Các phương pháp chuẩn đoán bệnh nhiễm vi sinh vật - Cao Minh Nga

PGS. TS. Cao Minh Nga 
BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP. HCM 
IV 
Mở đầu 
I 
II 
III 
Phương pháp Vi sinh học 
Phương pháp Miễn dịch học 
Phương pháp Sinh học phân tử 
V Kết luận 
I. Mở đầu 
 Vi sinh vật (VSV): - gây nhiều bệnh nhiễm nguy hiểm. 
 - cĩ thể gây dịch, đại dịch. 
 Các bệnh nhiễm VSV: 
 - thường cĩ triệu chứng lâm sàng điển hình 
 VD: bệnh tả, sốt xuất huyết,  
 - một số khác: khơng cĩ triệu chứng điển hình 
 VD: viêm gan virus A, B, C, D, E và G,  
 Xét nghiệm chẩn đốn ( ) đĩng vai trị quan trọng: 
 (+) từng bệnh lý cụ thể 
 là tiêu chuẩn vàng: nhiều bệnh nhiễm VSV 
I. Mở đầu (tt) 
 Các phương pháp (pp) bệnh nhiễm VSV chính: 
 - pp vi sinh học: soi, nhuộm, cấy. 
 - pp miễn dịch học: phản ứng kháng nguyên – kháng thể 
 - pp sinh học phân tử: phát hiện gen đặc hiệu 
 Các pp (sinh hĩa, huyết học, giải phẫu bệnh,  ) 
 Cần chọn lựa pp thích hợp tùy loại bệnh lý, giai đoạn bệnh 
 , theo dõi diễn tiến bệnh nhiễm VSV. 
II. Phương pháp Vi sinh học 
 Quan sát trực tiếp: 
 1. Soi tươi 
 2. Nhuộm 
 Nuơi cấy vi vi khuẩn (VK): 
 1. Nuơi cấy - Phân lập VK 
 2. Kháng sinh đồ 
 Nuơi cấy virus 
 1. Định danh 
 2. Định typ huyết thanh,  
II. PP Vi sinh học (tt) 
 Quan sát trực tiếp: 
 1. Soi tươi: phát hiện VSV cịn sống, di động 
 VD: VK tả, VK giang mai, Leptospira. 
 2. Nhuộm: nhiều pp 
 - nhuộm Gram: quan sát hình thể & cách bắt màu Gram của VK
II. PP Vi sinh học (tt) 
 Quan sát trực tiếp: 
 1. Soi tươi 
 2. Nhuộm: - nhuộm Gram 
 - Nhuộm kháng acid - Nhuộm bạc: 
M. tuberculosis trên phết nhuộm Legionella_Silver_Stain 
II. PP Vi sinh học (tt) 
 Quan sát trực tiếp 
 Nuơi cấy vi khuẩn: 
 1. Nuơi cấy phân lập VK: trên các mơi trường thích hợp 
 Mơi trường BA - S. aureus Mơi trường EMB - E. coli 
II. PP Vi sinh học (tt) 
 Quan sát trực tiếp 
 Nuơi cấy vi khuẩn: 
II. PP Vi sinh học (tt) 
 Quan sát trực tiếp 
 Nuơi cấy vi khuẩn: 
 1. Phân lập VK 
 2. Kháng sinh đồ: 
2.1. Phương pháp khuếch tán 
trên đĩa thạch (Kirby Bauer) 
2.2. Xác định MIC bằng phương pháp pha lỗng 
4 2 1 0,5 0,25 0,12 0 
104 cfu 
mg/ml 
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) = 0,5mg/ml 
(Minimum inhibitory concentration - MIC) 
II. PP Vi sinh học (tt) 
 Quan sát trực tiếp 
 Nuơi cấy vi khuẩn 
 Nuơi cấy virus: 
 Định danh bằng kỹ thuật Miễn dịch hoặc Sinh học phân tử 
II. Phương pháp Miễn dịch học 
Khái niệm 
 Phân loại 
 Các phản ứng miễn dịch (MD) thường dùng 
trong Vi sinh lâm sàng: 1. Phản ứng ngưng kết 
 2. Phản ứng MD đánh dấu: 
 - MD huỳnh quang 
 - ELISA 
 Nhận định kết quả 
II. PP Miễn dịch học (tt) 
 Khái niệm: 
 1. ĐN: Là phản ứng kháng nguyên - kháng thể (KN - KT) 
 2. Mục đích: Xác định hoặc / và 
 - chuẩn độ một KN 
 - định lượng hiệu giá một KT 
 - đo lường một phức hợp KN-KT 
 - đo lường các nhân tố tham gia / hệ thống MD. 
 VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể. 
Kháng nguyên 
• Điểm quyết định KN (epitope): 
phần trên phân tử KN cĩ khả 
năng liên kết đặc hiệu vào phần 
liên kết với KN trên phân tử KT 
Tương tác KN - KT 
Hiện tượng vùng 
II. PP Miễn dịch học (tt) 
 Phân loại: 
A. Phản ứng dựa trên sự tạo thành “hạt”: 
 1. Kết tủa (precipitation reaction): KN hịa tan. 
 2. Ngưng kết (agglutination reaction): KN hữu hình 
B. Phản ứng dựa trên hoạt động sinh học của KT: 
 1. Kết hợp bổ thể (complement binding reaction) 
 2. Trung hịa (neutralization reaction) 
C. Phản ứng MD đánh dấu: 
 1. MD huỳnh quang (immunofluorescence reaction) 
 2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA) 
 3. MD phĩng xạ (radio immmuno assay - RIA). 
Các phản ứng MD cĩ độ nhạy khác nhau 
Loại phản ứng MD Ngưỡng phát hiện (mg/ml) 
Kết tủa / mơi trường lỏng 
Kết tủa / thạch: 
 - khuếch tán đơn (Mancini) 
 - khuếch tán kép (Ouchterlony) 
 - MD điện di (Immuno electrophoresis ) 
20 
10 
3 
50 
Ngưng kết: - trực tiếp 
 - gián tiếp 
 - ngưng kết vi khuẩn 
0,5 
0,001 
0,001 
Cố định bổ thể (CF) 0,1 
Miễn dịch huỳnh quang (IF) 0,1 
Định lượng MD phĩng xạ (RIA) 0,0001 
Định lượng MD enzym (EIA) 0,0001 
II. PP Miễn dịch học (tt) 
 Các phản ứng MD thường dùng / Vi sinh lâm sàng: 
 A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction): 
 - Ngưng kết: nhĩm máu, nhĩm VKĐR,  
 - Latex, ngăn ngưng kết (HI) 
 B. Phản ứng MD đánh dấu: 
 - MDHQ (IF), 
 - ELISA 
II. PP Miễn dịch học (tt) 
A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction) 
Tạo mạng 
Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp 
(thụ động) 
Ngưng kết hồng cầu thụ động 
KN hoặc hapten KT / mẫu 
gắn trên giá khốc 
Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp 
(thụ động) - 2 
Ngưng kết hồng cầu thụ động đảo ngược
 KT / giá khốc KN / mẫu 
Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu 
(Hemagglutination Inhibition - HI) 
II. PP Miễn dịch học (tt) 
B. Phản ứng MD đánh dấu: 
 1. MD huỳnh quang (immunofluorescence - IF) 
 VD: RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae,  
 * Đếm tế bào dịng chảy (flow cytometry): 
 đếm & phân loại TB. 
 2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA). 
 VD: HBV, HCV, HIV, Rubella,  
1. PƯ MD huỳnh quang: nguyên lý 
Định týp virus DEN bằng IF với KT đơn dịng 
(thuốc nhuộm fluorescein) 
Virus sởi tạo hợp bào từ các tế bào Vero bị nhiễm. 
Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi đã biết 
(thuốc nhuộm rhodamin) 
2. Phản ứng ELISA 
 (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ) 
* Mục đích: 
 định lượng KN hoặc KT hòa tan / dịch sinh học. 
* Nguyên lý cơ bản: 
 KT/pha rắn + KN/mẫu + KT
E 
+ Subtrate 
KN/pha rắn + KT/mẫu + Kháng KT
E 
+ Subtrate 
 màu: So màu (mắt / máy đo OD) 
* Kỹ thuật thực hiện: - "Cạnh tranh” 
 - "Không cạnh tranh" 
ỏ
ỏ
E E E E E H2SO4 
E E E E E 
E E E E E TMB 
a.MD Cạnh tranh ELISA: 
Phản ứng màu tỉ lệ nghịch với nồng độ kháng thể 
b. ELISA theo phương pháp “sandwich” 
c. ELISA “Tĩm bắt”: MAC-ELISA 
 (IgM antibody capture-ELISA) 
Máy đo quang 
Máy ủ Máy rửa 
Kháng IgM 
IgM /mẫu 
KN đã biết 
Cộng hợp 
Cơ chất 
Đo Mật độ quang (OD) 
II. PP Miễn dịch học (tt) 
 Nhận định kết quả: 
1. Độ nhạy (ngưỡng phát hiện hàm lượng KN & KT): 
 Mỗi phản ứng cĩ ngưỡng phát hiện nhau 
 nên định lượng. 
2. Hiệu giá ranh giới: ranh giới giữa bình thường & bệnh lý. 
 VD: hiệu giá ranh giới của ASLO là 1:200 
 (200 đơn vị/ml huyết thanh) (+) khi 400 đ.v/ml. 
II. PP Miễn dịch học (tt) 
 Nhận định kết quả (tt): 
3. Kết quả (+) tính giả: 
 thường dùng nhiều phản ứng cùng lúc. 
4. Đáp ứng KT: cĩ thay đổi về lớp Ig 
 - IgM: xuất hiện trước 
 - IgG: xuất hiện sau, thay thế nhanh chĩng cho IgM. 
5. Tiến triển của hiệu giá KT trong HTh BN: 
 “huyết thanh kép” 
Schematic diagram representing the course of 
acute rubella infection from the time of initiation 
of the infection by droplet spray 
III. Phương pháp Sinh học phân tử 
 (khuếch đại đoạn gen đặc hiệu) 
Mở đầu: 
 - 1985: Kary Mullis California, USA 
 - 1993: giải Nobel Hóa học 
Ứng dụng kỹ thuật SHPT 
trong chẩn đốn bệnh nhiễm VSV 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Mở đầu: Các kỹ thuật SHPT thơng dụng: 
 1. PCR (Polymerase Chain Reaction) 
 * RT-PCR (Reverse Transcriptation-PCR) 
 * Real-time PCR 
 * Multiplex-PCR 
 * Nested PCR 
 2. Lai phân tử (Dot-Blot) 
 3. Giải trình tự chuỗi 
 (Sequencing) 
 4. RFLP 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Mở đầu (tt): 
 Ứng dụng kỹ thuật SHPT: 
 1. Chẩn đĩan & nghiên cứu vi sinh học (VSH) 
 2. Chẩn đĩan & nghiên cứu di truyền học 
 3. Nghiên cứu & ứng dụng cơng nghệ sinh học 
 4. Giải trình tự bộ gen người & động vật 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Mở đầu 
Ứng dụng trong chẩn đốn ( ) bệnh nhiễm VSV: 
 1. Phát hiện & định lượng VSV gây bệnh 
 2. Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh 
 3. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh 
 4. Xác định kiểu gen của VSV gây bệnh 
 5. Xác định kiểu gen của ký chủ 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 1.1. Phát hiện VSV gây bệnh 
 Xác định tác nhân gây bệnh mới 
 VD: HCV (1989), HGV (1995), virus SARS (2003), . 
 VSV khơng thể hoặc khĩ nuơi cấy thường qui 
 virus: HBV, HCV, HIV, HPV,  
 VK: Chlamydia, Legionella, Mycoplasma,  
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 1.1. Phát hiện VSV gây bệnh (tt) 
 VSV cho KQ chậm / nuơi cấy: M. tuberculosis 
 VSV khĩ nuơi cấy vì cĩ rất ít / BP, đã  KS 
 - Lao thất bại nuơi cấy, 
 - Viêm màng não mủ, lậu đã  KS 
Phát hiện sản phẩm PCR/ lao 
• Điện di trên gel agarose (1,5%) 
• Nhuộm bằng ethidium bromide (10mg%) 
• Đo bằng thang DNA (DNA ladder) 
• Sản phẩm PCR cĩ kích thước 450 bp 
 và/ hoặc 225 bp 
Giếng T: Thang chuẩn 100bp. 
Giếng 1-8: Mẫu (+) MTB. 
Giếng 9-10: Mẫu (-) MTB. 
1 2 3 4 5 T 6 7 8 9 10 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 1.2. Định lượng VSV gây bệnh 
 Đánh giá tình trạng bệnh lý. 
 Vd: HCV, HBV, . 
 Theo dõi điều trị 
 Vd: HCV, HBV, HIV, . 
 Phát hiện sớm sự kháng thuốc trong điều trị 
 Vd: HBV, HIV, . 
 Real-Time PCR 
Là 1 kỹ thuật PCR sử dụng chất huỳnh quang để 
 phát hiện & định lượng 
1 hoặc nhiều trình tự DNA đích trong phản ứng PCR 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 2. Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh 
Gen mã hĩa cho độc tố LT của E. coli 
 Gen mã hĩa cho độc tố SEA, SEB của S. aureus 
 (pp Multiplex PCR) 
 Gen mã hĩa cho độc tố CT của V. cholerae 
 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 3. Xác định kiểu gen (genotype) của VSV gây bệnh 
 Định typ dựa trên trình tự nucleic acid: 
 Sự khác biệt >10% : loại (type) mới 
 2 – 10%: thứ type (subtype) 
 < 2% : biến thể (variant) 
VD: 
- HCV cĩ 6 genotyp (1-6), 
- HPV cĩ hơn 100 genotype,  
* Real-time RT-PCR 
xác định Genotype HCV 
Đọc KQ: 
 Genotype HCV 1 
Mẫu 
Chứng âm 
Nếu mẫu chỉ dương 
tính (cĩ chu kỳ 
ngưỡng vượt qua 
Threshold Position) 
với probe 1 
Reverse Dot-Blot xác định genotype HPV 
• Nguyên lý: 
 - PCR phát hiện HPV-DNA: dùng cặp primer (181 bp) gen 
L1 / HPV genome (trình tự đích) 
 - Lai phân tử: sản phẩm PCR đánh dấu + các mẫu dò đặc 
hiệu cho 24 typ HPV đã cố định sẵn / màng lai nylon 
 + 8 typ Low-risk : 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71 & 81. 
 + 16 typ High-risk: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 
 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82. 
 - Phản ứng tạo màu: khi (+) tính 
Nguyên tắc phương pháp lai Reverse Dot blot 
(Lai phân tử) 
Reverse Dot-Blot xác định genotype HPV 
• Đọc kết quả trên màng lai: 
 Từ sơ đồ các typ trên màng lai trong hộp RDB đã biết 
 => Đọc kết quả: định genotype HPV 
 Ví dụ: 
 Chứng +: Dương tính. 
Mẫu đồng nhiễm type 6, 11, 81, 16, 18, 33, 58, 66, 68. 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 4. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh 
 Lao: PCR phát hiện đột biến (ĐB) 
 - kháng rifamicin / gen rpoB 
 - kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat G) 
 Staphylococcus aureus: 
 Multiplex PCR phát hiện gen kháng methicillin 
 Streptococcus pneumoniae: pp PCR-SSCP 
 khảo sát đột biến kháng penicillin / gene pbp 2X 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 4. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh (tt) 
HBV: phát hiện ĐB kháng Lamivudin, kháng Adefovir,  
 HIV: phát hiện các ĐB kháng thuốc khác nhau. 
 
 pp: Real-Time PCR, PCR-RFLP, Sequencing 
III. PP Sinh học phân tử (tt) 
Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt): 
 5. Xác định kiểu gen của ký chủ 
 VD: Đối với bệnh nhân viêm gan C phát hiện điểm đa 
hình đơn nucleotide (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) 
nằm gần gen IL28B trên nhiễm sắc thể 19 của người. 
 KQ: - Kiểu gen đáp ứng thuốc tốt: đồng hợp tử 
 - Kiểu gen đáp ứng thuốc kém: dị hợp tử 
V. Kết luận 
 Cĩ nhiều pp chẩn đốn xác định bệnh nhiễm VSV. 
 Cần chọn lựa pp chẩn đốn phù hợp với: 
 - tình trạng bệnh lý 
 - mục đích chẩn đốn 
 - điều kiện trang thiết bị, tay nghề của nhân viên 
 - tình hình và nhu cầu thực tiễn 
 Nâng cao hiệu quả: chẩn đốn & điều trị bệnh, 
 kiểm sốt dịch bệnh.