Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc Escherichia coli vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum

TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 69–82 
DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10588 
 69 
TRANSFORMATION OF Escherichia coli MODIFIED gdhA GENE 
INTO Nicotiana tabacum 
Pham Thi Hang
1
, Nguyen Thuy Linh
1
, Le Bac Viet
1
, Nguyen Thi Kim Lien
1
, 
Le Thi Thu Hien
1,2
, Huynh Thi Thu Hue
1,2,*
1
Institute of Genome Research, VAST, Vietnam 
2
Graduate University of Science and Technology, VAST, Vietnam 
Received 3 August 2017, accepted 3 March 2019 
ABSTRACT 
The gdhA gene from Escherichia coli encoding a NADPH-GDH was expressed in tobacco plants 
exhibited high growth performance and enhanced herbicide resistance as well as drought 
tolerance. In addition, the gdhA gene when expressed in maize plants could increase 
productivity because of improving stress tolerance. In this study, we isolated and analyzed a 
gdhA gene from the E. coli strain JM109. Then, the E. coli derived-gdhA sequence was modified 
by using OptimumGene™ software for plant compatibility. The optimized gdhA gene was 
inserted into an expression cassette containing the CaMV 35S promoter and the 35S terminator 
of the pRTRA7/3 vector. The 35S::gdhA::35S construct was ligated into the plant expression 
plasmid pCAMBIA1300 which then introduced into the A. tumefaciens strain EHA105. In order 
to examine the expression of the gdhA gene, we created gdhA-transgenic plants via 
Agrobacterium-mediated transformation into N. tabacum K326. The PCR analysis showed that 
two out of 20 plants were positive to the presence of the gdhA gene. The RT-PCR experiment 
also revealed that gdhA was expressed at transcriptional level. These results suggested that the 
gdhA expression construction can be transformed into other crops such as maize. 
Keywords: E. coli, genetic modification, genetic transformation, gdhA gene, tobacco. 
Citation: Pham Thi Hang, Nguyen Thuy Linh, Le Bac Viet, Nguyen Thi Kim Lien, Le Thi Thu Hien, Huynh Thi Thu 
Hue, 2019. Transformation of Escherichia coli modified gdhA gene into Nicotiana tabacum, 41(1): 69–82. 
https://doi.org/10.15625/0866-7160/v41n1.10588. 
*Corresponding author email: hthue@igr.ac.vn 
©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 
TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 69–82 
DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10588 
 70 
CHUYỂN GEN CẢI BIẾN gdhA CÓ NGUỒN GỐC Escherichia coli 
VÀO CÂY THUỐC LÁ Nicotiana tabacum 
Phạm Thị Hằng1, Nguyễn Thùy Linh1, Lê Bắc Việt1, Nguyễn Thị Kim Liên1, 
Lê Thị Thu Hiền1,2, Huỳnh Thị Thu Huệ1,2,* 
1
Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Việt Nam 
2
Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Việt Nam 
Ngày nhận bài 3-8-2017, ngày chấp nhận 3-3-2019 
TÓM TẮT 
Gen gdhA mã hoá cho NAPH-GDH từ vi khuẩn E. coli khi biểu hiện trong cây thuốc lá đã làm 
tăng cường khả năng chống chịu thuốc bảo vệ thực vật, tăng sinh khối thực vật và tăng khả năng 
chịu hạn. Khi biểu hiện gen gdhA ở cây ngô giúp tăng năng suất nhờ cải thiện khả năng chịu 
đựng hạn của cây. Với mục đích có nguồn gen giá trị này, chúng tôi tiến hành phân lập gen gdhA 
từ chủng vi khuẩn E. coli JM109, tạo dòng và xác định trình tự gen gdhA để tìm sự khác biệt về 
gen trong chủng hiện có. Đồng thời, chúng tôi thực hiện cải biến trình tự gen gdhA bằng phần 
mềm OptimumGeneTM cho phù hợp với thực vật. Gen gdhA sau khi cải biến được ghép nối với 
promoter CaMV 35S và 35S terminator trong vector trung gian pRTRA 7/3 để tạo cấu trúc biểu 
hiện 35S::gdhA::35S. Cấu trúc này đã được chuyển vào vector pCAMBIA1300 tạo nên vector 
biểu hiện thực vật mang gen gdhA và biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens chủng 
EHA105. Để kiểm tra sự biểu hiện của gen gdhA chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc biểu hiện 
gen gdhA vào cây mô hình thuốc lá N. tabacum K326 thông qua A. tumefaciens. Phân tích sự có 
mặt của gen trong 20 dòng cây thuốc lá chuyển gen bằng PCR và RT-PCR cho thấy 2 trong số 20 
dòng thuốc lá chuyển gen có mang gen gdhA hoạt động ở mức độ phiên mã tạo mRNA. Sự biểu 
hiện của cấu trúc này ở cây thuốc lá cho thấy có thể sử dụng cấu trúc mang gen để chuyển gen 
gdhA vào cây trồng đích như cây ngô. 
Từ khoá: E. coli, cải biến gen, cây thuốc lá, chuyển gen, gen gdhA. 
*Địa chỉ liên hệ email: hthue@igr.ac.vn 
MỞ ĐẦU 
Khô hạn là một nguyên nhân quan trọng 
làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm 
của cây trồng. Khi môi trường khô hạn, cây bị 
stress mất nước dẫn đến nhiều hậu quả 
nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri 
& Mulas, 2013). Vì vậy, để sống sót trong 
điều kiện hạn hán, thực vật đã hình thành nên 
nhiều cơ chế chống chịu. Trong phản ứng với 
sự thiếu nước, thực vật tích luỹ một số chất 
chuyển hoá như đường (trehalose, sorbitol và 
mannitol), amino axit (proline và asparagine) 
và amin (glycine betain và polyamines). 
Trong số này, việc tích lũy amino acid tự do 
dường như có vai trò quan trọng trong việc 
bảo vệ thực vật (Good & Zaplachinski, 1994; 
Rhodeset et al., 1999), nhưng sự tích lũy 
amino acid được điều chỉnh như thế nào khi 
thâm hụt nước vẫn chưa được nghiên cứu làm 
rõ. Glutamate đóng một vai trò quan trọng 
trong việc điều chỉnh hoạt động của nhiều con 
đường, đặc biệt là quá trình trao đổi amino 
acid (Forde & Lea, 2007), sự trao đổi chất 
cacbon (Lam et al., 1998), chuyển hóa amino 
acid (Noctor et al., 2002) và đồng hoá nitrate 
(Stitt et al., 2002). Glutamate dehydrogenase 
từ vi khuẩn (GDH, E.C. 1.4.1.1) và thực vật 
Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E. coli 
 71 
(E.C. 1.4.1.2) xúc tác cho phản ứng thuận 
nghịch. Với quá trình đồng hoá, GDH là một 
trong số ít các enzyme có khả năng amin hóa 
khử của một axit hữu cơ để tạo ra một amino 
acid; α-ketoglutarate được sử dụng để sản 
xuất glutamate với sự hiện diện của NAD(P)H 
(Wooton, 1983). Đối với quá trình dị hóa, 
GDH là một enzyme có khả năng giải phóng 
amino nitơ từ các amino acid để tạo ra axit 
keto và NH3 có thể được tái chế riêng để sử 
dụng trong quá trình chuyển hóa cacbon và sự 
hình thành amide, đặc biệt là trong quá trình 
già hoá (Aubert et al., 2001; Loulakakis et al., 
2002). GDH có thể tham gia tổng hợp 
glutamate để cung cấp khung carbon cho chu 
trình TCA và sản xuất năng lượng khi thiếu 
hụt carbon (Dubois et al., 2005; Kichey et al., 
2005; Tercé‐Laforgue et al., 2004). Ở vi 
khuẩn, ammoni được đồng hóa thành amino 
acid dựa trên glutamate và aminotransferases. 
Ở thực vật, nghiên cứu đã cho thấy GDH 
được cảm ứng tăng cường biểu hiện khi lượng 
gốc tự do tăng lên bởi những stress vô sinh 
(Skopelitis et al., 2006). Như vậy, giữa thực 
vật và vi khuẩn có những điểm tương đồng 
đáng chú ý trong hệ gen. Nhiều gen ở vi 
khuẩn liên quan đến khả năng chống chịu các 
điều kiện môi trường stress khác nhau đã 
được xác định. Sự biểu hiện của các protein vi 
khuẩn liên quan này được biểu hiện ở thực vật 
đã trực tiếp hoặc gián tiếp bảo vệ cây chống 
lại các stress của môi trường như khô hạn, 
mặn, nhiệt độ thấp. Thực vật chuyển gen 
GDHs của vi khuẩn đã được cải thiện đáng kể 
tính chống chịu với chất bảo vệ thực vật, và 
trong điều kiện thiếu nước. 
Các nghiên cứu trước đây cho thấy, gen 
gdhA mã hoá cho NAPH-GDH từ vi khuẩn E. 
coli khi biểu hiện trong cây thuốc lá 
(Nicotiana tabacum cv.„SR1‟) làm tăng cường 
khả năng chống chịu thuốc bảo vệ thực vật 
phosphinithricin (PPT), làm tăng sinh khối 
thực vật, hàm lượng axit amin tự do và 
carbohydrate (Ameziane et al., 2000), tăng 
khả năng chịu hạn (Mungur et al., 2006). Các 
enzyme GDH phụ thuộc NADPH được mã 
hoá bởi gen gdhA của E. coli khi biểu hiện 
trong ngô cũng cải thiện sức sống của cây 
trong điều kiện thiếu nước (Lightfoot et al., 
2007). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi 
tiến hành phân lập gen gdhA mã hoá cho 
GDH từ chủng vi khuẩn E. coli JM109, cải 
biến gen này và tái tổ hợp vào vector biểu 
hiện thực vật để phục vụ công tác chuyển gen 
vào cây đích là cây ngô. Trước tiên, chúng tôi 
tiến hành chuyển gen gdhA cải biến vào cây 
mô hình thuốc lá để kiểm tra sự biểu hiện của 
gen cải biến trong cấu trúc đã được thiết kế. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 
CỨU 
Ba chủng vi khuẩn E. coli JM109, chủng 
E. coli DH10β và chủng A. tumefaciens 
EHA105 đã được lưu giữ tại Viện Nghiên cứu 
hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ 
Việt Nam. 
Các vector được sử dụng gồm: vector tách 
dòng pJET 1.2, vector tách dòng trung gian 
pRTRA7/3 mang promoter CaMV35S, vector 
biểu hiện thực vật pCAMIA1300. 
Bảng 1. Các cặp primer được thiết kế để nhân gen 
Tên mồi Trình tự mồi 
gdhAF 5‟ GAAGGATCCAGGATGGATCAGACATATTCTCT 3‟ 
gdhAR 5‟ATTATGCGGCCGCTTATTAAATCACACCCTGCGC 3‟ 
gdhABamHIF 5‟ ACAGATGGATCCGATCAGACATACTCTCTGGAGTC 3‟ 
gdhANotIR 5‟ AGTGATGCGGCCGCGATCACACCCTG 3‟ 
HptF 5‟ AAAGCCTGAACTCACCGC 3‟ 
HptR 5‟ GCTTTCCACTATCGGCGA 3‟ 
CaMV35SF 5‟ CACTGACGTAAGGGATGACGC 3‟ 
cmycR 5‟ TATCGACGGGATCGGGCTAGAGTTCG 3‟ 
Pham Thi Hang et al. 
 72 
Phân lập gen gdhA từ các chủng vi khuẩn 
Gen gdhA được nhân từ DNA tổng số của 
3 chủng vi khuẩn E. coli bằng kỹ thuật PCR 
với cặp mồi gdhAF/R. Sản phẩm PCR được 
tinh sạch theo quy trình của bộ kit GeneJET 
Gel Extraction Kit của hãng Thermo 
Scientific và được tạo dòng trong vector 
pJET1.2 theo quy trình của bộ kit Clone JET 
Kit của hãng Thermo Scientific. 
Xác định và phân tích trình tự gen gdhA 
Trình tự nucleotide được xác định dựa 
trên nguyên tắc của phương pháp Sanger trên 
hệ thống máy giải trình tự ABI 3500. Kết quả 
giải trình tự được xử lý bằng phần mềm 
BioEdit. Trình tự gen sau khi xử lý được so 
sánh với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen và 
đăng ký lên ngân hàng gen với mã số 
KT124225. 
Cải biến gen gdhA 
Trình tự gen gdhA từ vi khuẩn chưa qua 
cải biến được đưa lên phân tích trên công cụ 
phân tích codon hiếm để đánh giá chỉ số CAI 
của gen gdhA khi được đưa vào biểu hiện 
trong cây ngô. Sau khi cải biến, chỉ số CAI 
tăng lên 0,8–1,0 coi như cải biến thành công. 
Kiểm tra trình tự amino axit của gen được cải 
biến bằng phần mềm Expasy để đánh giá mức 
độ chính xác của những thay đổi này. Trình tự 
cải biến được giữ nguyên các đặc điểm của 
gen trên 2 nucleotide đầu của mỗi mã bộ ba, 
chỉ cải biến vị trí thứ 3 trên mỗi mã bộ ba. Sau 
đó, gen được tổng hợp hoàn chỉnh với các mã 
bộ ba đã cải biến. 
Thiết kế vector mang cấu trúc biểu hiện 
CaMV35S::gdhA::35S 
Vector tách dòng pJET1.2 mang gen gdhA 
đã cải biến được dùng làm khuôn trong phản 
ứng PCR với primer gdhABamHIF/NotIR 
nhân đoạn gen gdhA treo điểm nhận biết của 
BamHI và NotI nhằm gắn với vector trung 
gian pRTRA7/3 đã được xử lý BamHI và 
NotI. Vector pRTRA7/3 có chứa cấu trúc 
CaMV35S::35S gồm promoter CaMV35S và 
terminator 35S, gen gdhA được chèn vào giữa 
promoter và terminator để tạo cấu trúc biểu 
hiện CaMV35S::gdhA::35S. Sau đó toàn bộ 
cấu trúc được đọc trình tự để kiểm tra lại tính 
chính xác của gen cũng như điểm nối. Đoạn 
cấu trúc biểu hiện gen được cắt với HindIII và 
ghép nối với vector biểu hiện thực vật 
pCAMBIA 1300 đã mở vòng với HindIII 
(hình 1). Vector tái tổ hợp pCAMBIA1300 
được biến nạp vào A. tumefaciens theo 
phương pháp xung điện. 
Hình 1. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen gdhA 
Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E. coli 
 73 
Chuyển gen gdhA vào cây thuốc lá mô hình 
N. tabacum K326 theo phương pháp mảnh 
lá (Topping, 1998) 
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang 
vector tái tổ hợp chứa gen gdhA được nuôi 
cấy trong môi trường có kháng sinh chọn lọc 
kanamycin và rifamycin trong 48 giờ, sau đó 
nuôi phục hồi cho tới khi đạt OD600nm = 0,7. 
Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn, hoà tan trong 
môi trường ½ MS (Murashige and Skoog 
medium) để chuẩn bị biến nạp. Các mảnh 
thuốc lá N. tabacum có kích thước 1×1 cm 
được ngâm trong dịch huyền phù tế bào vi 
khuẩn trên trong 15 phút. Các mảnh lá này sau 
đó được tái sinh trên môi trường ra chồi MS 
có bổ sung BAP (6-benzylaminopurine). 
Những chồi phát triển tốt được cắt chuyển 
sang môi trường ra rễ. Khi cây phát triển hoàn 
thiện về hình thái được chuyển ra giá thể. 
Đánh giá cây thuốc lá chuyển gen gdhA thế 
hệ T0 
Khi các cây thuốc lá chuyển gen ra lá mới 
và phát triển bình thường, chúng tôi tiến hành 
thu mẫu lá non của cây để tách chiết DNA và 
RNA tổng số. Các mẫu DNA tổng số sau đó 
được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng 
PCR với 2 cặp mồi: HptF/R và 
gdhABamHIF/NotIR kiểm tra sự có mặt của 
cấu trúc biểu hiện gen gdhA trong cây thuốc lá 
chuyển gen thế hệ T0. Đồng thời, chúng tôi 
cũng kiểm tra sự hoạt động phiên mã của gen 
gdhA thông qua phản ứng RT-PCR sử dụng 
cặp mồi đặc hiệu gdhABamHIF/NotIR. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Phân lập gen gdhA từ chủng vi khuẩn E. 
coli JM109 
Dựa trên những thông tin về trình tự gen 
gdhA đã công bố trên GenBank, chúng tôi đã 
thiết kế cặp mồi đặc hiệu gdhA F/R cho phản 
ứng PCR nhân đoạn gen gdhA. Trong nghiên 
cứu này, DNA tổng số được tách chiết từ ba 
chủng vi khuẩn E. coli (JM109, Top10, 
DH5α) theo phương pháp tách DNA tổng số 
của Sambrook et al. (1989). 
Phản ứng PCR được thực hiện với khuôn 
mẫu là DNA, sử dụng enzyme DreamTaq 
polymerase với cặp mồi gdhA F/R nhiệt độ 
gắn mồi 63oC. Kết quả điện di sản phẩm PCR 
trên gel agarose 0,8% (hình 2) cho thấy, cả 3 
chủng vi khuẩn E. coli: JM109, Top10, DH5α 
cho sản phẩm PCR với một băng DNA với 
kích thước ước tính khoảng 1,4 kb. Các băng 
đều sáng, rõ nét, kích thước này phù hợp theo 
tính toán của chúng tôi khi thiết kế cặp mồi 
nhân gen gdhA. 
Hình 2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm 
PCR nhân gen gdhA: Đường chạy 1: Sản 
phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số tách từ 
chủng JM109, đường chạy 2: Sản phẩm PCR 
với khuôn là DNA tổng số tách từ chủng 
Top10, đường chạy 3: Sản phẩm PCR với 
khuôn là DNA tổng số tách từ chủng DH5α 
Tuy nhiên, để khẳng định chính xác sản 
phẩm thu được là gen gdhA, chúng tôi đã tiến 
hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide 
và so sánh với trình tự gen gdhA trên 
Ecogene. Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 
ngoại lai được xác định trình tự bằng máy giải 
trình tự ABI 3500, sử dụng cặp mồi 
pJET1.2F/R. Kết hợp giữa kết quả giải trình 
tự mồi pJET1.2F và pJET1.2R, chúng tôi thu 
được trình tự đầy đủ của gen gdhA có kích 
thước 1344bp. Kết quả xác định trình tự được 
xử lý bằn phần mềm BioEdit và so sánh trình 
tự này với trình tự tham chiếu trên Ecogene 
(mã số: EG10372), cho thấy gen gdhA phân 
lập được có độ tương đồng 100%. Trình tự 
gen gdhA phân lập được đã được đăng ký trên 
ngân hàng gen với mã số KT124225 (hình 3). 
Như đã đề cập, gdhA là một gen từ vi 
khuẩn, do đó nếu chuyển vào thực vật mà 
không được cải biến sẽ khó có sự biểu hiện 
của protein trong tế bào thực vật chuyển gen. 
Sở dĩ có hiện tượng này là do sự khác biệt 
giữa tỉ lệ nucleotide AT và GC trong bộ gen 
của vi khuẩn và thực vật. Từ đó, một chỉ số 
(CAI-codon adoption index) được đưa ra để 
đánh giá và phân tích độ tương thích của các 
bộ 3 mã hóa codon trong sự biểu hiện của gen 
trong một vật chủ khác loài. Để đánh giá được 
Pham Th ... úc biểu hiện 
mang gen đích gdhA và cấu trúc mang gen 
Hyg là chỉ thị chọn lọc thực vật được thể hiện 
ở hình 6B. 
(A) 
(B) 
Hình 6. (A): Kiểm tra vector biểu hiện thực vật mang gen gdhA: Đường chạy 1: Vector 
pCAMBIA1300 mở vòng với HindIII; Đường chạy 2: Vector pCAMBIA1300 - gdhA cắt với 
HindIII; (B): Sơ đồ vector pCAM/35S-gdhA 
Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang 
vector tái tổ hợp pCAMBIA1300-gdhA 
Hình 7. Kiểm tra sự có mặt gen gdhA trong vi 
khuẩn A. tumefaciens: (+): PCR từ plamid đối 
chứng dương; 1–8: PCR từ các dòng khuẩn 
lạc A. tumefaciens 
Với mục đích chuyển gen vào thực vật, 
các chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 
tái tổ hợp mang các cấu trúc biểu hiện gen 
(Ti-plasmid) được tạo ra bằng phương pháp 
xung điện. Các thể biến nạp sau khi được sàng 
lọc bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung chất 
kháng sinh kanamycin (100 µg/ml) được tiếp 
tục kiểm tra sự có mặt của vector biểu hiện 
gen bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc 
hiệu. Kết quả PCR thể hiện trên hình 7 cho 
thấy một số dòng được lựa chọn cho kết quả 
dương tính với gen gdhA. Kết quả này chứng 
tỏ các dòng vi khuẩn A. tumefaciens đã mang 
vector biểu hiện có chứa gen gdhA. Đây là 
nguồn nguyên liệu sử dụng cho các thí 
nghiệm tiếp theo nhằm chuyển gen gdhA vào 
thực vật. 
Chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình N. 
tabacum K326 
Để kiểm tra sự hiệu quả của việc thiết kế 
vector biểu hiện thực vật mang gen gdhA, thí 
nghiệm chuyển gen gdhA vào cây thuốc lá mô 
hình N. tabacum K326 được thực hiện. Kết 
quả của chuyển gen gdhA vào cây thuốc lá thể 
hiện ở bảng 3. Sau ba lần lây nhiễm, thu được 
20 cây thuốc lá chuyển gen T0. Tất cả các cây 
này được đánh số và kiểm tra sự có mặt của 
gen gdhA bằng kỹ thuật PCR. 
Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E. coli 
 79 
Bảng 3. Kết quả chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình N. tabacum K326 
Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi tái sinh Số cây thu được 
100 74 37 20 
Khi cây đã ra lá mới và phát triển bình 
thường, mẫu lá non của tất cả các cây thuốc lá 
chuyển gen được thu ngẫu nhiên để tách chiết 
DNA tổng số và PCR kiểm tra. Trong nghiên 
cứu này, phản ứng PCR được thực hiện sử 
dụng hai cặp mồi: Cặp mồi Hpt F/R nhân 
đoạn gen mã hoá cho gen chỉ thị kháng 
Hygromycin và cặp mồi nhân gen đích 
gdhABamHIF/NotIR. Kết quả điện di kiểm 
tra sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 8. 
Kết quả điện di cho thấy, khi PCR với cặp 
mồi HptF/R có 4 mẫu: 10, 13, 15 và 18 (tương 
ứng với các đường chạy: 4, 5, 6 và 7 trên gel 
agarose) xuất hiện băng DNA có kích thước 
tương đương với đối chứng dương, trong khi 
đó khi PCR bằng cặp mồi nhân gen đích chỉ 
có 2 mẫu xuất hiện đoạn DNA có kích thước 
tương đương với kích thước sản phẩm PCR 
của mẫu đối chứng dương (mẫu số 15 và 18 
tương ứng với đường chạy số 6 và 7 trên gel 
agarose). Như vậy, có thể khẳng định rằng, 
trong 20 mẫu cây non thu được 2 mẫu mang 
cấu trúc biểu hiện gen gdhA: Số 15 và số 18. 
Các cây dương tính với phản ứng PCR được 
giữ lại, tiếp tục quan sát phục vụ những phân 
tích, đánh giá khả năng hoạt động và biểu hiện 
của gen. 
(A) (B) 
Hình 8. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen T0 bằng 
PCR, (A): PCR kiểm tra bằng cặp mồi nhân gen Hygromycin (HptF/R): (-): PCR từ nước, (+): 
PCR từ plasmid pCAM1300_gdhA; WT: PCR từ DNA tổng số của cây thuốc lá không chuyển 
gen; 1–8: PCR từ DNA tổng số của một số cây thuốc lá chuyển gen gdhA (tương ứng với các 
cây: 1, 4, 7, 10, 13, 15, 18); (B): PCR kiểm tra bằng cặp mồi nhân gen gdhA: (-): PCR từ nước, 
(+): PCR từ plasmid pCAM1300_gdhA; WT: PCR từ DNA tổng số của cây thuốc lá không 
chuyển gen; 1–8: PCR từ DNA tổng số của một số cây thuốc lá chuyển gen gdhA (tương ứng 
với các cây: 1, 4, 7, 10, 13, 15 và 18) 
Hình 9. Kết quả kiểm tra gen gdhA trong cây 
thuốc lá T0 bằng RT-PCR: (+): PCR từ 
plasmid pCAM1300_gdhA; (-): PCR từ nước; 
1–2: RT-PCR từ cDNA của 2 cây thuốc lá 
chuyển gen gdhA 15 và 18 
Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng 
nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều 
cách để giải thích sự có mặt của DNA trong 
mẫu phân tích: (1): Trong các nghiên cứu 
chuyển gen nhờ A. tumefaciens, loài vi khuẩn 
này thường tồn tại lâu dài trong mô tế bào 
thực vật mặc dù đã trả qua quá trình loại bỏ vi 
khuẩn và chọn lọc tế bào thực vật chuyển gen. 
(2): Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào 
chất, có thể biến mất qua sinh sản hữu tính, 
(3): Gen chuyển không biểu hiện thành 
protein có chức năng sinh học. Do đó, kỹ 
thuật RT-PCR được sử dụng để xác định khả 
năng hoạt động của gen gdhA trong các cây 
thuốc lá chuyển gen dương tính với phản ứng 
PCR. Đây là kỹ thuật cho phép phát hiện sự 
biểu hiện của gen chuyển thông qua hoạt động 
phiên mã của gen ngoại lai trong cây thuốc lá 
chuyển gen. Các tổng cây thuốc lá được tách 
chiết RNA số, thực hiện tổng hợp cDNA sợi 
Pham Thi Hang et al. 
 80 
thứ nhất theo bộ kit của hãng Affymetrix và 
sau đó tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 
đặc hiệu gdhABamHIF/gdhANotIR. Sản 
phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 
0,8% (hình 9). 
Kết quả điện di cho thấy, ở cả 2 đường 
chạy đều xuất hiện đoạn DNA với kích thước 
tương đương với kích thước của mẫu đối 
chứng. Như vậy, cả hai cây thuốc lá chuyển 
gen T0 chuyển gen dương tính với PCR đều 
mang gen hoạt động phiên mã tạo sản phẩm 
mRNA. Hai cây thuốc lá chuyển gen gdhA thế 
hệ T0 dương tính với phản ứng RT-PCR được 
tiếp tục theo dõi phục các phân tích tiếp. Các 
nghiên cứu trên thế giới cho thấy năng suất 
của cây trồng bị ảnh hưởng bởi rất nhiều các 
yếu tố khách quan bên ngoài. Một trong số đó 
là hạn hán do ức chế sự phát triển và làm giảm 
quá trình quang hợp ở cây. Lightfoot et al. 
(2007) khi nghiên cứu sự biểu hiện của gen 
gdhA của E. coli mã hoá cho enzyme GDH 
phụ thuộc NADPH trong cây ngô đã chỉ ra 
gen gdhA giúp cây ngô tăng năng suất trong 
một vài năm, đặc biệt trong môi trường stress 
hạn, do đó sự tăng năng suất có thể là do sự 
cải thiện khả năng chịu đựng stress hạn của 
cây ngô chuyển gen gdhA. Các tác giả cũng 
chỉ ra những cây ngô chuyển gen gdhA có khả 
năng chịu được mất nước trong 7 ngày, đồng 
thời khả năng quang hợp của các chuyển gen 
gdhA trong điều kiện hạn cũng không giảm đi 
nhiều trong khi các cây không chuyển gen thì 
quá trình quang hợp bị giảm đáng kể. Hơn 
nữa, nghiên cứu trước đó của Mungur và cộng 
sự (2006) cũng chỉ ra cây thuốc lá chuyển gen 
gdhA có khả năng chịu đựng mất nước tốt hơn 
các cây không chuyển gen. Cơ chế để gen 
gdhA giúp tăng cường khả năng chịu đựng sự 
thiếu nước ở thực vật có thể liên quan đến sự 
thay đổi lượng glutamate hoặc quá trình trao 
đổi chất. Trong các nghiên cứu của Ameziane 
et al. (2000) và Mungur et al. (2005) cho thấy 
ở lá và rễ của các cây thuốc lá chuyển gen 
gdhA nồng độ của hầu hết amino acid tự do 
đều nhiều gấp dôi so với bình thường. Các 
acid amin tăng lên trong cây chuyển gen gdhA 
có thể liên quan đến tăng glutamate, proline 
và arginine là các chất có hiệu quả ảnh hưởng 
đến chất thẩm thấu, điều này có thể giải thích 
một phần trong việc duy trì nước của các cây 
chuyển gen gdhA dưới điều kiện stress nước. 
Tuy nhiên, các ảnh hưởng gián tiếp của sinh 
trưởng và trao đổi chất ảnh hưởng đến khả 
năng chịu đựng thiếu nước là quá trình rất 
phức tạp. GDH-NADPH được biểu hiện trong 
tế bào chất của các cây chuyển gen, trong khi 
các gen nội sinh tổng hợp các enzyme trong tế 
bào chất sau đó được chuyển đến ty thể hoặc 
lục lạp. Các nghiên cứu trong tương lai với 
cây chuyển gen gdhA sẽ tập trung xác định 
xem chất chuyển hoá nào bị thay đổi và những 
chất nào liên quan đến khả năng chống chịu 
mất nước. Như vậy, gen gdhA của E. coli đã 
được cải biến để phù hợp với hệ gen của thực 
vật, khi chuyển gen gdhA cải biến vào cây mô 
hình thuốc lá, đã kiểm tra được sự hoạt động 
của gen gdhA ở mức độ phiên mã. 
KẾT LUẬN 
Trong nghiên cứu này, gen gdhA mã hoá 
cho NADPH-GDH từ chủng E. coli JM109 đã 
được phân lập và tạo dòng thành công. Đồng 
thời, gen gdhA đã được cải biến cho phù hợp 
thực vật và tái tổ hợp thành công trong vector 
biểu hiện pCAMBIA1300 dưới sự điều khiển 
của promoter CaMV35S, tạo được chủng vi 
khuẩn A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp 
này làm nguyên liệu phục vụ chuyển gen thực 
vật. Kết quả chuyển gen gdhA vào cây thuốc 
lá mô hình N. tabacum K326 thu được 20 cây 
tái sinh và khi tiến hành chọn lọc thu được 2 
cây (cây số 15 và cây số 18) có kết quả dương 
tính với PCR bằng cặp mồi nhân gen đích 
gdhABamHIF/gdhANotIR. Sự hoạt động của 
gen gdhA ở mức độ phiên mã trong các cây 
này đã được kiểm chứng với RT-PCR. Kết 
quả bước đầu này cho thấy cấu trúc biểu hiện 
gen gdhA trong vector pCAM/35S-gdhA mà 
chúng tôi thiết kế có thể hoạt động ở cây đích. 
Các thí nghiệm tiếp theo là chuyển gen này 
vào cây đích để kiểm tra sự hoạt động của gen 
gdhA trong cây đích và kiểm tra ở mức độ 
phiên mã, dịch mã và đánh giá tính chịu hạn 
nhân tạo trên cây đích. 
Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện tại 
Viện nghiên cứu hệ gen với kinh phí từ đề tài 
cấp nhà nước “Phân lập thiết kế gen chịu hạn 
phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi 
Chuyển gen cải biến gdhA có nguồn gốc E. coli 
 81 
gen”do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông 
thôn quản lý và một phần từ nguồn kinh phí 
cấp cơ sở. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Abdullah A. Y., Obeidat B. S., Muwalla M. 
M., Matarneh S. K., Ishmais M. A. A., 
2011. Growth performance, carcass and 
meat characteristics of black goat kids fed 
sesame hulls and Prosopis juliflora pods. 
Asian-Aust. J. Anim. Sci., 24(9): 1217–
1226. 
Allen G. Good, Steven T. Zaplachinski, 1994. 
The effects of drought stress on free 
amino acid accumulation and protein 
synthesis in Brassica napus. Physiologia 
Plantarum, 90: 9 –14. 
Ameziane R., Bernhardt K., Lightfoot D. A., 
2000. Expression of the bacterial gdhA 
gene encoding a glutamate dehydrogenase 
in tobacco and corn increased tolerance to 
the phosphinothricin herbicide. Martins-
Loucao MA, Lips SH (eds) Nitrogen in a 
sustainable ecosystem, from the cell to the 
plant. 339–343. 
Ameziane R., Bernhard K., and Lightfoot D., 
2000. Expression of the bacterial gdhA 
gene encoding a NADPH glutamate 
dehydrogenase in tobacco affects plant 
growth and development. Plant and Soil, 
221(1): 47–57. 
Aubert D., Chen L., Moon Y. H., Martin D., 
Castle L. A., Yang C. H., and Sung Z. R., 
2001. EMF1, a novel protein involved in 
the control of shoot architecture and 
flowering in Arabidopsis. The Plant Cell, 
13(8): 1865–1875. 
Battraw M. J., Hall T. C., 1990. 
Histochemical analysis of CaMV 35S 
promoter-β-glucuronidase gene expression 
in transgenic rice plants. Plant Molecular 
Biology, 15: 527–538. 
Belkheiri O., Mulas M., 2013. The effects of 
salt stress on growth, water relations and 
ion accumulation in two halophyte 
Atriplex species. Environmental and 
Experimental Botany, 86: 17–28. 
Dong J. Z., Yang M. Z., Jia S. R., Chua N. H., 
1991. Transformation of melon (Cucumis 
melo L.) and expression from the 
Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter 
in transgenic melon plants. 
BioTechnology, 9: 858–863. 
Forde B. G., and Lea P. J., 2007. Glutamate in 
plants: metabolism, regulation, and 
signalling. J Exp Bot., 58(9): 2339–2358. 
Fry J., Barnason A., Horsch R.B., 1987. 
Transformation of Brassica napus with 
Agrobacterium tumefaciens-based vectors. 
Plant Cell Reports, 6: 321–325. 
Jefferson R. A., Klass M., Wolf N., Hirsh D., 
1987. Expression of chimeric genes in 
Caenorhabditis elegans. J. Mol. Biol., 
193(1): 41–46. 
Lam H. M., Hsieh M. H., Coruzzi G., 1998. 
Reciprocal regulation of distinct 
asparagine synthetase genes by light and 
metabolites in Arabidopsis thaliana. Plant 
J., 16: 345–353. 
Lightfoot D. A., Bernhardt K., Mungur R.; 
Nolte S., Ameziane R., Colter A., Jones 
K., Iqbal M. J., Varsa E. C., Young B. G., 
2007. Improved drought tolerance of 
transgenic Zea mays plants that express 
the glutamate dehydrogenase gene (gdhA) 
of E. coli. Euphytica, 156: 106–115 
Lindsey K., Gallois P., 1990. Transformation 
of sugarbeet (Beta vulgaris L.) by 
Agrobacterium tumefaciens. J. Exp. Bot., 
41: 529–536. 
Loulakakis K. A., Primikirios N. I. 
Nikolantonakis M. A., Roubelakis 
Angelakis K. A., 2002. 
Immunocharacterization of Vitis vinifera 
L. ferredoxin-dependent glutamate 
synthase, and its spatial and temporal 
changes during leaf development. Planta, 
215: 630–638. 
 Mungur R., Glass A. D., Goodenow D.; 
Lightfoot D. A., 2005. Metabolite 
fingerprint changes in transgenic 
Nicotiana tabacum altered by the 
Escherichia coli glutamate dehydrogenase 
gene. J. Biomed Biotech., 198–214. 
Pham Thi Hang et al. 
 82 
Mungur R., Wood A. J., Lightfoot D. A., 
2006. Water potential is maintained 
during water deficit in Nicotiana tabacum 
expressing the Escherichia coli glutamate 
dehydrogenase gene. Plant Growth 
Regulation, 50: 231–238. 
Noctor G., Veljovic-Jovanovic S. D., Driscoll 
S., Novitskaya L., Foyer C. H., 2002. 
Drought and oxidative load in the leaves 
of C3 plants: a predominant role for 
photorespiration. Ann. Bot Lond., 89: 
841–850. 
Odell J. T., Nagy F., Chua N. H., 1985. 
Identification of DNA sequences required 
for activity of the cauliflower mosaic virus 
35S promoter. Nature, 313: 810–812. 
Rhodes C. A., Pierce D. A., Mettler I. J., 
Mascarenhas D., Detmer J. J., 1988. 
Genetically transformed maize plants 
from protoplasts. Science, 240: 204–207. 
Rhodes D., Verslues P. E., Sharp R. E., 1999. 
Role of amino acids in abiotic stress 
resistance. Plant Amino Acids: 
Biochemistry and Biotechnology, 319–356. 
Skopelitis D. S., Paranychianakis N. V., 
Paschalidis K. A., Pliakonis E. D., 
Yakoumakis D., Delis I. D., Kouvarakis 
A., Papadakis A. K., Stephanou E., 
Roubelakis-Angelakis K. A., 2006. Abiotic 
stress generated ROS signal expression of 
anionic glutamate dehydrogenases to form 
glutamate for proline synthesis. Plant Cell., 
18: 2767–2781. 
Stitt M., Muller C., Matt P., Gibon Y., Carillo 
P. ,Morcuende R., Scheible W. R., Krapp 
A., 2002. Steps towards an integrated 
view of nitrogen metabolism. J. Exp. Bot., 
53: 959–970. 
Terada R., Shimamoto K., 1990. Expression 
of CaMV 35S-GUS gene in transgenic 
rice plants. Molecular and General 
Genetics, 220: 389–92. 
Topping J.F. 1998. Tobacco transformation. 
Methods Mol Biol., 81: 365–372. 
Visser R.G., Stolte A., Jacobsen E., 1991. 
Expression of a chimaeric granule-bound 
starch synthase-GUS gene in transgenic 
potato plants. Plant Mol. Biol., 17(4): 
691–699. 
Wooton J. C., 1983. Reassessment of 
ammonium ion affinities of NADP-
specific glutamate dehydrogenases: 
activation of the Neurospora crassa 
enzyme by ammonium and rubidium ions. 
Biochem. J., 209: 527–531. 
Yang N. S., Christou P., 1990. Cell type 
specific expression of a CaMV 35S-gus 
gene in transgenic soybean plants. 
Developmental Genetics, 11: 289–293.