Nêu vấn đề đơn bội của thực vật 
2. Tóm tắt các phƣơng pháp tạo thể đơn bội in vivo 
3. Phân tích các nhân tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy bao phấn 
4. Chỉ ra những tồn tại trong nghiên cứu đơn bội 
5. Trình bày hiện tƣợng bạch tạng trong nuôi cấy đơn bội 
6. Vì sao nói thể đơn bội có vai trò rất lớn trong công tác tạo giống mới? 
7. Nêu các ứng dụng của kỹ thuật đơn bội trong tạo giống mới và dòng thuần ở ngô, 
lúa 
8. Vì sao trong quá trình nuôi cấy in vitro luôn xuất hiện các biến dị tế bào soma? 
9. So sánh sự khác nhau về biến dị di truyền ở các cây sinh sản vô tính và hữu tính 
10. Tóm tắt qui trình tạo cây đơn bội