Công nghệ Enzym - Protein

Công nghệ Enzym -
Protein 
Đại cương 
 Công nghệ enzym: ứng dụng enzym hoặc xúc tác sinh học để tạo 
ra sản phẩm hay dịch vụ 
 Ứng dụng của enzym
 Công nghiệp:
 Thực phẩm: Làm bánh mì, rượu bia, các sản phẩm sữa
 Tẩy rửa: protease, lipase
 Xử lý tinh bột: các amylase, isomerase
 Dệt-da: amylase, lipase, cellulase
 Y Dược
 Trợ tiêu hóa: amylase, protease
 Chẩn đoán: Alcol dehydrogenase, Cholesterol esterase, Creatinase, 
Glucose oxidase, Uricase
 Điều trị: Asparaginase, Lactamase, Urease, Uricase, Streptokinase
 Hóa dược: Steroid, Ibuprofen, Salbutamol, Propanolol
 Nghiên cứu: Endonuclease, RNase, DNase, Polymerase, Ligase
Khái niệm xúc tác sinh học 
 Enzym là chất xúc tác của các quá trình sinh học, 
 Bản chất là protein
 Giúp phản ứng đạt được điểm cân bằng nhanh hơn
 Enzym không thể xúc tác phản ứng với sự thay đổi 
năng lượng tự do không thuận lợi trừ khi phản ứng 
đó có thể song hành với một phản ứng khác có sự 
thay đổi năng lượng tự do thuận lợi hơn 
 Giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn trong điều kiện 
bình thường về áp suất, nhiệt độ, pH 
Công nghệ enzym hiện đại
 Hóa học protein 
 Lý sinh phân tử 
 Sinh học phân tử
 Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym 
 Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym 
Nhu cầu sử dụng enzym 
Chỉ tiêu Công nghiệp Phân tích Dược phẩm
Lượng sử 
dụng
Tấn Milligam gam Milligam gam
Độ tinh 
khiết
Không tinh 
khiết
Tinh thể tinh 
khiết
Tinh thể tinh 
khiết
Nguồn gốc Vi sinh vật, 
thường ngoại 
bào
Vi sinh vật, động 
vật, thực vật, 
thường nội bào
Vi sinh vật, động 
vật, thực vật, 
thường nội bào
Giá sản 
xuất
Thấp Trung bình Cao
Xúc tác sinh học 
 Tính chọn lọc cao 
 Chọn lọc theo vị trí nhóm hóa học 
 Chọn lọc không gian 
 Hoạt động trên cơ chất đa dạng 
 Hoạt động được trong môi trường không phải là 
nước 
 Khả năng đảm nhận lượng cơ chất cao 
 Có độ bền đủ cao 
 Tính kinh tế 
Tính chọn lọc theo vị trí 
N
N
N
N
O
CH3
NH2O
OHHO
HO
N
N
N
N
O
CH3
NH2O
OHHO
O
CH3
O 5'vinyl acetat
C. antarctica 
lipase
Dẫn xuất Purine (Nelarabine) Sản phẩm acyl hóa 
Tính chọn lọc không gian
COOCH3
H3CO
COOH
H3CO
COOCH3
H3CO
lipase
H2O
+
(R,S)-naproxen methyl ester 
(S)-naproxen 
(R)-naproxen methyl ester 
Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu
 Chiết tách
 Động vật
 Thực vật 
 Lên men 
 Vi sinh vật 
 Nuôi cấy tế bào 
 Công nghệ gen 
Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu 
 Chiết tách từ mô: lysozym, papain, bromelin, 
 Lên men bề mặt: amylase, protease nấm mốc
 Lên men chìm: các enzym dùng trong phân tích và y 
học
 Qui mô lớn: enzym thô dùng trong công nghiệp
 Qui mô nhỏ: enzym dùng trong y học
 Chủng được chọn lọc thông qua biến đổi di truyền 
 Tăng hoạt tính
 Tính ổn định
 Nhiệt độ, pH tối ưu
 Chuyển gen sản xuất enzym vào các ký chủ dễ nuôi cấy
Phương pháp sản xuất - Tổng quát
Chuẩn bị nguyên liệu 
Chiết tách
Cô đặc
Tinh chế
Hoàn chỉnh sản phẩm 
• Loại bỏ mô tạp
• Phá vỡ tế bào 
• Ly tâm, lắng
• Tủa bông
• Lọc 
• Bay hơi
• Tủa 
• Siêu lọc
• Kết tinh trực tiếp
• Sắc ký 
• Hấp phụ
• Cô đặc
• Kết tinh
• Đông khô
• Ổn định
Chuẩn bị nguyên liệu sinh học 
 Cơ quan động vật
 Loại chất béo và mô liên kết trước khi đông lạnh 
 Bảo quản lạnh đến khi đủ mẫu để xử lý 
 Nghiền trên máy nghiền thịt và enzym được chiết với dung dịch 
đệm. 
 Enzym để phá vỡ tế bào
 Nguyên liệu thực vật
 Thực vật có thể được nghiền và chiết với dung dịch đệm. 
 Tế bào cũng có thể được phá vỡ bằng cách xử lý với enzym.
 Vi sinh vật
 Ngoại bào: tách tế bào ra khỏi dung dịch lên men. 
 Nội bào: phá vỡ tế bào
Các phương pháp phá vỡ tế bào
 Áp suất cao (Manton - Gaulin, French-
press)
 Nghiền (máy nghiền bi)
 Siêu âm
 Làm khô (đông khô, dung môi hữu cơ)
 Ly giải: 
 Vật lý: đông lạnh, sốc thẩm thấu
 Hóa học: chất tẩy, kháng sinh 
 Enzym: lysozyme, kháng sinh
French-press
Sản xuất enzym - Chiết tách
 Tách dịch enzym ra khỏi các phần khác. 
 Lắng
 Ly tâm liên tục 
 Lọc 
 truyền thống 
 lọc áp suất, lọc chân không 
 lọc chảy qua (cross-flow filtration). 
 Phương pháp kết bông
Cô đặc
 Bay hơi
 Kết tủa
 Muối
 Dung môi hữu cơ 
 Polymer 
 Siêu lọc
Tinh chế 
 Kết tinh
 Điện di 
 Sắc ký 
Loại sắc ký Nguyên lý Tách theo 
Hấp phụ Liên kết bề mặt Ái lực bề mặt
Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực 
Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích 
Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước và hình dạng phân tử
Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử 
Kỵ nước Tương tác kỵ nước Cấu trúc phân tử 
Đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị Tính phân cực 
Đánh bắt ion kim 
loại 
Sự thành lập phức Cấu trúc phân tử 
Nguyên lý Sắc ký 
Nguyên lý Sắc ký
Chọn Phương pháp sắc ký 
GF = Lọc gel
AC = Sắc ký Ái lực
IEX = Sắc ký Trao đổi Ion
HIC = Sắc ký Tương tác kỵ nước 
RPC = Sắc ký Pha đảo
Ví dụ tinh chế amylase bằng hấp phụ
Dịch Enzym thô
Phức Enzym Alginat natri
Tủa Enzym Alginat Calci
Dịch Enzym tinh
• Natri alginat
• Calcium chlorid
• Lọc lấy tủa
• Phản hấp phụ
• Lọc lấy dịch
Dịch tạp chất 
Alginat Calci
Sản phẩm amylase
• Cô đặc
• Thẩm tích
Ví dụ sản xuất Taq polymerase
Thermus aquaticus
hay E.coli tái tổ hợp 
Môi trường
Lên men
Thu tế bào 
Phá tế bào 
Tủa (NH4)2SO4
Thẩm phân
Cột DEAE
Cột Hydroxyapatide
Cột DEAE
Cột phosphocellulose
Taq polymerase tinh khiết
Môi trường thừa
Xác tế bào 
Dịch nổi
Enzym cố định 
 Ưu điểm
 Enzym có thể được sử dụng lặp lại nhiều lần
 Chế phẩm bền hơn enzym tự do
 Enzym cố định có tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản 
xuất ở mức độ tự động hóa cao.
 Nhờ sự cố định mà enzym không lẫn vào sản phẩm 
cuối
 Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng 
loại
 Nhược điểm
 Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.
 Cản trở về không gian do liên kết với chất mang làm 
hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất.
Vật liệu cố định 
 Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp
 Chất mang phải có tính cơ lý ổn định
 Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không 
hòa tan trong môi trường phản ứng.
 Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn
 Có khả năng trương nở trong môi trường
Các phương pháp cố định enzym 
Đặc tính 
Phương pháp liên kết với chất mang Phương pháp khác
Hấp phụ 
vật lý
Liên kết 
ion
Liên kết 
đồng hóa trị
Liên kết 
chéo
Bắt giữ
Kỹ thuật Dễ Dễ Khó Khó Khó 
Hoạt tính enzym Thấp Cao Cao Trung bình Cao 
Tính đặc hiệu cơ 
chất 
Không đổi Không đổi Thay đổi Thay đổi Không đổi
Lực liên kết Yếu Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh 
Khả năng tái cố 
định 
Có thể Có thể Không Không Không 
Khả năng ứng dụng Thấp Trung bình Trung bình Thấp Cao 
Chi phí cố định Thấp Thấp Cao Trung bình Thấp 
Cố định thuận nghịch 
 E 
E 
Hấp phụ 
E + - 
E + - 
E + - 
Liên kết ion 
E 
E 
E 
Liên kết ái lực 
Liên kết ion kim 
loại hoặc chelate 
E Me- 
E Me- 
E 
E S S 
E S S 
E S 
E 
Liên kết disulfit 
Me- 
S 
Cố định không thuận nghịch
 E 
E 
E 
Liên kết đồng hóa trị 
E E 
E E 
Bắt giữ 
E 
E 
E 
E 
E 
E 
E 
Tạo vi hạt bao 
E 
E 
E 
E 
E 
E 
E 
Liên kết chéo 
Ứng dụng enzym trong ngành dược 
 Liệu pháp enzym 
 Enzym trong sản xuất thuốc 
Trị liệu bằng enzym 
 Thay thế enzym do bệnh di truyền
 Thay thế enzym do một bệnh mắc 
phải 
 Cung cấp tác dụng sinh học đặc hiệu 
 Dùng trong điều trị hỗ trợ khi phối 
hợp với các liệu pháp khác, hay để 
giải độc máu hay mô.
Liệu pháp enzym - Yêu cầu của enzym 
 Phải đến được vị trí tác động của chúng trong cơ thể hay mô.
 Phải có hoạt tính trong các điều kiện môi trường tại nơi tác 
động. 
 Chúng phải đủ bền để có được các thông số dược động học 
cần thiết, 
 Độ tan thỏa mãn yêu cầu nếu được dùng theo đường tiêm bắp 
hay dưới da.
 Độ tinh khiết đủ cao
 Có hiệu quả điều trị dựa trên hoạt tính đặc hiệu của enzym 
được dùng. Hiệu quả của liệu pháp phải được chứng minh 
 An toàn đối với bệnh và chỉ định điều trị 
 Dạng sử dụng thuận tiện 
Các vấn đề của thuốc protein 
 Không ổn định
 Sinh khả dụng
 Tính thấm tế bào
 Tính chất gây miễn dịch
 Phản ứng dị ứng
 Sản xuất và kiểm định
 Lợi thế
 Ít tác dụng phụ hơn
 Thời gian phát triển ngắn
 Tỷ lệ thành công khi xin cấp phép cao
Thách thức
 Cải thiện tính ổn định
 PEG, liên kết chéo
 Phóng thích có kiểm soát 
 Bao bảo vệ
 Cải tiến phân tử
 Giảm tính miễn dịch 
 Định hướng đặc hiệu 
 Khả năng xuyên màng tế bào 
Nguồn enzym 
 Chiết xuất - Tinh chế:
 Không phải người: nấm, vi khuẩn, động vật, thực vật 
 Gây miễn dịch 
 Dùng ngoài
 Yêu cầu thấp
 Người 
 Giới hạn công suất, nguyên liệu hạn chế
 Nhiễm virus và các yếu tố gây bệnh khác
 Tái tổ hợp
 Sử dụng gen người tái tổ hợp trong tế bào khác
 Cải thiện hoạt tính, đặc điểm thông qua cải tiến trình tự 
Hệ thống sản xuất 
 Nuôi cấy tế bào người – động vật 
 Chất lượng tốt
 Năng suất giới hạn 
 Nhiễm virus 
 Nấm men
 Thực hiện được một số biến đổi hậu dịch mã 
 Vi khuẩn 
 Năng suất cao
 Không thực hiện được biến đổi hậu dịch mã
 Sinh vật chuyển gen 
 Liệu pháp gen 
Sản xuất thuốc bằng 
công nghệ enzym
cnshduoc@gmail.com`
Thuốc đối quang
 Cấu trúc không gian của phân tử sinh học và thụ thể 
 Chỉ một trong hai đồng phân có hoạt tính, 
 Các đồng phân có hoạt tính khác nhau
 Dược động học và chuyển hóa khác nhau 
 Thuốc tinh khiết quang học (enantiopure
 Bản quyền đồng phân
Thuốc đối quang
Tác dụng dược lý chính Khác biệt giữa các đồng phân
Thuốc chẹn β: 
propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol, 
betaxolol, carvedilol, meto-prolol, labetalol, 
pindolol, sotalol, 
l > d (d = không có hoạt tính) 
Ví dụ: S(-)-propranolol > R(+)-propranolol
Thuốc chẹn kênh calci: 
verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine, 
felodipine, mandipine 
l > d 
Ví dụ: S(-)-verapamil > R(+)-verapamil
Thuốc giãn phế quản: 
albuterol (salbutamol), salmeterol và terbutaline
l > d (d = không có hoạt tính) 
Ví dụ: R(-)-albuterol > S(+)- albuterol
An thần: 
hexobarbital, secobarbital, mephobarbital, 
pentobarbital, thiopental, thiohexital
l > d 
Ví dụ: S(-)-secobarbital > R-(+)secobarbital
Thuốc gây mê: 
ketamine, isoflurane
d > l (l = không có hoạt tính) 
Ví dụ: S(+)-ketamine > R(-)-ketamine 
S(+)-isoflurane > R(-)-isoflurane
Giảm đau tác động trung ương: Methadone Ví dụ: R(-)-methadone > S(+)-methadone
Kháng viêm không steroid: 
ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen
d > l 
Ví dụ: S(+)-ibuprofen > R(-)-ibuprofen
An thần: nhóm 3-hydroxy-benzodiazepines: 
oxazepam, lorazepam, temazepam
d > l (l = không có hoạt tính) 
Ví dụ: S(+)-oxazepam > R(-)- oxazepam
Thuốc đối quang - racemic
Thuốc: 668 
Không bất đối: 2 
Bất đối: 145 
Chế phẩm một 
đồng phân: 119 
Tự nhiên/ 
bán tổng hợp: 147 
Chế phẩm dạng 
racemic: 8 
Bất đối: 252 
Không bất đối: 269 
Chế phẩm dạng 
racemic: 140 
Tổng hợp: 521 
Chế phẩm một 
đồng phân: 110 
Các loại phản ứng được xúc tác bởi enzym 
Lớp enzym theo IUBMB Phản ứng xúc tác 
EC 1 Oxidoreductases 
Không đòi hỏi đồng cơ chất
Oxi hóa/khử đối với –CH–OH, –C=O, –C=C,  
EC 2 Transferases 
Không đòi hỏi đồng yếu tố
Chuyển các nhóm chức như halogen, aldehyde, keto, acyl, 
glycosyl,  
EC 3 Hydrolases 
Không đòi hỏi đồng yếu tố
Thủy phân/ngưng tụ các ester, glycosid, nitril, amid, 
halogen,  
EC 4 Lyases 
Không đòi hỏi đồng yếu tố
Thêm/loại bỏ; cắt các liên kết C–C, C–O, C–N
EC 5 Isomerases 
Không đòi hỏi đồng yếu tố
Đồng phân hóa, chuyển dạng cis-trans, epime hóa 
EC 6 Ligases 
Cần đồng cơ chất ATP
Tạo các liên kết C–O, C–S, C–N, C–C 
Một số vấn đề công nghệ 
 Chi phí cố định phải bù đắp được bởi sự gia tăng tính ổn định 
hoặc hoạt tính. 
 Giảm thiểu sự mất hoạt tính trong quá trình cố định. 
 Khi enzym được cố định bằng phương pháp có tính thuận 
nghịch, sự rò rỉ enzym phải được nghiên cứu và có biện pháp 
thích hợp. 
 Sự giới hạn về luân chuyển vật chất trong chất mang cần được 
tính toán khi điều chỉnh pH hay nhiệt độ trong quá trình phản 
ứng. 
 Với enzym tự do, hoạt tính chuyển hóa có thể đạt được cao 
hơn ở nồng độ enzym cao, do đó việc chuyển hóa các cơ chất 
khó có thể thực hiện được.
 Tính vô trùng của phản ứng cần được quan tâm. 
 Sự tương thích của dung môi với chất mang và ảnh hưởng của 
dung môi đến hoạt tính cần được xem xét.
Lựa chọn nồi phản ứng 
* 
* 
* 
* 
* 
* * 
* 
* * 
* * 
* 
* * * 
* 
* 
* 
* * * 
* * 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* * 
* 
* 
* 
* 
* * * 
* * * 
* * * * * * * * 
* 
* * 
* * * * 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* * 
* 
* * 
* * 
* 
* * * 
* 
* 
* 
* * * 
* * 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* * 
* 
* 
* 
* 
* * * 
* * * 
* * * * * * * * 
* 
* * 
* * * * 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* * 
* 
* * 
* * 
* 
* * * 
* 
* 
* 
* * * 
* * 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* * 
* 
* 
* 
* 
* * * 
* * * 
* * * * * * * * 
* 
* * 
* * * * 
* 
* 
* 
* 
* * 
* * * 
* 
* * 
* * 
* * * 
* 
* 
* 
* * 
* 
* 
* 
* 
* 
a b c 
f e d 
A: vận hành theo lô; B: vận hành theo lô có tuần hoàn; C: thùng khuấy có siêu lọc; 
D: thùng khuấy vận hành liên tục; E: thùng nhồi liên tục; F: tầng sôi liên tục 
Oxidoreductase 
N
N
N
N
HN
ClO
OHHO
HO
Ph
Ph
N
N
N
N
HN
ClO
OHHO
HO
Ph
Ph
ONucleoside Oxidase
H2O, pH 6, 25 
oC, 12-24h
5'
Nucleoside oxidase lấy từ Stenotrophomonas maltophilia 
(FERM BP-2252) 
Sản xuất các dẫn xuất 5’-carboxylic acid của các 
nucleoside đồng đẳng. 
Enzym thô từ dịch chiết tế bào 
Hoặc enzym cố định trên Eupergit-C 
Lipase 
O
OH
O
N
N N
N
F
F
O O
N
N N
N
F
F
OAc
O
OH
O
N
N N
N
F
F
OH
COOH
OH
N
N N
N
F
F
O
OH
O
N
N N
N
F
F
Lipase
37oC, 20h
Lipase
H2O
racemic
(S)-acetat (R)
(S)
+
Thuốc hạ cholesterol
Lipase
OO
O
O
OO
O
O
OO
OH
OO
O
N
+
Lipase
H2O, 25
oC, 4h
racemic cis-hexanoate
(3R,4S)-phenol
(-)-Ormeloxifene
Thuốc ngừa thai tác dụng kéo dài (1 viên/tuần)
Lipase
N
H
O
CO2Et
F
N
H
O
CO2H
F
N
H
O
CO2Et
F
N
H
F
O
O
O
+
Lipase
pH 7, MeCN
45oC, 24h
Paroxetine
Thuốc chống trầm cảm
Lipase
CH3 O
OH
Novozym 435
CH3 O
OH
CH3 O
OC12H25
(S)-(+)-ibuprofen
(R)-(-)-ibuprofen ester
+
(R,S)-ibuprofen
1-Dodecanol
Thuốc kháng viêm không steroid
Amidase 
NH
O
NH
O
NH3
+
OO-
N
HO
N NH
N NH2
OH
-lactamase
H2O, 70
oC
+
Carbovir
rac-lactam (+)-lactam (-)-acid amin
Đồng đẳng Carbovir 
Thuốc kháng HIV
Deaminase 
N
N
O
S
NH2
O
HO
N
N
O
S
NH2
O
HO
N
NH
O
S
O
O
HO
+
Cytidine Deaminase
H2O, pH 7, 32
oC, 35-70h
Lamivudine
Thuốc kháng virus (HBV, HIV)
Lyase 
N
CN
N
CONH2
H2O, pH 8, 25
oC, 18h
Nicotinamide
 Tế bào R. rhodochrous J1 
cố định 
Vitamin B3