Đánh giá kết quả tinh chế virus dại trên nuôi cấy tế bào

Tập 60 - Số 7-2020
Website: yhoccongdong.vn 143
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRUS DẠI TRÊN NUÔI CẤY 
TẾ BÀO 
Nguyễn Văn Chuyên1, Đỗ Tuấn Đạt2, Trần Quốc Thắng3 
TÓM TẮT
Vắc xin dại sống nuôi cấy trên tế bào Vero do nhóm 
nghiên cứu sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm cần được 
đưa vào tinh chế và đánh giá khả năng độc lực và hàm 
lượng AND tồn dư. Kết quả nghiên cứu đưa ra phương 
pháp siêu ly tâm trong gradient đường sucrose bằng rotor 
góc cố định đã cho kết quả tinh khiết vi rút dại cao đạt yêu 
cầu để pha chế thành bán thành phẩm vắc xin dại. Lượng 
tồn dư AND trong sản phẩm đã giảm di rõ rệt. Các loạt 
vắc xin nghiên cứu đều sẽ được đưa ra đánh giá về tính an 
toàn chung và chất gây sốt khi kiểm tra trên chuột và thỏ.
Từ khóa: Vaccine dại, tinh chế, hàm lượng AND 
tồn dư.
SUMMARY:
ASSESSMENT OF REFINED RABIES 
VIRUS IN CELLS CULTURE
Vero cell culture live rabies vaccine produced by 
the research team on a laboratory scale should be refined 
and assessed for virulence and residual DNA content. The 
results of the study suggesting that the supercentrifugation 
method in the sucrose gradient with a fixed angle rotor has 
resulted in a satisfactory purity of the rabies virus for the 
preparation of a semi-finished rabies vaccine. The amount 
of DNA residue in the product has decreased significantly. 
All research vaccines will be assessed for overall safety 
and fever when tested in mice and rabbits.
Keywords: Wild vaccine, purification, residual 
DNA content.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh dại vẫn là bệnh lây truyền từ động vật sang 
người quan trọng nhất ở nhiều quốc gia. Khả năng xuất 
hiện trạng thái mang mầm bệnh hoặc dạng bệnh dại không 
triệu chứng cần được đánh giá nghiêm túc. Bệnh dại ở hầu 
hết các quốc gia đã được kiểm soát thành công thông qua 
việc tiêm phòng hàng loạt cho chó, rất lâu trước khi công 
nhận bệnh dại ở dơi và các loài động vật hoang dã khác 
và sự sẵn có của các loại vắc xin hiện đại. Mặc dù dịch 
tễ học, virus học, lây truyền, bệnh lý, biểu hiện lâm sàng, 
chẩn đoán, điều trị và kiểm soát lây nhiễm bệnh dại đã 
được mô tả rộng rãi, nhưng tỷ lệ mắc bệnh ngày càng cao. 
Tuy nhiên, các chuyên gia đã công nhận trong nhiều thập 
kỷ rằng bệnh dại hoàn toàn có thể diệt trừ được ở tất cả các 
loài trừ dơi thông qua việc tiêm chủng hàng loạt có mục 
tiêu, và trở ngại chính để loại trừ bệnh dại [1].
Tại Việt Nam, bệnh dại lưu hành và lây lan nhiều 
năm nay, số người đi tiêm vaccine phòng dại lên đến gần 
nửa triệu người với tỷ lệ tiêm phòng xấp xỉ 500/100.000 
dân, cao nhất trên thế giới tốn phí hơn 300 tỷ đồng tiền 
vaccine hàng năm [2]. Cùng với sự gia tăng bệnh dại ở 
các nước châu Á, số bệnh nhân tử vong do dại ở Việt Nam 
cũng gia tăng trở lại năm 2009 là 68 trường hợp xẩy ra 
trên 18 tỉnh/thành phố và năm 2010 là 78 trường hợp tử 
vong ở 30 tỉnh/thành phố trên cả nước [3]. Nguyên nhân 
có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu 
là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều 
hạn chế. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng 
vắcxin, ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế 
bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào đắt 
tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin 
phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các 
vùng nông thôn, vùng sâu, vùng xa. 
Kể từ khi được phát triển cách đây hơn bốn thập kỷ, 
việc nuôi cấy tế bào đậm đặc, tinh khiết và vắc xin phòng 
bệnh dại dựa trên trứng phôi (gọi chung là CCEEV) đã 
được chứng minh là an toàn và hiệu quả trong việc ngăn 
ngừa bệnh dại. Các vắc xin này được dùng cho cả dự 
Ngày nhận bài: 22/09/2020 Ngày phản biện: 30/09/2020 Ngày duyệt đăng: 06/10/2020
1. Học viện Quân y
2. Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)
3. Viện Sức khỏe Cộng đồng
Tác giả chịu trách nhiệm: Đỗ Tuấn Đạt; Email: [email protected]
Tập 60 - Số 7-2020
Website: yhoccongdong.vn144
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
phòng trước và sau phơi nhiễm và đã được sử dụng cho 
hàng triệu người trên toàn thế giới. Việc sử dụng CCEEV 
ngay lập tức sau khi phơi nhiễm kết hợp với xử trí vết 
thương thích hợp và sử dụng đồng thời các globulin miễn 
dịch chống bệnh dại hầu như luôn luôn có hiệu quả trong 
việc ngăn ngừa bệnh dại, ngay cả sau khi tiếp xúc với 
nguy cơ cao [4].
Tinh chế kháng nguyên virút dại là một bước quan 
trọng trong quá trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế 
bào Vero. Vero là một dòng tế bào thường trực do vậy 
bên cạnh những lợi thế như virút dại thường phát triển tốt 
cho hiệu suất nuôi cấy cao hơn, dễ dàng nâng cao quy mô 
sản xuất và giá thành rẻ hơn so với sản xuất trên các dòng 
tế bào lưỡng bội và tế bào tiên phát thì một yêu cầu cần 
đặt ra đối với các vắcxin sản xuất trên dòng tế bào này là 
việc loại trừ các nguy cơ có liên quan đến mức độ tồn dư 
các thành phần ADN tế bào và protein huyết thanh của 
động vật. 
Số liệu của bài báo là một phần kết quả nghiên cứu 
của đề tài cấp Nhà nước: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học 
bệnh dại và dịch tễ học phân tử vi rút dại - đề xuất chủng 
vi rút dại để sản xuất vắc xin, Mã số: KC.10.41/16-20.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các phương pháp siêu ly tâm tinh chế vi rút dại được 
nghiên cứu bao gồm siêu ly tâm phân vùng trong gradient 
đường sucrose trên hệ thống rotor zonal hoặc rotor góc 
cố định. Phân đoạn có chứa kháng nguyên vi rút được 
xác định bằng thử nghiệm ELISA phát hiện glycoprotein 
của vi rút dại. Độ tinh khiết của bán thành phẩm sau tinh 
chế được đánh giá bằng thử nghiệm điện di trên gel SDS-
PAGE, đo hàm lượng protein ở bước sóng 280 nm và xác 
định hàm lượng ADN tế bào tồn dư bằng phương pháp 
lai điểm.
2.1. Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE
a. Nguyên lý
Điện di polyacrylamide với SDS (viết tắt là SDS - 
PAGE) là một kỹ thuật được sử dụng thường xuyên trong 
phòng thí nghiệm nhằm mục đích phân tách các protein, 
acid nucleic dựa trên khối lượng phân tử và tốc độ di 
chuyển khác nhau của chúng qua gel polyacrylamide, 
dưới tác dụng của điện trường một chiều.
b. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu: 
+SDS được thêm vào mẫu, làm nóng để phân tử của 
bán thành phẩm được duỗi thẳng hoàn toàn rồi đưa về 
nhiệt dộ phòng.
+Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ phòng, mỗi mẫu 
được dùng pipet hút vào giếng riêng trong gel, trước đó 
đã được nhúng vào đệm điện di trong thiết bị điện di.
- Điện di: Tiến hành điện di trong khoảng tầm 2 
giờ với điện áp 100v, 10-20 V trên mỗi cm chiều dài gel. 
Sử dụng các chất đệm khác nhau giữ các bậc thang pH 
trong gel.
- Nhuộm gel: 
+Gel được cố định trong dung dịch axit axetic băng 
50% ethanol 10% trong 1 giờ. Sau đó, dung dịch được 
thay đổi thành dung dịch mới.
+ Sau 1 đến 12 giờ Gel được chuyển thành dung 
dịch nhuộm (50% metanol, 10% axit axetic băng, 0,1% 
Coomassie Brilliant Blue) 
+ Đưa vào dung dịch làm mất màu 40% metanol, 
axit axetic băng 10%.
c. Kết quả:
Việc nhuộm protein trong gel tạo ra một mô hình 
dải có thể ghi lại được của các loại protein và acid nucleic 
khác nhau. Dựa vào hình ảnh trong gel hoặc có thể sử 
dụng phương pháp đo quang để đánh giá.
2.2. Phương pháp phát hiện ADN tế bào Vero tồn 
dư trong các sản phẩm của quy trình tinh chế vắcxin 
dại bằng phương pháp lai điểm
a. Nguyên lý
- ADN tế bào Vero tồn dư trong các sản phẩm của 
quá trình sản xuất vắcxin được phát hiện bằng cách tách 
chiết và lai với ADN dò đã đánh dấu bằng hóa chất phát 
quang. Các điểm lai ADN sẽ được hiển thị trên phim 
X-quang. Hàm lượng ADN tồn dư sẽ được xác định bằng 
cách so sánh về mặt hình ảnh giữa ADN mẫu thử và ADN 
thang chuẩn.
b. Tiến hành
Bước 1: Tách chiết ADN của tế bào Vero để tạo 
thang ADN chuẩn
+ Dùng Trysin tách tế bào từ chai nuôi cấy để tạo 
hỗn dịch tế bào Vero.
+ Ly tâm hỗn dịch tế bào Vero, loại nước nổi, thu 
cặn tế bào và rửa cặn bằng dung dịch TBS.
+ Tiếp tục ly tâm thu cặn tế bào và hòa cặn trong 
dung dịch PBS.
+ Tiến hành tách chiết ADN tế bào Vero bằng các bộ 
sinh phẩm tách chiết ADN.
+ Thu mẫu và bảo quản ở -200C
+ Sử dụng các enzyme giới hạn Pst 1, ecor 1 để cắt 
đoạn ADN tế bào Vero.
+ Tiến hành tinh sạch ADN của tế bào Vero bằng 
các bộ sinh phẩm tinh sạch AND
+ Thu mẫu và bảo quản ở -200C
Tập 60 - Số 7-2020
Website: yhoccongdong.vn 145
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
+ Đo hàm lượng ADN bằng máy đo mật độ quang ở 
bước sóng 260 nm
+ Pha loãng ADN theo các hàm lượng khác nhau 
(10ng, 1ng, 100 pg, 10 pg và 1 pg) để tạo thành thang 
ADN chuẩn.
Bước 2: Chế tạo ADN dò
- Pha loãng ADN của tế bào Vero để đạt được nồng 
độ theo yêu cầu
- Làm biến tính ADN và tiến hành phản ứng 
gắn biotin theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm neblot 
Phototope Kit.
- Ủ mẫu ở nhiệt độ 370C và bổ sung thêm các dung 
dịch EDTA 0.2M ph 8.0, nacl 3M, Glycogen và Ethanol.
- Tiếp ủ mẫu ở nhiệt độ -700C, sau đó ly tâm và rửa 
mẫu bằng Ethanol 70%. 
- Ly tâm loại bỏ nước nổi và để khô mẫu. Sau đó bổ 
sung dung dịch TE/0,1% SDS và bảo quản ở -200C.
Bước 3: Tách chiết ADN từ các sản phẩm của quy 
trình sản xuất vắcxin 
- Chia mẫu thử vào các tuýp, mỗi tuýp chứa 0,5 
ml mẫu.
- Thêm vào mỗi tuýp dung dịch SDS 10% và 
Proteinase-K 20mg/ml
- Ủ trong bể ủ ở nhiệt độ 450C.
- Thêm dung dịch Phenol: chloroform, trộn đều. Sau 
đó ly tâm hút lấy phần dung dịch nổi.
- Thêm dung dịch sodium acetate 3M, trộn đều. 
Thêm dung dịch ethanol bão hòa. Trộn đều và ủ ở -200C.
- Ly tâm loại nước nổi, sau đó tiếp tục rửa cặn bằng 
dung dịch ethanol 70%.
- Ly tâm loại nước nổi, để khô. Hòa lại cặn trong 
dung dịch đệm TE và bảo quản mẫu ở -200C.
Bước 4: Lai ADN dò với ADN của mẫu thử và 
mẫu chuẩn
Nhỏ mẫu ADN lên màng lai:
- Lắp màng lai vào hệ thống tạo điểm Bio-dot
- Làm biến tính và nhỏ ADN mẫu chuẩn và mẫu thử 
lên màng lai.
- Lắp và bật máy hút chân không để chạy hệ thống 
tạo điểm Bio-dot cho đến khi mẫu ADN tạo thành điểm 
khô bám trên màng lai.
- Tháo màng lai và cố định ADN bằng tia UV. Lai 
ADN dò với ADN mẫu:
- Ngâm màng trong dung dịch tiền lai và ủ ở nhiệt 
độ 42oc trong 4 giờ.
- Đổi dung dịch ngâm màng từ dung dịch tiền lại 
sang dung dịch lai đã được pha với ADN dò. Tiếp tục ủ 
màng ở 42oc qua đêm.
Rửa màng lai:
- Hút bỏ dung dịch lai.
- Rửa màng lai nhiều lần bằng dung dịch SSC có 
chứa 0.1% SDS
Bước 5: Phát hiện ADN lai
- Màng lai được xử lý theo hướng dẫn của bộ sinh 
phẩm phát hiện biotin - Phototope-Star Detection Kit.
- Ép màng lai vào phim hiện mẫu.
- Rửa phim.
c. Kết quả
Tính kết quả
- Dựa vào độ phát quang của mẫu thử so với mẫu 
ADN chuẩn để tính hàm lượng ADN tồn dư trong các 
mẫu thử.
Tiêu chuẩn chấp thuận
- Hàm lượng ADN tồn dư của tế bào có trong vắcxin 
thành phẩm phải dưới 10ng cho một liều tiêm.
3. Kết quả đánh giá
a. So sánh kết quả tinh chế bằng hai phương 
pháp siêu ly tâm
Tập 60 - Số 7-2020
Website: yhoccongdong.vn146
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
Hình 1. Kết quả siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal tinh chế virút dại
Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi tinh chế vi rút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân vùng
bằng rotor zonal
Theo Hình 1, sau khi siêu ly tâm bằng rotor zonal, 
một đỉnh hiệu giá vi rút cao tạo được ở các phân đoạn 
đường từ 29 đến 41. Các phân đoạn này có lượng protein 
tạp thấp và hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE 
(Hình 2) cho thấy mức độ tinh sạch của kháng nguyên vi 
rút thu được. Tuy nhiên, độ tập trung của phân đoạn vi rút 
tinh khiết không cao biểu hiện bằng hình ảnh đỉnh hiệu giá 
vi rút không phân tách rõ ràng, có nhiều đỉnh hiệu giá vi 
rút cao thấp khác nhau trong các phân đoạn đường và kết 
quả kiểm tra công hiệu trên chuột của sản phẩm sau tinh 
chế đạt thấp chỉ vào khoảng 10-20 IU/ml.
Tập 60 - Số 7-2020
Website: yhoccongdong.vn 147
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
Ngược lại, khi siêu ly tâm bằng rotor góc cố định, 
đỉnh hiệu giá vi rút rất tập trung chủ yếu ở các phân 
đoạn số 8-10 (Hình 2.7). Các phân đoạn này cũng cho 
hình ảnh vi rút tinh khiết khi điện di trên gel SDS-PAGE 
(Hình 2.8). Kết quả kiểm tra công hiệu trên chuột của các 
phân đoạn này đạt được tới trên dưới 50 IU/ml. Như vậy, 
phương pháp siêu ly tâm trong gradient đường sucrose 
bằng rotor góc cố định đã cho kết quả tinh khiết vi rút 
dại cao đạt yêu cầu để pha chế thành bán thành phẩm 
vắc xin dại.
b. Đánh giá hàm lượng ADN tế bào tồn dư bằng 
phương pháp lai điểm.
Hình 3. Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định tinh chế virút dại 
Hình 4. Hình ảnh điện di các phân đoạn sau khi tinh chế vi rút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân vùng 
bằng rotor góc cố định
Tập 60 - Số 7-2020
Website: yhoccongdong.vn148
JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE 2020
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, qua toàn bộ 
quá trình sản xuất vắc xin từ tinh sạch, bất hoạt đến tinh 
chế, hàm lượng ADN tế bào tồn dư đã giảm đi rõ ràng 
(Hình 5). Hình 5 so sánh hàm lượng ADN tế bào tồn dư 
trong sản phẩm đầu tiên của quá trình sản xuất vắc xin dại 
là mẫu của các mẻ gặt đơn và sản phẩm sau quá trình tinh 
chế. Hàm lượng ADN tồn dư của mẫu mẻ gặt đơn vi rút 
khoảng 2,5 ng/0,5 ml mẫu thử và của mẫu sau tinh chế là 
100 pg/0,5 ml mẫu. Nếu tính tương đương với một liều 
tiêm vắc xin thì hàm lượng ADN tồn dư đã giảm từ 125 
ng/liều xuống còn 50 pg/liều.
IV. KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp siêu ly 
tâm trong gradient đường sucrose bằng rotor góc cố định 
đã cho kết quả tinh khiết vi rút dại cao đạt yêu cầu để 
pha chế thành bán thành phẩm vắc xin dại. Lượng tồn dư 
AND trong sản phẩm đã giảm di rõ rệt. Các loạt vắc xin 
nghiên cứu đều sẽ được đưa ra đánh giá về tính an toàn 
chung và chất gây sốt khi kiểm tra trên chuột và thỏ.
Trong quy trình sản xuất vắc xin dại trên nuôi cấy 
tế bào Vero, các phương pháp tinh chế vi rút dại được sử 
dụng bao gồm siêu ly tâm và sắc ký. Các phương pháp 
này có thể tiến hành đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau. Từ 
phương pháp siêu ly tâm phân vùng (zonal centrifuge), 
siêu ly tâm liên tục (continuous-flow centrifuge), siêu ly 
tâm phân vùng trên hệ thống ly tâm bằng rotor góc cố định 
đến các phương pháp sắc ký bằng cột DEAE-Cellulose 
và cuối cùng là kết hợp cả siêu ly tâm và sắc ký đã cho 
thấy mức độ đa dạng của các phương pháp được ứng dụng 
trong quy trình tinh chế vi rút dại để sản xuất vắc xin. 
Nghiên cứu này đề cập đến các phương pháp tinh chế vi 
rút dại bằng siêu ly tâm, bao gồm siêu ly tâm phân vùng 
bằng rotor zona và siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc 
cố định. Phương pháp này tận dụng được các các lợi thế 
sẵn có của cơ sở sản xuất về hệ thống máy siêu ly tâm và 
các kinh nghiệm đã áp dụng thành công trong sản xuất các 
vắcxin virút khác như vắcxin viêm gan B và vắcxin viêm 
não Nhật Bản B. Đồng thời, đây cũng là một phương pháp 
tinh chế tương đối rẻ tiền hy vọng sẽ làm giảm giá thành 
của sản phẩm vắcxin trong tương lai.
Việc giảm thiểu lượng ADN tế bào tồn dư xuống đến 
mức đạt yêu cầu cho 1 liều vắc xin tiêm đã cho thấy hiệu 
quả loại trừ ADN tế bào của toàn bộ quá trình sản xuất 
vắc xin dại. Nhiều tác giả cho rằng, ngay từ những bước 
đầu tiên của quá trình sản xuất như bước tinh sạch vi rút 
bằng cách ly tâm và lọc đã giúp loại trừ một phần đáng kể 
AND[5]. Đặc biệt khi sử dụng β-propiolactone, bên cạnh 
tác dụng làm bất hoạt vi rút còn làm giảm thiểu hoạt tính 
sinh học của ADN [6]. Cuối cùng, chính quá trình tinh chế 
vi rút đã làm loại trừ một cách đáng kể lượng ADN tế bào 
tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắc xin 
dại trên nuôi cấy tế bào Vero.
Hình 5. Phương pháp lai điểm xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm
của quá trình sản xuất vắc xin dại
Tập 60 - Số 7-2020
Website: yhoccongdong.vn 149
VI
N
S
C K
H E
C NG
NG 
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chính phủ (2017), Quyết định số 193/QĐ-TTg phê duyệt “Chương trình Quốc gia khống chế và tiến tới loại 
trừ bệnh dại giai đoạn 2017-2021”.
2. Trần Như Dương và Phạm Cẩm Hà (2009),“Tình hình một số bệnh truyền nhiễm tại Việt Nam”, Tạp chí Y học 
dự phòng, số 4-103, tr.27-35.
3. Adedeji, Okonko, Eyarefe et al (2010), “An overview of rabies - History, epidemiology, control and possible 
elimination”, African Journal of Microbiology Research Vol. 4(22) pp. 2327-2338, 18 November, 2010.
4. WHO, WHO Expert Consultation on Rabies, second report, 982
5. WHO (2016), Guidelines on clinical evaluation of vaccines: regulatory expectations, Revision of WHO TRS 
924, Annex 1.
6. Pritom Chowdhury, Rashmee Topno, Siraj A. Khan (2015) “Comparison of β-Propiolactone and Formalin 
Inactivation on Antigenicity and Immune Response of West Nile Virus” Hindawi Publishing Corporation Advances in 
Virology Volume 2015, Article ID 616898, 5 pages,