Đánh giá hàm lượng ros (reactive oxygen species) trong tinh dịch và dịch huyền phù có tinh trùng sau lọc rửa ở bệnh nhân hiếm muộn

huỳNh Thị hồNg ViNh, Lê hoàNg aNh, hồ MạNh TườNg, phạM VăN phúC, phaN KiM NgọC, NguyễN TườNg aNhnghiên cứu 
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
60
ĐÁNH GIÁ HÀM LƯợNG ROS (REACtiVE OXYgEn SPECiES) 
TRONG TINH DỊCH VÀ DỊCH HUyỀN PHù CÓ TINH TRùNG 
SAU LỌC RỬA Ở BỆNH NHÂN HIẾM MUỘN
huỳnh Thị hồng Vinh(1), Lê hoàng anh(2), hồ Mạnh Tường(2), phạm Văn phúc(1), phan Kim Ngọc(1), Nguyễn Tường anh(1).
(1) Phòng thí nghiệm tế bào gốc, Đại Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia TPHCM.
(2) Trung tâm Nghiên cứu Di truyền & Sức khỏe Sinh sản (CGRH)– Khoa Y ĐHQG - TP.HCM
tóm tắt
mục tiêu: Thiết lập quy trình đo hàm lượng 
ROS trong tinh dịch và dịch huyền phù có tinh 
trùng sau lọc rửa ở bệnh nhân hiếm muộn và 
khảo sát mối quan hệ giữa hàm lượng ROS với 
các thông số tinh dịch đồ là mật độ và tỷ lệ di 
động tinh trùng.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 
Đo và đánh giá hàm lượng ROS trong tinh 
dịch và dịch huyền phù có tinh trùng của 112 
bệnh nhân điều trị hiếm muộn bằng phương 
pháp ICSI (tiêm tinh trùng vào bào tương 
noãn) tại Đơn vị Hỗ trợ sinh sản IVFAS, Bệnh 
viện An Sinh-TP.HCM bằng phương pháp đo 
huỳnh quang sử dụng đầu dò là luminol. 70 
mẫu bệnh nhân có các chỉ số tinh dịch bình 
thường-NS (mật độ ≥ 15x106 tinh trùng/ml, di 
động ≥ 40%) và 52 mẫu từ bệnh nhân có chỉ 
số tinh dịch bất thường-AS.
Kết quả: Hàm lượng ROS của mẫu dịch 
huyền phù có tinh trùng sau lọc rửa cao hơn 
hàm lượng ROS của mẫu tinh dịch ở cả hai 
nhóm bệnh nhân có chỉ số tinh dịch bình 
thường và bất thường. Hàm lượng ROS thấp 
nhất ở mẫu tinh dịch của nhóm bệnh nhân 
có chỉ số tinh dịch bình thường [0,08 (0,023, 
0,48), P<0,05]. Hàm lượng ROS cao nhất ở 
mẫu dịch huyền phù có tinh trùng sau lọc rửa 
của nhóm bệnh nhân có chỉ số tinh dịch bất 
thường [6,69 (0,15, 24), p<0,05)]. Hàm lượng 
ROS có mối quan hệ tương quan nghịch với 
mật độ tinh trùng (R=-0,123**, P<0,01) và 
độ di động tinh trùng (R=-0,166**, P<0,01). 
Hàm lượng ROS mẫu dịch huyền phù có tinh 
trùng sau lọc rửa có mối quan hệ tương quan 
thuận với hàm lượng ROS của mẫu tinh dịch 
(R=0,550**, P<0,01).
Kết luận: Lần đầu tiên ở Việt nam, chúng 
tôi kiểm định thành công qui trình đo hàm 
lượng ROS ở mẫu tinh dich. Nồng độ ROS có 
môi tương quan nghịch với các chỉ số cơ bản 
của tinh dịch đồ. Đây là một phương pháp 
đơn giản, rẻ tiền, dễ tiến hành, là công cụ 
hữu dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị 
vô sinh nam. 
từ khóa: ROS, chemiluminscence asay, neat 
semen, washed semen.
abStract
Objective: To establish the procedure of 
ROS measurement in washed and neat semen 
of infertile male and to study the relationship 
between ROS levels with semen parameters 
(sperm motility and concentration).
Method: Measurement and evaluation 
of ROS levels in semen and washed semen 
of 112 infertile patients treated by ICSI 
method (Intracytoplasmic Sperm Injection) 
in IVFAS, An Sinh Hospital-HCMC by luminol-
dependent chemiluminescence. 70 samples 
of patients have normal semen parameters-
NS (concentration ≥ 15x106 sperm/ml, 
motility≥ 40%) while the rest have abnormal 
semen analysis-AS.
Result: The ROS production in neat semen 
was lower than washed semen in both groups 
NS and AS. The lower level of ROS was observed 
in NS group [0,08 (0,023, 0,48), P<0,05], whereas 
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
61
infertile men with AS group had the highest 
ROS level [6,69 (0,15, 24), p<0,05)]. A strong 
negative correlation between ROS levels and 
concentration (R=-0,123**, P<0,01), motility 
(R=-0,166**, P<0,01) was noticed. However, 
there was a strong positive correlation between 
log ROS in neat semen and in washed semen 
(R=0,550**, P<0,01).
Conclusion: It was the first time in Viet 
Nam, we have succeeded in establishing the 
procedure of ROS measurement in semen. 
ROS levels have a strong negative correlation 
with semen parameters (sperm concentration 
and motility). Measurement of ROS in neat 
semen is an easy, simple, inexpensive, good 
diagnostic and prognostic value in male 
infertility assessment.
i. ĐẶt vấn Đề
Hiện nay, vấn đề vô sinh nam đang trở thành 
mối quan tâm lớn của ngành y tế nói riêng và 
của nhân loại nói chung. Theo thống kê của Bộ 
Y tế năm 2011, Việt Nam có khoảng 8% dân số 
ở độ tuổi sinh đẻ bị hiếm muộn. Trong đó, tỉ 
lệ vô sinh nam giới hiện ngang bằng tỉ lệ nữ, 
chiếm khoảng 40% [1]
Theo báo cáo tổng quan tại hội thảo quốc 
tế “Stress oxi hóa và khả năng sinh sản người” 
tổ chức tại Việt nam năm 2012, số lượng tinh 
trùng của nam giới trên thế giới đã giảm còn 
phân nửa so với 50 năm trước; đồng thời, số 
liệu từ các báo cáo trong nước cũng cho thấy tỉ 
lệ bất thường tinh dịch đồ cao ở những cặp vợ 
chồng hiếm muộn [2].
Nhiều nguyên nhân dẫn đến việc vô sinh 
nam giới như bất thường tinh dịch, giãn tĩnh 
mạch tinh hoàn, tinh trùng dị dạng, di động 
kém, không có tinh trùng do tắc nghẽn, chấn 
thương, dị tật bẩm sinh, Một nguyên nhân 
khác mà trên thế giới đã và đang tìm hiểu 
đó là sự tác động của ROS (Reactive Oxygen 
Species-gốc oxy hóa tự do hoạt động có 
nguồn gốc từ oxy). 
Trong quá trình xuất tinh ở nam giới, ROS 
được sinh ra từ tinh trùng chưa trưởng thành 
và bạch cầu. Trong sinh lý bình thường, với 
một lượng nhỏ ROS cần thiết cho phản ứng 
hoạt hóa thể đỉnh và sự dung hợp của tinh 
trùng và trứng. Nhưng khi mất đi sự cân bằng 
giữa các gốc oxy hóa tự do và các chất kháng 
oxy hóa, gây ra hiện tượng sản xuất quá 
mức ROS gọi là stress oxy hóa (OS-oxydative 
stress), ROS thực sự gây độc cho tinh trùng 
dẫn tới sự peroxide chất béo, tạo sự phân 
mảnh ADN, giảm hoạt động, chức năng tinh 
trùng và dẫn tới vô sinh (Alvarez và cs, 1987, 
Huges và cs, 1996, Aitken và De luliis, 2010, 
Aitken và cs, 2010) [3, 4, 5]
Nhiều phương pháp đo hàm lượng ROS 
đã được giới thiệu (Sharma và Agarwal, 
1996; Oschsendorf, 1999) [6, 7]. Việc đo trực 
tiếp hàm lượng ROS rất khó thực hiện vì các 
gốc oxy hóa tự do không tồn tại ở trạng 
thái ổn định và thường sinh ra trong một 
thời gian ngắn. Các gốc tự do này phải được 
phát hiện trực tiếp bằng quang phổ cảm 
ứng điện từ (Electron paramagnic resonance 
spectroscopy).Tuy nhiên, để phát hiện được 
các gốc tồn tại trong một thời gian ngắn thì 
thử nghiệm phải được thực hiện ở nhiệt độ 
rất thấp, rất khó thực hiện (Oschsendorf, 
1999). Một phương pháp đo gián tiếp hàm 
lượng ROS được sử dụng phổ biến đó là 
phương pháp đo huỳnh quang, sử dụng đầu 
dò luminol hay lucigen. Luminol đo được 
mức độ oxy hóa cả nội bào và ngoại bào, 
trong khi đó lucigen chỉ đo được ở mức độ 
ngoại bào (Aitken và Buckingham, 1992) 
[8]. Phương pháp này đo được toàn bộ hàm 
lượng ROS trong điều kiện sinh lý học và dễ 
sử dụng. 
Năm 2007, Moein và cs., so sánh hàm lượng 
ROS ở tinh dịch của người đàn ông sinh sản 
bình thường và người đàn ông vô sinh. Kết 
quả, hàm lượng ROS ở người đàn ông sinh sản 
bình thường là 180,05 x104 RLU/phút/20x106 
Tạp Chí phụ sảN - 11(1), 60-67, 2013
nghiên cứu 
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
62
tinh trùng, các bệnh nhân vô sinh thì hàm 
lượng ROS trung bình là 1852,04 x104 RLU/
phút/20x106 tinh trùng. Như vậy, hàm lượng 
ROS ở bệnh nhân vô sinh gấp gần 10 lần so 
với người bình thường [9]. Kết quả này tương 
tự với tác giả Fingerova và cộng sự đã tìm ra 
vào năm 2009.
Tất cả các nghiên cứu trên chỉ dừng lại 
đo hàm lượng ở mẫu tinh dịch. Helena 
Fingerova và cs,. 2009 và Venkatesh và cs., 
2010 đã đo hàm lượng ROS ở mẫu tinh dịch 
và dịch huyền phù có tinh trùng qua lọc rửa. 
Kết quả, hàm lượng ROS ở mẫu tinh dịch 
thấp hơn so với mẫu dịch huyền phù có tinh 
trùng đã lọc rửa, hàm lượng ROS thấp nhất ở 
các mẫu có mật độ tinh trùng bình thường 
và hàm lượng ROS cao nhất ở các mẫu tinh 
trùng bất thường và có sự hiện diện của bạch 
cầu [10, 11]
Ở Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có một 
nghiên cứu nào về đo hàm lượng ROS và xây 
dựng quy trình đo ROS trong tinh dịch. Vì vậy, 
đề tài thực hiện nhằm xây dựng quy trình đo 
hàm lượng ROS trong tinh dịch và dịch huyền 
phù có tinh trùng sau lọc rửa ở bệnh nhân hiếm 
muộn và khảo sát mối tương quan giữa hàm 
lượng ROS với chỉ số tinh dịch đồ.
ii. ĐỐi tƯỢng và phƯơng phÁp 
nghiÊn cứu
Đây là một nghiên cứu xây dựng qui trình 
và so sánh. Sau khi xây dựng thành công qui 
trình đo ROS, chúng tôi tiến hành định lượng 
ROS trong tinh dịch và huyền phù tinh trùng 
sau lọc rửa ở các mẫu tinh trùng có tinh dịch đồ 
bình thường và bất thường. 
Mẫu có các chỉ số tinh dịch bình thường –
NS: mật độ ≥ 15x106 tinh trùng/ml, di động ≥ 
40%) và mẫu từ bệnh nhân có chỉ số tinh dịch 
bất thường –AS: dưới các chỉ số của nhóm bình 
thường. Mẫu được thu nhận từ các trường hợp 
thực hiện hỗ trợ sinh sản từ tháng 01/2012 đến 
tháng 12/2012. 
Các mẫu phải thỏa tiêu chuẩn nhận như trên 
và không có các tiêu chuẩn loại trừ (tinh dịch có 
độ nhớt cao, tổng tinh trùng trong mẫu <2x106 
tinh trùng/ml, hàm lượng bạch cầu <106/ml, 
mẫu tinh trùng trữ, mẫu tinh trùng thu nhận từ 
phẫu thuật).
các kỹ tHuật sử dụng tRong ngHiên cứu
Thu nhận mẫu 
Tinh dịch được thu nhận bởi quá trình thủ 
dâm (thời gian kiêng giao hợp là từ 2-7 ngày), 
hóa lỏng (370C, thời gian15-60 phút) [12].
Phương pháp chuẩn bị tinh trùng bằng 
phương pháp thang nồng độ không liên tục
Đặt môi trường thang nồng độ vào ống ly 
tâm: 1ml môi trường lọc (sil select) 45% ở trên 
và 1ml môi trường lọc (sil select) 90% ở dưới. 
Đặt 1ml tinh dịch lên lớp môi trường lọc và 
ly tâm 1500 vòng trong 10 phút. Loại bỏ dịch 
nổi, chuyển cặn lắng vào 2 ml môi trường rửa 
(Ferticult Flushing) và ly tâm 1500 vòng/5 phút. 
Rửa lần 2 như trên. Hút bỏ dịch nổi, cặn thu 
được cuối cùng sẽ được dùng để đánh giá mật 
độ, độ di động và được tiến hành đo ROS.
Đo hàm lượng RoS trong tinh dịch bằng 
phương pháp đo huỳnh quang[13]
Mẫu được đánh dấu bằng cách cho 200 µl 
tinh dịch đã hóa lỏng, 5µl luminol (5-amino-2,3, 
dihydro-1,4-phthalazinedione) đã được pha 
ở nồng độ 5mM trong dimethyl sulfoxide 
(DMSO). 5µl luminol 5mM trong DMSO được 
đánh dấu là mẫu đối chứng âm. 12,5µl H202 với 
5µl luminol được đánh dấu là mẫu đối chứng 
dương. Tất cả các mẫu được đo lập lại 3 lần và 
lấy giá trị trung bình. Hàm lượng ROS được đo 
bằng phương pháp phát quang hóa học sử 
dụng đầu dò luminol (Máy Beckman Coulter 
DTX880) trong vòng 15 phút. Giá trị được biểu 
diễn ở dạng 104 RLU/phút/20x106 tinh trùng.
Đo hàm lượng RoS trong dịch huyền phù 
có tinh trùng sau lọc rửa bằng phương pháp 
đo huỳnh quang[13]
Mẫu được đánh dấu bằng cách cho 200 µl 
huỳNh Thị hồNg ViNh, Lê hoàNg aNh, hồ MạNh TườNg, phạM VăN phúC, phaN KiM NgọC, NguyễN TườNg aNh
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
63
Tạp Chí phụ sảN - 11(1), 60-67, 2013
dịch huyền phù có tinh trùng vào 5µl luminol 
(5-amino-2,3, dihydro-1,4-phthalazinedione) 
đã được pha ở nồng độ 5mM trong dimethyl 
sulfoxide (DMSO). 5µl luminol 5mM trong 
DMSO vào 200µl PBS được đánh dấu 
là mẫu đối chứng âm. 12,5µl H202 với 
5µl luminol được đánh dấu là mẫu đối 
chứng dương. Tất cả các mẫu được đo 
lập lại 3 lần và lấy giá trị trung bình. 
Hàm lượng ROS được đo bằng phương 
pháp phát quang hóa học sử dụng đầu dò 
luminol (Máy Beckman Coulter DTX880) trong 
vòng 15 phút. Giá trị được biểu diễn ở dạng 104 
RLU/phút/20x106 tinh trùng.
Phân tích và diễn giải số liệu
Số liệu được thu thập và quản lý bằng phần 
mềm SPSS version 20 (IBM SPSS Statistics). Sử 
dụng test Compare means – One – way ANOVA 
để so sánh các số liệu giữa các nhóm nghiên cứu. 
Giá trị p < 0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê. 
các yếu tố ĐánH giá kết quả tHí ngHiệm
Hàm lượng ROS trong tinh dịch và huyền 
phù tinh trùng sau lọc rửa.
Chúng tôi sánh hàm lượng ROS giữa nhóm 
NS và AS. Đồng thời so sánh hàm lượng ROS 
trước và sau lọc rửa tinh trùng. 
iii. Kết QuẢ
Từ tháng 01/2012 đến tháng 12/2012, 112 
mẫu tinh trùng được lấy từ bệnh nhân điều trị 
hỗ trợ sinh sản IVFAS, Bệnh viện An Sinh. Trong 
đó 70 mẫu bệnh nhân có các chỉ số tinh dịch 
bình thường –NS (mật độ ≥ 15x106 tinh trùng/
ml, di động ≥ 40%) và 52 mẫu từ bệnh nhân có 
chỉ số tinh dịch bất thường –AS (không thuộc 
các tiêu chuẩn của nhóm bình thường). 
NHóM MậT Độ TINH TRùNG TRuNG BìNH (x106/ML)
DI ĐộNG
TRuNG BìNH (%)
Nhóm NS (70) 53,43 (15-140) 52,94 (40-72)
Nhóm AS (52) 15,46 (2-40) 32,54 (3-57)
NHóM NROS (10
4 RLu/
MIN/20.106 TINH TRùNG)
WROS (104 RLu/
MIN/20.106 TINH TRùNG)
Nhóm NS 0,08 (0,023-0,48) 0,68 (0,036-5,44)
Nhóm AS 0,43 (0,034-4) 6,69 (0,15-24)
Bảng 1: so sánh các thông số tinh dịch ở mẫu thí nghiệm
Bảng 2: so sánh hàm lượng ros ở mẫu tinh dịch và dịch huyền phù có tinh 
trùng sau lọc rửa
Thí nghiệm tiến hành lấy được 122 mẫu tinh 
trùng từ bệnh nhân điều trị vô sinh, trong đó 70 
mẫu bệnh nhân nhóm NS và 52 mẫu từ bệnh 
nhân AS.
(NROS: hàm lượng ROS ở mẫu tinh dịch, 
WROS: hàm lượng ROS dịch huyền phù có tinh 
trùng sau lọc rửa, P<0,05, có ý nghĩa thống kê).
hàm lượng RoS ở mẫu tinh dịch 
Hàm lượng ROS nhóm AS [0,43 (0,034; 4) 
x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng] cao hơn hàm 
lượng ROS nhóm NS [0,08 (0,023; 0,48)x104 RLU/
phút/20x106 tinh trùng]. Ở nhóm NS thì hàm 
lượng ROS nằm trong khoảng từ [(0,023;0,48)
x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng]. Nhóm AS thì 
hàm lượng ROS nằm trong khoảng [(0,034; 4)
x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng]. Giá trị trung 
bình của hàm lượng ROS ở nhóm AS cao gấp 5 
lần so với giá trị trung bình của hàm lượng ROS 
ở nhóm NS. 
hàm lượng RoS ở dịch huyền phù có tinh 
trùng sau lọc rửa
Hàm lượng ROS ở dịch huyền phù sau khi 
lọc rửa được đo sau khi loại bỏ tinh tương 
bằng quá trình ly tâm và được rửa sạch với môi 
trường cấy. Hàm lượng ROS ở dịch huyền phù 
có tinh trùng sau khi lọc rửa thì cao hơn so với 
hàm lượng ROS ở mẫu tinh dịch. 
Hàm lượng ROS ở dịch huyền phù có 
tinh trùng sau khi lọc rửa nhóm AS 
[6,69 (0,15; 24)x104 RLU/phút/20x106 
tinh trùng] cao hơn hàm lượng ROS 
nhóm NS [0,68 (0,036; 5,44)x104 RLU/
phút/20x106 tinh trùng]. Ở nhóm NS thì 
hàm lượng ROS nằm trong khoảng từ 
nghiên cứu 
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
64
[(0,036; 5,44)x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng]. 
Nhóm AS thì hàm lượng ROS nằm trong khoảng 
[(0,15;24)x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng]. Giá 
trị trung bình của hàm lượng ROS ở nhóm AS 
cao gấp 10 lần so với giá trị trung bình của hàm 
lượng ROS ở nhóm NS. 
So sánh hàm lượng RoS ở mẫu tinh dịch và 
dịch huyền phù có tinh trùng sau khi lọc rửa
Hàm lượng ROS của mẫu dịch huyền phù có 
tinh trùng sau lọc rửa cao hơn hàm lượng ROS 
của mẫu tinh dịch ở cả hai nhóm bệnh nhân có 
chỉ số tinh dịch bình thường và bất thường. Hàm 
lượng ROS thấp nhất ở mẫu tinh dịch của nhóm 
bệnh nhân có chỉ số tinh dịch bình thường [0,08 
(0,023; 0,48) x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng], 
P<0,05]. Hàm lượng ROS cao nhất ở mẫu dịch 
huyền phù có tinh trùng sau lọc rửa của nhóm 
bệnh nhân có chỉ số tinh dịch bất thường [6,69 
(0,15; 24) x104RLU/phút/20x1 ... độ tinh trùng trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
R=-0,166**, P<0,01 
R=-0,306**, P<0,01 
R=-0,123**, P<0,01 
R=-0,201**, P<0,01 
BÀN LUẬN 
Vào những năm đầu của thế kỉ 19 đã có có một số bài báo đầu tiên nói về vai trò 
của ROS trong vấn đề vô sinh nam [14, 15, 16]. Tầm quan trọng của ROS trong 
tinh dịch đã được nhấn mạnh trong tiêu chuẩn WHO (1999) và một số phương 
pháp đo hàm lượng ROS trong tinh dịch cũng đã được đưa ra [17, 18]. Tuy nhiên, 
những phương pháp đáng tin cậy và có thể được áp dụng trong việc đo hàm lượng 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
	
   Độ di động 
Hình 1: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và độ di 
động tinh trù tro g tinh dịch 
	
   Độ di động 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
Hình 2: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và độ di 
động tinh trùng trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa 
Hình 3: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và mật 
độ tinh trùng trong tinh dịch 
	
   Độ di động 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
Mật độ (x106tinh trùng/ml) Mật độ (x106tinh trùng/ml) 
Hình 4: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và mật 
độ tinh trùng trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
R=-0,166**, P<0,01 
R=-0,306**, P<0,01 
R=-0,123**, P<0,01 
R=-0,201**, P<0,01 
BÀN LUẬN 
Vào những năm đầu của thế kỉ 19 đã có có một số bài báo đầu tiên nói về vai trò 
của ROS trong vấn đề vô sinh nam [14, 15, 16]. Tầm quan trọng của ROS trong 
tinh dịch đã được nhấn mạnh trong tiêu chuẩn WHO (1999) và một số phương 
pháp đo hàm lượng ROS trong tinh dịch cũng đã được đưa ra [17, 18]. Tuy nhiên, 
những phương pháp đáng tin cậy và có thể được áp dụng trong việc đo hàm lượng 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
	
   Độ di động 
Hình 1: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và độ di 
động tinh trùng trong tinh dịch 
	
   Độ di động 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
Hình 2: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và độ di 
động tinh trùng trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa 
Hình 3: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và mật 
độ tinh trùng trong tinh dịch 
	
   Độ di động 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
Mật độ (x106tinh trùng/ml) Mật độ (x106tinh trùng/ml) 
Hình 4: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và mật 
độ tinh trùng trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
R=-0,166**, P<0,01 
R=-0,306**, P<0,01 
R=-0,123**, P<0,01 
R=-0,201**, P<0,01 
hàm lượng ros (rLu/phút/10
6 tinh trùng
hàm lượng ros (rLu/phút/10
6 tinh trùng
hàm lượng ros (rLu/phút/10
6 tinh trùng
Độ di động
Độ di động
Mật độ (x106tinh trùng/ml)
huỳNh Thị hồNg ViNh, Lê hoàNg aNh, hồ MạNh TườNg, phạM VăN phúC, phaN KiM NgọC, NguyễN TườNg aNh
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
65
Tạp Chí phụ sảN - 11(1), 60-67, 2013
Hình 4: Mối tương quan giữa hàm lượng ros và mật độ tinh trùng trong dịch huyền phù 
có tinh trùng sau lọc rửa
BÀN LUẬN 
Vào những năm đầu của thế kỉ 19 đã có có một số bài báo đầu tiên nói về vai trò 
của ROS trong vấn đề vô sinh nam [14, 15, 16]. Tầm quan trọng của ROS trong 
tinh dịch đã được nhấn mạnh trong tiêu chuẩn WHO (1999) và một số phương 
pháp đo hàm lượng ROS trong tinh dịch cũng đã được đưa ra [17, 18]. Tuy nhiên, 
những phương pháp đáng tin cậy và có thể được áp dụng trong việc đo hàm lượng 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
	
   Độ di động 
Hình 1: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và độ di 
động tinh trùng trong tinh dịch 
	
   Độ di động 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
Hình 2: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và độ di 
động tinh trùng trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa 
Hình 3: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và mật 
độ tinh trùng trong tinh dịch 
	
   Độ di động 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
Mật độ (x106tinh trùng/ml) Mật độ (x106tinh trù g/ml) 
Hình 4: Mối tương quan giữa hàm lượng ROS và mật 
độ tinh trùng trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa 
H
àm
 lượng R
O
S 
(R
LU
/phút/10
6 tinh trùng 
R=-0,166**, P<0,01 
R=-0,306**, P<0,01 
R=-0,123**, P<0,01 
R=-0,201**, P<0,01 
hàm lượng ros (rLu/phút/10
6 tinh trùng
Mật độ (x106tinh trùng/ml)
iv. bàn luận
Vào những năm đầu của thế kỉ 19 đã có 
có một số bài báo đầu tiên nói về vai trò của 
ROS trong vấn đề vô sinh nam [14, 15, 16]. Tầm 
quan trọng của ROS trong tinh dịch đã được 
nhấn mạnh trong tiêu chuẩn WHO (1999) và 
một số phương pháp đo hàm lượng ROS trong 
tinh dịch cũ g đã được đưa ra [17, 18]. Tuy 
nhiên, những phương pháp đáng tin cậy và 
có thể được áp dụng trong việc đo hàm lượng 
ROS trong phòng thí nghiệm vẫn còn thiếu. 
Một số phương pháp gián tiếp được xem là 
một công cụ hữu dụng trong việc chuẩn đoán 
vô sinh nam giới đó là việc sử dụng các chất 
kháng oxy hóa.
Việc đo được hàm lượng ROS trong tinh 
dịch chỉ thực hiện được khi trong tinh dịch có 
sự mất cân bằng giữa việc tạo ra các gốc oxy 
hóa tự do và các chất kháng oxy hóa. Đo trực 
tiếp các gốc oxy hóa thì rất không thể thực 
hiện. Phương pháp gián tiếp được sử dụng đó 
là sử dụng phản ứng phát sáng với chất trung 
gian là luminol hoặc lycigenin. Luminol được 
ưa dùng hơn lycigen vì luminol có thể đo được 
ROS nội bào và ngoại bào bao gồm các gốc 
H2O2, O2•−, OH•, ROO•.
Theo S.Venkatesh và cs., đo hàm lượng ROS 
ở mẫu tinh dịch phản ánh được trạng thái oxy 
hóa ban đầu của tinh dịch. Việc đo hàm lượng 
ROS trong dịch huyền phù có tinh trùng sau 
lọc rửa thì tốn nhiều thời gian bởi vì liên quan 
đến nhiều bước trong quá trình lọc rửa như quá 
trình loại bỏ tinh tương và ly tâm. Quá trình lọc 
rửa loại bỏ đi cả các chất chống lại sự oxy hóa 
trong tinh tương và quá trình ly tâm cũng làm 
tăng thêm quá trình sản sinh ROS. Vì vậy, việc 
loại bỏ tinh dịch trong quá trình chuẩn bị tinh 
trùng có thể làm cho tế bào này dễ bị nhạy 
cảm với các tác động gây oxy hóa. Hàm lượng 
ROS cao dẫn tới việc thất bại trong quá trình 
thụ thai bởi vì ROS làm giảm tính di động tinh 
trùng, thay đổi tính thấm của màng và độ lỏng 
tinh dịch, ảnh hưởng tới sự dung nạp của tinh 
trùng và trứng. 
Trong bài nghiên cứu này, ở nhóm AS, mật 
độ tinh trùng thấp và độ di động của tinh trùng 
trong tinh dịch yếu hơn so với nhóm NS. Kết 
quả hàm lượng ROS nhóm AS [0,43(0,034; 4)
x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng] cao hơn hàm 
lượng ROS nhóm NS [0,08 (0,023; 0,48)x104 RLU/
phút/20x106 tinh trùng]. Năm 2007, Moein và 
cs., (2007) so sánh hàm lượng ROS ở tinh dịch 
của người đàn ông sinh sản bình thường và 
người đàn ông vô sinh. Kết quả, hàm lượng 
ROS ở người đàn ông sinh sản bình thường là 
180,05x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng, các 
bệnh nhân vô sinh thì hàm lượng ROS trung 
bình là 1852,04x104 RLU/phút/20x106 tinh trùng. 
Như vậy, hàm lượng ROS ở bệnh nhân vô sinh 
cao gấp gần 10 lần so với người bình thường. 
Kết quả này tương tự với tác giả Fingerova và 
cs., đã tìm ra vào năm 2009. Điều này có thể giải 
thích do tinh trùng nhóm AS bị oxy hóa nhiều 
hơn nhóm NS. Tinh trùng rất dễ bị oxy hóa vì bản 
thân tinh trùng chứa đựng khả năng tạo ra ROS, 
màng tinh trùng chứa các chất béo không bão 
hòa với nồng độ cao, tinh trùng không có khả 
năng sửa chữa màng tế bào và lượng enzyme 
giúp giữ tế bào rất hạn chế.
Hàm lượng ROS của mẫu dịch huyền phù có 
tinh trùng sau lọc rửa cao hơn hàm lượng ROS 
của mẫu tinh dịch ở cả hai nhóm bệnh nhân 
nghiên cứu 
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
66
có chỉ số tinh dịch bình thường và bất thường. 
Allamameni và cs., 2005 đánh giá tinh dịch từ 
34 mẫu tinh dịch của những người tự nguyện 
và 44 mẫu bệnh nhân bất thường ở các thông 
số tinh dịch đồ. Hàm lượng ROS ở trong tinh 
dịch của người tự nguyện thấp hơn 5 lần so 
với hàm lượng ROS trong dịch huyền phù có 
tinh trùng sau lọc rửa. Hàm lượng ROS trong 
tinh dịch của mẫu bệnh nhân bất thường chỉ 
số tinh dịch đồ thì cao hơn mẫu của những 
người tự nguyện [19]. Một nghiên cứu khác của 
Athayde và cs., 2007 đã nghiên cứu trên 114 
mẫu ở người đàn ông bình thường ở Brazil tình 
nguyện phẩu thuật vô sinh bằng phẫu thuật 
cắt ống dẫn tinh và 47 đàn ông cận hữu sinh”. 
Ở mẫu không có bạch cầu, hàm lượng ROS ở 
mẫu đàn ông bình thường thì ở mức 0,55x104 
RLU/phút/20x106 tinh trùng, thấp hơn 20 lần so 
với hàm lượng ROS ở mẫu dịch huyền phù có 
tinh trùng sau lọc rửa [20]. Một nghiên cứu mới 
nhất của nhóm này đã đưa ra vùng giá trị của 
hàm lượng ROS trong tinh dịch của 78 người 
đàn ông phẫu thuật cắt ống dẫn tinh ở độ tuổi 
dưới 40 là 0,29 (0,18; 0,58)x104RLU/phút/20x106 
tinh trùng.
Bảng 3 biểu diễn hàm lượng ROS có mối 
quan hệ tương quan nghịch với mật độ tinh 
trùng (R= -0,123**, P<0,01) và độ di động tinh 
trùng (R=-0,166**, P<0,01). Độ di động của tinh 
trùng càng cao thì hàm lượng ROS càng thấp 
và ngược lại. Sự gia tăng ROS được cho là có 
liên quan đến giảm khả năng di động của tinh 
trùng (Agarwal và cs., 1994; Armstrong và cs., 
1999, Buamber và cs., 2001) [21, 22, 23]
Hiện nay trên thế giới chưa có một chuẩn 
nào để xác định hàm lượng ROS nằm ở giá trị 
nào là dương tính hay âm tính. Nhưng qua các 
nghiên cứu trên thì ta thấy hàm lượng ROS 
được tìm thấy có giá trị tương đương nhau cho 
dù mẫu được lấy từ các dân tộc khác nhau và 
đựơc đo bằng máy luminometer khác nhau.
Đo hàm lượng ROS bằng phương pháp đo 
huỳnh quang sử dụng đầu dò luminol trong 
tinh dịch đánh giá chính xác hàm lượng ROS 
hơn trong dịch huyền phù có tinh trùng sau lọc 
rửa. Đo hàm lượng ROS trong dịch huyền phù 
có tinh trùng sau lọc rửa chỉ thực hiện khi muốn 
đánh giá hàm lượng ROS với kết quả thụ tinh 
ống nghiệm. 
Phương pháp xác định hàm lượng ROS 
trong tinh dịch thì nhanh, đơn giản và có thể 
được sử dụng để đo hàm lượng ROS trong mẫu 
có ít tinh trùng.
v. Kết luận
Lần đầu tiên ở Việt nam, chúng tôi xây dựng 
thành công qui trình đo hàm lượng ROS ở mẫu 
tinh dich. Nồng độ ROS có mối tương quan 
nghịch với các chỉ số của tinh dịch đồ (độ di 
động và mật độ tinh trùng). Đây là một phương 
pháp đơn giản, rẻ tiền, dễ tiến hành, là công cụ 
hữu dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị vô 
sinh nam. 
Tài liệu Tham khảo
1.
song_1/suc-khoe-nam-gioi/tu-van-nam-khoa-
vo-sinh-nam-ki-1.html
2. Hồ Mạnh Tường. Tình hình nghiên cứu 
tại Việt Nam về sự liên quan giữa gốc tự do và 
chất lượng tinh trùng ở bệnh nhân vô sinh nam. 
Hội nghị Oxidative stress và tác động trên khả 
năng sinh sản người, TP HCM, 12/2012.
3. Ashok Agarwal Ph.D, Rakesh K. Sharma, 
Ph.D và cs,. Reactive oxygen species as an 
independent marker of male factor infertility. 
American Society for Reproductive Medicine, 
2006, Vol 86, No.4.
4. Eve de Lamirande, Hong Jiang, Armand 
Zini. Reactive oxygen species and Sperm 
physiology. Journals of Reproduction and 
Fertility.1997;2,48-54.
5. M Maneesh, H Jayalekshmi (2006). Role 
of reactive oxygen species and antioxidants on 
pathophysiology of male reproduction. Indian 
Journal of Clinical Biochemistry; 21(2): 80 – 89.
huỳNh Thị hồNg ViNh, Lê hoàNg aNh, hồ MạNh TườNg, phạM VăN phúC, phaN KiM NgọC, NguyễN TườNg aNh
Tập 11, số 01
Tháng 3-2013
Tạp chí Phụ Sản 
67
Tạp Chí phụ sảN - 11(1), 60-67, 2013
6. Ochsendorf, F.R. (1999). Infections in 
the male genitial tract and reactive oxygen 
species. Hum. Reprod .5, 399-420.
7. Sharma RK, Agarwal A. Role of reactive 
oxygen species in male infertility. Urology 
1996; 48:835-850.
8. Aitken RJ, Bucking D, West KM. 
Reactive oxygen species and human 
spermatozoa; Analysis of the cellular 
mechanisms involved in luminol-and 
lugicen-dependent chemiluminescence. J 
Cell phys.1992; 151:466-477.
9. Moein MR, Dehghani VO, Tabibnejad 
N, Vahidi S (2007). Reactive Oxygen Species 
(ROS) level in seminal plasma of infertile 
men and healthy donors. Iranian journal of 
Reproductive Medicine; 5(2): 51 – 55.
10. Fingerova H, Ivana Oborna, Jiri Novotny, 
Magda Svobodavo, Jana Breziovova, Lenkea 
Radova (2009). The measurement of reactive 
oxygen species in human neat semen and 
in suspended spermatozoa: a comparison. 
Biology and Endocrinology; 7: 118.
11. Venkatesh S, Shamsi MB, S. Dudeja, 
Kumar R, Dada R (2011). Reactive oxygen 
species measurement in neat and washed 
semen:comparative analysis and its 
significance in male infertility assessment, 
Arch Gynecol Obstet.
12. World Health Orgnization (2010). 
Laboratory Mannual for examination and 
processing of human semen. Fifth edition.
13. Cocuzza M, Athayde KS, Agarwal A, 
Sharma RK, Pagani R, Lucon AM, Srougi 
M, Hallak J. Age-related increase of reactive 
oxygen species in neat semen in healthy fertile 
men. Urology 2008, 71:491-494.
14. Aitken RJ, Clarkson JS, Fishel S. 
Generation of reactive oxygen species, lipid 
peroxidation, and human sperm function. Biol 
Reprod 1989, 41:183-197.
15. Griveau JF Le Lannou D. Reactive 
oxygen species and human spermtozoa, 
physiology and pathology. Int j Androl 
1997, 20:61-69.
16. Sharma RK, Agarwal A. Role of 
reactive oxygen species in male infertility. 
Urology 1996, 48:835-197.
17. Kobayashi H, Gil-Guzman E, Mahran 
AM, Sharma RK, Nelson DR, Thomas AJ 
Jr, Agarwal A. Quality control of reactive 
oxygen species measurement by luminol-
dependent chemiluminescence assay. J 
Androl 2001, 22:568-574.
18. Ochsendorf FR, Thiele J, Fuchs J, 
Schuttau H, Freisleben HJ, Buslau M, Milbradt 
R. Chemiluminescence in semen of infertile 
men. Andrologia 1994, 26:289-293.
19. Allamaneni SS, Agarwal A, Nallella 
KP, Sharma RK, Thomas AJ, Jr, Sikka SC. 
Characterization of oxidative stress status by 
evaluation of reactive oxygen species levels 
in whole semen and isolated spermatozoa. 
Fertil Steril. 2005;83:800–803. doi: 10.1016/j.
fertnstert.2004.05.106
20. Athayde KS, Cocuzza M, Agarwal 
A, Krajcir N, Lucon AM, Srougi M, Hallak 
J. Development of normal reference values 
for seminal Reactive Oxygen Species and 
their correlation with leukocytes and semen 
parameters in a fertile population. J Androl. 
2007;28:613–620. doi: 10.2164/jandrol.106.001966
21. Agarwal, A., Ikemoto, I.and Loughlin, 
K.R (1994). Effect of sperm washing on 
reactive oxygen species level in semen. 
Arch.Androl.33, 157-162.
22. Armstrong, J.S., Rajsekeran, M., 
C,hamulitrat, W., Gatti, P., Hellstrom, W.J and 
Sikka, S.C (1999). Characterization of reactive 
oxygen species induced effects on human 
spertozoa movement and energy metabolism. 
Free Radic.Biol. Med. 26, 869-880.
23. Buamber J, Ball BA, Gravance CG, 
Medina V, Davies-Morel MC. The effect of 
reactive oxygen species on equine sperm 
motility, viability, acrosomal integrity, 
mitochomdrial membrane potential and 
membrane lipid peroxidation. J Androl. 
2001;57:895-902.