Đa hình thái đơn nucleotide RS1049174 của gen NKG2D trên bệnh nhân u lympho

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
16 TCNCYH 126 (2) - 2020
Tác giả liên hệ: Nguyễn Hoàng Việt,
Trường Đại học Y Hà Nội
Email: [email protected]
Ngày nhận: 14/12/2019
Ngày được chấp nhận: 17/03/2020
ĐA HÌNH THÁI ĐƠN NUCLEOTIDE RS1049174 CỦA GEN 
NKG2D TRÊN BỆNH NHÂN U LYMPHO
Nguyễn Thị Hồng Minh¹, Vũ Thị Lan¹, Vũ Hồng Nhung²,
Nguyễn Tuấn Tùng³ và Nguyễn Hoàng Việt1,
1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN, 
3Trung tâm Huyết học và Truyền máu – Bệnh viện Bạch Mai.
NKG2D là một thụ thể quan trọng nhất trên bề mặt tế bào NK, đóng vai trò trong việc tiêu diệt tế bào nhiễm 
virus và ung thư nhờ sự tiếp hợp với những phối tử đặc hiệu trên bề mặt tế bào đích. Nghiên cứu trước đã chứng 
minh vai trò của đa hình đơn rs1049174 tại vị trí 3’UTR của gen NKG2D trong các dạng ung thư nhiễm HPV. 
Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định sự phân bố của đa hình đơn này trong nhóm u lympho so với đối tượng 
khỏe mạnh. 129 bệnh nhân mắc u lympho và 178 người khỏe mạnh được thu thập mẫu máu. Sử dụng kỹ thuật 
PCR – RFLP và Real – time PCR để phân tích sự biến đổi đa hình này. Dạng alen G so với alen C: OR = 0,67; 
95% CI: 0,48 – 0,93. Kiểu gen GG so với GC + CC: OR = 0,56; 95% CI: 0,34 – 0,94. Alen G và kiểu gen GG của 
SNP rs1049174 liên quan đến sự giảm nguy cơ u lympho nhưng không liên quan đến nguy cơ NHL và DLBCL.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 2018, có khoảng 590 nghìn ca u 
lympho mắc mới (chiếm 3,2% tổng các trường 
hợp ung thư). Trong đó tỷ lệ mới mắc u lympho 
không Hodgkin (NHL) cao gấp 6,4 lần u lympho 
Hodgkin (HL), là nguyên nhân thứ mười một 
gây tử vong do ung thư và là bệnh ung thư 
phổ biến thứ chín trên toàn thế giới.1 U lympho 
thường phổ biến hơn ở các nước phát triển và ít 
phổ biến hơn ở các nước đang phát triển. Tỷ lệ 
mắc bệnh u lympho nói chung ở các nước châu 
Á là tương đối thấp.2,3,4 U lympho Hodgkin đã 
được báo cáo là hiếm ở các nước châu Á.4 Tuy 
nhiên, tỷ lệ mắc u lympho không Hodgkin trên 
toàn thế giới đang tăng lên. Các nước Đông Á 
hiện nay cũng có tỷ lệ mắc ngày càng tăng.3 
Ở Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Ung 
thư toàn cầu GLOBOCAN năm 2018 có 4239 
ca mới mắc u lympho, 2476 người tử vong do 
bệnh này và con số này đang có xu hướng gia 
tăng. Nguyên nhân của u lympho bao gồm các 
tác nhân truyền nhiễm, suy giảm miễn dịch, 
bệnh tự miễn, yếu tố di truyền, tiếp xúc với một 
số hóa chất hữu cơ và dược phẩm.
Phân tử NKG2D là một protein xuyên màng 
typ II họ lectin, mang cả hai chức năng là thụ 
thể hoạt hoá của tế bào NK và đồng kích thích 
của tế bào T CD8+, được biểu hiện trên tế bào 
NK và tế bào γϭT cũng như tế bào T CD8+.5 
Liên kết của thụ thể NKG2D trên tế bào NK với 
phối tử của nó sẽ kích hoạt quá trình sản xuất 
các yếu tố gây độc qua trung gian tế bào và 
đồng thời kích thích sản xuất các cytokine dù 
cho tế bào đích có biểu hiện HLA lớp I bình 
thường hay không, từ đó tiêu diệt tế bào nhiễm 
vi rút và các khối u.6 Đa hình rs1049174 G > C 
nằm ở vùng 3′ không mã hóa (3′UTR) của gen 
NKG2D, các haplotype của nó có liên quan đến 
hoạt động cao của tế bào NK (HNK) hoặc hoạt 
động thấp (LNK). Kiểu hình HNK được thấy 
Từ khóa: U lympho, đa hình đơn rs1049174G, gen NKG2D
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
17TCNCYH 126 (2) - 2020
trong các cá thể mang alen rs1049174 G, trong 
khi đó LNK được thấy trong các cá thể mang 
alen C.7 Do đó, biểu hiện của NKG2D có thể có 
những tác động khác biệt trong sự nhạy cảm 
đối với các dạng ung thư dòng lympho.
Mục đích của nghiên cứu này là tìm hiểu 
mối liên quan giữa đa hình rs1049174 của gen 
NKG2D và nguy cơ mắc u lympho ở bệnh nhân 
Việt Nam.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu gồm 129 bệnh nhân 
đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn được chẩn đoán 
xác định giải phẫu bệnh là u lympho chung bao 
gồm u lympho Hodgkin và u lympho không 
Hodgkin (NHL) tại Viện Huyết học – Truyền 
máu Trung ương và Bệnh viện Bạch Mai. Trong 
đó có 112 bệnh nhân mắc NHL, trong số này 
lại có 42 bệnh nhân mắc u lympho dạng tế bào 
B lớn lan tỏa (DLBCL). Nhóm chứng gồm 178 
người khỏe mạnh không có các yếu tố nguy 
cơ mắc u lympho khác. Nhóm chứng được 
lựa chọn có sự tương đồng về tuổi và giới với 
nhóm bệnh. Nhóm chứng là những người khỏe 
mạnh tình nguyện tham gia nghiên cứu, được 
thu thập mẫu tại Khoa Kỹ thuật Y học – Trường 
Đại học Y Hà Nội. Loại trừ những người không 
đồng ý tham gia nghiên cứu.
2. Phương pháp
Nghiên cứu bệnh chứng chọn mẫu thuận 
tiện. Nghiên cứu này quan tâm đến tuổi, giới, 
kiểu gen, kiểu alen của đối tượng nghiên cứu, 
được tiến hành từ tháng 4/2019 đến tháng 
11/2019 ở Viện Huyết học – Truyền máu Trung 
ương và Trung tâm Huyết học – Truyền máu, 
Bệnh viện Bạch Mai.
Quy trình kỹ thuật bắt đầu từ thu thập 2ml 
máu ngoại vi của các đối tượng nghiên cứu 
vào ống chống đông EDTA. DNA tổng số được 
tách chiết từ 300 µl máu toàn phần theo kit của 
QIAGEN, sau đó xác định kiểu gen sử dụng 
kỹ thuật Real – time PCR Genotyping: Pha 
loãng DNA để được nồng độ khoảng 20 ng/µl. 
Thành phần phản ứng Real – time PCR (thể 
tích 10 µl) bao gồm: 5 µl Taqman Genotyping 
Master Mix (cung cấp bởi Thermoscientific, 
4371353); 0,5 µl 20x Probe primers (cung cấp 
bởi Thermoscientific, C_9345347_10); 4,5 
µl DNA đã pha loãng. Sau đó thực hiện phản 
ứng Real – time PCR trên máy QuantStudio3 
được cung cấp bởi Applied Biosystems với chu 
trình nhiệt bao gồm: 60ºC/30 giây, 95 ºC/10 
phút, [95ºC/15 giây, 60ºC/ 1 phút] x 40 chu kỳ 
và dừng phản ứng tại 60 ºC/30 giây. Phản ứng 
sử dụng 2 kênh tín hiệu là VIC/FAM tương ứng 
với 2 nucleotide C và G. Khi thu được chỉ tín 
hiệu VIC – kiểu gen tương ứng là CC, chỉ tín 
hiệu FAM - GG, cả 2 tín hiệu VIC/FAM – GC. 
Toàn bộ quá trình thực hiện và phân tích kết 
quả được giám sát bởi các kỹ thuật viên giàu 
kinh nghiệm trong phòng thí nghiệm.
Kỹ thuật PCR – RFLP (PCR – Restrict 
Fragment Length Polymophism) để kiểm tra, 
đối chứng với kết quả kiểu gen từ kỹ thuật 
Real – time PCR: Vùng gen rs1049174 của gen 
NKG2D được khuếch đại sử dụng cặp mồi đặc 
hiệu:
Mồi xuôi: 
5’ – TTAAGGCTGGAGAATAATGC – 3’ 
Mồi ngược:
5’ – TCAGTGAAGGAAGAGAAGG – 3’
Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10 µl) 
bao gồm: 0,5 µl mồi xuôi (10 pmol/µl), 0,5 µl mồi 
ngược (10 pmol/µl), 5 µl GoldTaq mastermix 
2X, 1 µl DNA, 3 µl DW. Chu trình nhiệt của phản 
ứng: [95ºC/30 giây, 57ºC/45 giây, 72ºC/45 giây] 
× 37 chu kỳ. Điện di trên gel agarose 1,5%, 
120V/25 phút. Xác định đa hình rs1049174 của 
gen NKG2D bằng kỹ thuật enzyme cắt giới hạn 
sử dụng enzyme Dde1. Phản ứng cắt được ủ 
ở 37oC/12 giờ, sau đó điện di trên gel agarose 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
18 TCNCYH 126 (2) - 2020
3% với điện thế 80V/60 phút và chụp ảnh bằng 
hệ thống máy BioRad. Enzyme cắt giới hạn đã 
cắt các đoạn gen đã được khuếch đại thành 
các đoạn DNA có kích thước: 230 bp, 191 bp, 
39 bp.
Xử lý số liệu sử dụng phần mềm GraphPad 
Prism v8. Kiểm định χ² để so sánh tỉ lệ giới,kiểu 
gen, alen của nhóm bệnh và nhóm chứng, 
student’s t-test để so sánh tuổi của các nhóm 
trên. Để ước tính mối liên quan giữa các kiểu 
gen, alen và khả năng mắc u lympho dùng tỉ 
suất OR với khoảng tin cậy 95%.
3. Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu này đã được chấp thuận bởi Hội 
đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học của 
Trường Đại học Y Hà Nội số 26/HMUIRB ngày 
01/07/2019.
III. KẾT QUẢ
Bảng 1. Đặc điểm chung của các nhóm đối tượng tham gia nghiên cứu
Nhóm bệnh (n = 129) Nhóm chứng (n = 178)
p
n % n %
Giới
Nam 82 63,57 112 62,92
0,91
Nữ 47 36,43 66 37,8
Tuổi 51,2 ± 16,0 49,8 ± 15,4 0,44
Kết quả cho thấy sự tương đồng về giới tính (p = 0,91) và tuổi (p = 0,44) giữa nhóm bệnh và 
nhóm chứng.
Hình 1. Điện di sản phẩm cắt bởi enzyme Dde I
M: Thang DNA chuẩn 100bp, B1 đến B9: Mẫu bệnh nhân u lympho, PC: chứng dương, NC: 
chứng âm. Mẫu B3, B6, B7, B8 có kiểu gen CC (đoạn DNA kích thước 230 bp). Mẫu B1, B2, B4 có 
kiểu gen GG (các đoạn DNA có kích thước 191 bp và 39 bp). Mẫu B5, B9 có kiểu gen GC (các đoạn 
DNA có kích thước 230 bp, 191 bp, 39 bp).
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
19TCNCYH 126 (2) - 2020
Hình 2. Kiểu gen của gen NKG2D tại vị trí rs1049174 ở nhóm bệnh nhân u lympho xác định 
bằng phương pháp Real – time PCR
Các mẫu nghiên cứu được thực hiện bởi phản ứng Real-time PCR. Kết quả những mẫu có kiểu 
gen đồng hợp GG được hiển thị bằng những điểm có màu đen , những mẫu có kiểu gen đồng hợp 
CC được biểu thị những điểm có màu ghi đậm, còn những mẫu có kiểu gen dị hợp GC được biểu 
diễn bởi những điểm màu ghi nhạt như trên hình.
Bảng 2. Phân bố kiểu gen và alen rs1049174 của đối tượng nghiên cứu
Nhóm 
bệnh
n
(%)
Nhóm 
NHL
n
(%)
Nhóm 
DLBCL
n
(%)
Nhóm 
chứng
n
(%)
Nhóm bệnh với 
nhóm chứng
Nhóm NHL với 
nhóm chứng
Nhóm DLBCL 
với nhóm 
chứng
p
OR
(95% 
CI)
p
OR
(95% 
CI)
p
OR
(95% 
CI)
GG
31
(24,03)
29
(25,89)
10
(23,81)
64
(35,96)
0,033
0,56
(0,34 – 
0,94)
0,09
0,62
(0,37 – 
1,04)
0,15
0,55
(0,27 
– 
1,19)
CC
36
(27,91)
27
(24,11)
12
(28,57)
36
(20,22)
0,13 0,47 0,29
GC
62
(48,06)
56
(50,00)
20
(47,62)
78
(43,82)
0,49 0,33 0,73
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
20 TCNCYH 126 (2) - 2020
Nhóm 
bệnh
n
(%)
Nhóm 
NHL
n
(%)
Nhóm 
DLBCL
n
(%)
Nhóm 
chứng
n
(%)
Nhóm bệnh với 
nhóm chứng
Nhóm NHL với 
nhóm chứng
Nhóm DLBCL 
với nhóm 
chứng
p
OR
(95% 
CI)
p
OR
(95% 
CI)
p
OR
(95% 
CI)
Alen
G
124
(48,06)
114
(50,89)
40
(47,62)
206
(57,87)
0,016
0,67
(0,48 – 
0,93)
0,10
0,75
(0,54 – 
1,06)
0,09
0,66
(0,41 
– 
1,07)C
134
(51,94)
110
(49,11)
44
(52,38)
150
(42,13)
NHL: u lympho không Hodgkin
DLBCL: u lympho dạng tế bào B lớn lan tỏa
Bảng 2 cho thấy so sánh nhóm u lympho với nhóm chứng, kiểu gen GG so với CC + GC có OR 
= 0,56; 95% CI: 0,34 – 0,94; alen G so với C có OR = 0,67; 95% CI: 0,48 – 0,93. So sánh nhóm NHL 
với nhóm chứng thì GG so với CC + GC có OR = 0,62; 95% CI: 0,37 – 1,04; G so với C có OR = 
0,75; 95% CI: 0,54 – 1,06 còn so sánh nhóm DLBCL với nhóm chứng, kiểu gen GG so với CC + GC 
có OR = 0,55; 95% CI: 0,27 – 1,19; G so với C có OR = 0,66; 95% CI: 0,41 – 1,07. Phân tích cho 
thấy giữa nhóm bệnh và nhóm chứng có sự khác biệt về kiểu gen GG và sự khác biệt về alen. Nhóm 
NHL và nhóm chứng, nhóm DLBCL và nhóm chứng không có khác biệt về kiểu gen, alen. Kiểu gen 
GG cũng như alen G liên quan đến sự giảm nguy cơ u lympho nhưng không thấy có mối liên quan 
với nguy cơ mắc NHL, DLBCL.
IV. BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này nam giới mắc 
bệnh nhiều hơn nữ giới với tỉ lệ 1,7/1. Chưa 
có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa đa 
hình rs1049174 và u lympho trước đó. Trong 
nghiên cứu này không có sự khác biệt các kiểu 
gen giữa từng nhóm bệnh, nhóm NHL, nhóm 
DLBCL so với nhóm chứng. So sánh khả năng 
mắc bệnh của kiểu gen GG và các kiểu gen còn 
lại đã phát hiện được mối liên quan giữa kiểu 
gen GG với giảm nguy cơ mắc u lympho (kiểu 
gen GG so với CC + GC có OR = 0,56; 95% CI: 
0,34 – 0,94; p = 0,033), alen G liên quan đến 
sự giảm nguy cơ u lympho (G so với C có OR = 
0,67; 95% CI: 0,48 – 0,93; p = 0,016), tuy nhiên 
không có mối liên quan giữa đa hình rs1049174 
và nguy cơ mắc NHL, DLBCL.
Đã có những nghiên cứu về mối liên quan 
giữa các đa hình thái đơn với u lympho. 
Người mang kiểu gen rs1042752CC của gen 
POU2AF1 có nguy cơ mắc u lympho cao hơn 
so với kiểu gen TT, ngay cả trong phân tích phân 
loại cho u lympho không Hodgkin, u lympho tế 
bào T, u lympho tế bào B, u lympho Hodgkin thì 
kiểu gen CC vẫn có nguy cơ mắc cao hơn kiểu 
gen TT.8 Một số SNP có liên quan đến việc tăng 
nguy cơ NHL chung: IL-10 (rs1800893 T > C), 
IL-1RN (rs4251961 C > T), TNF- α (rs1800630 
A > C) và TNF- α (rs 2229094 G>A). Những 
SNP này cũng có liên quan đến việc tăng nguy 
cơ DLBCL.9
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
21TCNCYH 126 (2) - 2020
Đa hình thái rs1049174 của gen NKG2D 
cũng có liên quan đến một số bệnh ung thư. 
Theo nghiên cứu của Furue và cộng sự trên 
người Nhật cho thấy: người có kiểu gen GG 
làm giảm nguy cơ ung thư đại trực tràng (OR 
= 0,48; 95% CI: 0,32 – 0,72).10 Tuy nhiên kết 
quả của chúng tôi khác với một nghiên cứu tại 
Xianyou – Trung Quốc. Nghiên cứu này chỉ ra 
những người mang kiểu gen rs1049174 GG có 
tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao hơn (OR = 1,85; 
95% CI: 1,02 – 3,38).11 Điều này có thể được 
giải thích là do sự nhạy cảm khác nhau của gen 
với các bệnh khác nhau.
Trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy 
rằng alen G SNP rs1049174 của NKG2D liên 
quan với giảm nguy cơ u lympho. Điều này gợi 
ý rằng đa hình đơn rs1049174 có thể xem như 
một dấu ấn cho việc chẩn đoán và sàng lọc cho 
bệnh nhân với nguy cơ u lympho.
V. KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xác định được đa hình đơn 
nucleotide rs1049174 của gen NKG2D ở hai 
nhóm bệnh nhân u lympho và nhóm chứng. 
Các phân tích dữ liệu chỉ ra mối liên quan giữa 
alen G đa hình đơn rs1049174 của gen NKG2D 
với giảm nguy cơ mắc u lympho.
Lời cảm ơn
Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Bệnh 
viện Bạch Mai, Viện Huyết học – Truyền máu 
Trung ương, Trường Đại học Y Hà Nội. Nghiên 
cứu này được tài trợ bởi Quỹ NAFOSTED trong 
đề tài mã số 108.02 – 2018.312.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. 
Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN 
estimates of incidence and mortality worldwide 
for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer 
J Clin. 2018;68(6):394-424. doi:10.3322/
caac.21492.
2. Huh J. Epidemiologic overview of malignant 
lymphoma. Korean J Hematol. 2012;47(2):92-
104. doi:10.5045/kjh.2012.47.2.92.
3. Tan D, Tan SY, Lim ST, et al. Management 
of B-cell non-Hodgkin lymphoma in Asia: 
resource-stratified guidelines.Lancet Oncol. 
2013;14(12):548-561. doi:10.1016/s1470-
2045(13)70450-9.
4. Mozaheb Z. Epidemiology of hodgkin's 
lymphoma. Health. 2013;5:17-22. doi:10.4236/
health.2013.55A003.
5. Burgess SJ, Maasho K, Masilamani M, 
et al. The NKG2D receptor: immunobiology 
and clinical implications. Immunol Res. 
2008;40(1):18-34. doi:10.1007/s12026-007-
0060-9.
6. Gonzalez S, Lopez-Soto A, Suarez-
Alvarez B, et al. NKG2D ligands: key 
targets of the immune response. Trends 
Immunol. 2008;29(8):397-403. doi:10.1016/j.
it.2008.04.007.
7. Asadi-Saghandi A, Shams A, Eslami G, 
et al. Peginterferon Alfa-2a/Ribavirin treatment 
efficacy in chronic hepatitis C patients is related 
to natural killer group 2D gene rs1049174 GC 
polymorphism. Virusdisease. 2016;27(4):369-
374. doi:10.1007/s13337-016-0349-1.
8. Zhai K, Chang J, Hu J, et al. Germline 
variation in the 3'-untranslated region of the 
POU2AF1 gene is associated with susceptibility 
to lymphoma. Mol Carcinog. 2017;56(8):1945-
1952. doi:10.1002/mc.22652.
9. Ye X, Zhao K, Wu C, et al. Associations 
between genetic variants in immunoregulatory 
genes and risk of non-Hodgkin lymphoma 
in a Chinese population. Oncotarget. 
2017;8(6):10450-10457. doi:10.18632/
oncotarget.14426.
10. Furue H, Matsuo K, Kumimoto H, et al. 
Decreased risk of colorectal cancer with the 
high natural killer cell activity NKG2D genotype 
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
22 TCNCYH 126 (2) - 2020
in Japanese. Carcinogenesis. 2008;29(2):316-
320. doi:10.1093/carcin/bgm260.
11. Zheng W, Li H, Liu B, et al. Association 
between the SNPs in trace element-related 
metabolic genes and the risk of gastric cancer: 
a case-control study in Xianyou of China. J 
Genet. 2019;98:67. doi:10.1007/s12041-019-
1110-5.
Summary
SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM RS1049174 OF NKG2D 
GENE IN LYMPHOMA PATIENTS
NKG2D receptor, on NK cell, plays the most important role in the conjugation with specific ligands 
present on the surface of the target cell that initiates cellular mediated immunity and promotes 
destruction of both virus injected cell and cancer cell. Previously, we found the single polymorphism 
(SNP) rs1049174 at 3’-UTR location of NKG2D gene were associated with the formation and 
development of cancer related HPV. The aim of this study was to detect the prevalence of this 
variant in lymphoma group and to compare with the healthy group. 129 lymphoma patients and 
178 healthy individuals were recruited in the study. PCR – RFLP and Real – time PCR were used 
to study the Genotype polymorphism rs1049174. Two types of SNP were found as the allele 
type (G vs C: OR = 0.67, 95% CI: 0.48 – 0.93), the homogenous gene type (GG vs GC + CC: 
OR = 0.56, 95% CI: 0.34 – 0.94). Allele G and GG genotype of SNP rs1049174 are related to 
a significantly reduction of lymphoma risk but there is no correlation with NHL and DLBCL risk. 
Keywords: Lymphoma, single polymorphism rs1049174 G, NKG2D gene