Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 
5 
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN 
CHẤT LƢỢNG SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ 
(Taxus wallichiana Zucc.) 
 Vũ Bình Dương*; Nguyễn Văn Long* 
TÓM TẮT 
Mục tiêu: xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của sinh khối tế bào (SKTB) Thông đỏ 
(Taxus wallichiana). Đối tượng và phương pháp: SKTB Thông đỏ nuôi cấy trong môi trường 
lỏng. Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất lượng chung theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV, 
định tính và định lượng paclitaxel, baccatin III bằng HPLC. Kết quả: đã khảo sát được các chỉ 
tiêu chất lượng của SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm, bao 
gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axít, định tính, định lượng, 
độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất lượng quan trọng là định tính, định lượng paclitaxel 
và baccatin III: hàm lượng paclitaxel không được < 0,03% và baccatin III không được ít hơn 
0,005%. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được TCCS của SKTB Thông đỏ. Với TCCS xây 
dựng được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng của SKTB Thông đỏ thu 
được từ quá trình nuôi cấy sinh khối. 
* Từ khóa: Thông đỏ; Sinh khối tế bào; Tiêu chuẩn chất lượng; Nuôi cấy tế bào. 
Initial Study of the Standardization of Cellmass of Taxus Wallichiana 
Summary 
Objective: Establishment of institutional standard of Taxus wallichiana cellmass. Subjects 
and methods: Taxus wallichiana cellmass which was cultured in liquid media. Evaluate general 
specifications as regulated by Vietnamese Pharmacopoeia IV, qualitative and quantitative 
determination of baccatin III by HPLC. Results: All specification of Taxus wallichiana cellmass 
has been evaluated for standardization. From which, we established the standard criteria of 
Taxus cellmass including: appearance, humidity, total ash, acid-insoluble ash, qualitative, 
quantitative, bacteria count. In which, the most important specifications are qualitative and 
quantitative criteria of paclitaxel and baccatin III: the content of paclitaxel is recommended to be 
not less than 0.03% and baccatin III should be not less than 0.005%. Conclusion: Institutional 
standard of taxus wallichiana cellmass has been established. With the selected criteria, 
the Taxus cellmass can be evaluated for quality control during plant cell biomass production 
process. 
* Key words: Taxus wallichiana; Cellmass; Quality control; Plant cell culture. 
* Học viện Quân y 
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương ([email protected]) 
Ngày nhận bài: 14/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/12/2014 
 Ngày bài báo được đăng: 29/12/2014 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 
6 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 
phân bố ở Cao nguyên Đà Lạt (Lâm Đồng) 
với số lượng cá thể nhỏ. Đây là dược liệu 
ghi trong sách đỏ cần lưu ý bảo vệ [2]. Từ 
Thông đỏ chiết xuất được paclitaxel (biệt 
dược taxol) sử dụng phổ biến và hiệu quả 
trong điều trị nhiều loại ung thư như: ung 
thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư dạ 
dày... Tuy nhiên, việc khai thác Thông đỏ 
tự nhiên để chiết xuất paclitaxel khó đáp 
ứng được nhu cầu điều trị ung thư (do tốc 
độ sinh trưởng chậm, hàm lượng hoạt 
chất thấp). Để khắc phục nhược điểm 
này, bên cạnh việc nghiên cứu nhân 
giống, trồng phát triển nguồn gen cây 
Thông đỏ, công nghệ SKTB thực vật là 
hướng đi mới có triển vọng trong sản xuất 
các hoạt chất từ dược liệu nói chung và 
các loài Thông đỏ nói riêng [3]. Học viện 
Quân y đã nghiên cứu thành công quy 
trình SKTB Thông đỏ ở quy mô phòng thí 
nghiệm để chiết xuất paclitaxel cũng như 
các dẫn chất sử dụng làm nguyên liệu 
bào chế thuốc điều trị ung thư [4]. Để có 
căn cứ cho việc thẩm định quy trình sản 
xuất sinh khối, cũng như sử dụng sản 
phẩm SKTB Thông đỏ cho chiết xuất 
paclitaxel và các hoạt chất được ổn định, 
cần có nghiên cứu về xây dựng tiêu 
chuẩn chất lượng sản phẩm. Chúng tôi 
nghiên cứu đề tài này nhằm: Khảo sát 
xây dựng TCCS SKTB Thông đỏ. 
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG 
PHÁP NGHIÊN CỨU 
1. Nguyên vật liệu và thiết bị. 
Sinh khối tế bào Thông đỏ thu hoạch 
từ nuôi cấy trong môi trường lỏng 
hildebrandt, được rửa sạch, sấy khô (lô 
SH 03/2011); các hóa chất, dung môi hữu 
cơ đạt tiêu chuẩn tinh khiết và tinh khiết 
phân tích; chất chuẩn paclitaxel và baccatin 
III (Sigma). 
Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt (Memmert 
GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG, 
Đức). Máy cất quay (Rotavapor R-200, 
Buchi, Đức); cân phân tích Sartorius (độ 
chính xác 0,1 mg); cân kỹ thuật (độ chính 
xác 0,01 g); máy ly tâm lạnh Universal 320 
(Hettich, Đức); máy lắc siêu âm (Soniclean - 
Úc); sắc ký lỏng hiệu năng cao (Waters - 
2695D, Mỹ) và một số trang thiết bị khác. 
2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 
Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất 
lượng SKTB Thông đỏ theo phương pháp 
chung của DĐVN IV [1] quy định với 
dược liệu gồm: hình thức, độ ẩm, tro toàn 
phần, tro không tan trong axít, độ nhiễm 
khuẩn. 
- Định tính paclitaxel và baccatin III: 
tiến hành định tính bằng phương pháp 
HPLC [5], phân tích sắc ký đồ của mẫu 
thử với dung dịch hỗn hợp 2 chất chuẩn 
và với mẫu Thông đỏ tự nhiên chuẩn. 
- Định lượng paclitaxel và baccatin III: 
bằng phương pháp HPLC đã khảo sát 
trước đó [5] gồm: điều kiện sắc ký: cột 
Luna Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x 
4,6 mm); pha động:acetonitril:nước cất 
(chạy theo chương trình gradient), thể tích 
bơm mẫu (20 µl), detector PDA (238 nm), 
cột Luna (5 m); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút. 
Xử lý mẫu theo quy trình đã khảo sát [5]. 
So sánh diện tích pic của mẫu thử với 
paclitaxel và baccatin III chuẩn. Từ đó 
tính được hàm lượng paclitaxel và baccatin 
III trong mẫu sinh khối. 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 
7 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 
1. Hình thức cảm quan. 
Thấy SKTB Thông đỏ là những khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc, 
không có mùi lạ. 
2. Độ ẩm. 
Cân chính xác 1,000 g SKTB Thông đỏ. Tiến hành theo phương pháp mô tả trong 
phụ lục 9.6 - DĐVN IV. 
Bảng 1: Kết quả xác định độ ẩm trong SKTB Thông đỏ (n = 5). 
g g
1 1,1124 1,0568 5,00 
2 1,1920 1,1429 4,12 
3 1,1154 1,0612 4,86 
4 1,0256 0,9784 4,60 
5 1,0325 0,9827 4,82 
X ± SD 4,68 ± 0,34 
Độ ẩm trong SKTB Thông đỏ là 4,68 ± 0,34%. 
3. Tro toàn phần. 
Cân chính xác 1,500 g sinh khối, tiến hành xác định tro toàn phần theo phương 
pháp mô tả trong phụ lục 9.8 - DĐVN IV. 
Bảng 2: Kết quả xác định tro toàn phần của SKTB Thông đỏ (n = 5). 
 (g) 
 (g) 
1 1,5235 0,0943 7,19 
2 1,5795 0,0979 6,20 
3 1,5987 0,1092 6,83 
4 1,5654 0,1001 6,39 
5 1,5901 0,0976 6,14 
X ± SD 6,35 ± 0,28 
Khối lượng tro toàn phần trong SKTB Thông đỏ là 6,35 ± 0,28%. 
4. Tro không tan trong axít. 
Cân khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở 4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục 
thêm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục 
9.7 - DĐVN IV. 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 
8 
Bảng 3: Kết quả xác định tro không tan trong axít của SKTB Thông đỏ (n = 5). 
g mg
1 1,5235 2,7 0,13 
2 1,5795 2,6 0,12 
3 1,5987 3,3 0,15 
4 1,5654 1,8 0,09 
5 1,5901 2,5 0,09 
X ± SD 0,11 ± 0,02 
Khối lượng tro không tan trong axít trong dược liệu SKTB Thông đỏ là 0,11 ± 0,02%. 
5. Định tính paclitaxel và baccatin III. 
Cân khoảng 500 mg SKTB Thông đỏ và mẫu Thông đỏ tự nhiên. Tiến hành định 
tính paclitaxel và baccatin III theo phương pháp HPLC. 
1
8
.6
2
6
3
1
.1
4
4
A
U
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Minutes
10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
1
8
.6
2
9
3
1
.1
4
9A
U
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Minutes
10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
1
8
.6
5
0
3
1
.1
3
1
A
U
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Minutes
10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn (a), mẫu Thông đỏ tự nhiên (b) và mẫu SKTB Thông đỏ (c). 
a 
b 
c 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 
9 
Đa số các pic xuất hiện trên mẫu 
Thông đỏ tự nhiên đều xuất hiện trên pic 
của mẫu SKTB Thông đỏ. Tại thời điểm 
18,6 phút và 31,1 phút, ở sắc ký đồ mẫu 
SKTB xuất hiện pic giống như các pic của 
mẫu chuẩn baccatin III và paclitaxel. Như 
vậy, trong SKTB Thông đỏ có baccatin III 
và paclitaxel. 
6. Định lƣợng paclitaxel và baccatin III. 
Cân chính xác 500,0 mg SKTB đã 
nghiền mịn cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm 
10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ 1.000 
vòng/phút trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ 
3.000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy 
dịch, SKTB trong ống ly tâm được chiết 
như trên 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml 
methanol. Gộp các dịch ly tâm, chuyển vào 
bình gạn đã có sẵn 25 ml dung dịch natri 
clorid 5%, lắc đều. Loại tạp bằng n-hexan 2 
lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết n-
hexan. Lớp nước được lắc kỹ với 
dicloromethan 4 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp các 
dịch chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat 
khan. Sau khi lọc xong, rửa lớp natri sulfat 
bằng 2 - 3 ml dicloromethan. Gộp các dịch 
lọc và dịch rửa dicloromethan, bốc hơi 
dung môi ở 350C dưới dòng khí nitơ tới 
cắn. Hòa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol. 
Lọc qua màng lọc 0,45 m, được dung dịch 
tiêm sắc ký. 
Bảng 4: Kết quả xác định hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ 
(n = 6). 
mg
mg
KHỐI LƯỢNG 
PACLITAXEL 
(mg) 
KHỐI LƯỢNG 
BACCA TIN III 
(mg) 
1 524,5 4,98 0,1809 0,0363 0,0324 0,0065 
2 498,6 5,04 0,1747 0,0369 0,0270 0,0057 
3 516,7 4,97 0,1743 0,0355 0,0304 0,0062 
4 505,2 4,45 0,1743 0,0361 0,0304 0,0063 
5 501,9 4,69 0,1708 0,0357 0,0277 0,0058 
6 517,4 4,87 0,1742 0,0354 0,0300 0,0061 
X ± SD 
0,1749 ± 0,0030 
0,0360 
± 0,0006 0,0297 ± 0,0018 
0,0061 ± 
0,0003 
Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ lần lượt là 0,0360% và 
0,0061%. 
7. Độ nhiễm khuẩn. 
Bảng 5: Kết quả đánh giá độ nhiễm khuẩn của SKTB Thông đỏ. 
Y ª u c Ç u K Õ t q u ¶ K Õ t l u Ë n 
Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 10
4
/01 g 142 ± 12 Đạt 
Tống số Enterobacteria không quá 500/01 g 94 ± 11 Đạt 
Nấm và mốc không quá 100/01 g 22 ± 2 Đạt 
Không được có Salmonella/10 g Không có Đạt 
Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus 
aureus./01 g 
Không có Đạt 
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 
10 
Độ nhiễm khuẩn của mẫu SKTB Thông 
đỏ đạt mức 4 của DĐVN IV. Đây là mức 
công bố phù hợp cho thuốc, bán thành phẩm 
từ dược liệu. 
Từ các kết quả đánh giá trên, căn cứ vào 
quy định chung của DĐVN IV, chúng tôi đưa 
ra TCCS của SKTB Thông đỏ gồm các chỉ 
tiêu sau: 
- Nguồn gốc: là khối tế bào Thông đỏ 
được tạo ra bằng công nghệ SKTB thực vật 
từ nguồn thân non Thông đỏ tự nhiên (Taxus 
wallichiana Zucc.). SKTB Thông đỏ thu 
hoạch từ hệ thống bioreactor, lọc, rửa, sấy 
khô. 
- Hình thức: khối tế bào khô, xốp, màu 
nâu, không có nấm mốc, không có mùi lạ. 
- Độ ẩm: không quá 12%. 
- Tro toàn phần: không quá 8%. 
- Tro không tan trong axít: không quá 2%. 
- Định tính: phải thể hiện phép thử định 
tính của paclitaxel và baccatin III. 
- Định lượng: 
+ Hàm lượng paclitaxel trong SKTB 
Thông đỏ không < 0,03%. 
+ Hàm lượng baccatin III trong SKTB 
Thông đỏ không < 0,005%. 
- Độ nhiễm khuẩn: đạt mức IV của 
DĐVN IV. 
Bản TCCS đã được Viện Kiểm nghiệm 
Thuốc Trung ương thẩm định. Tiến hành 
kiểm nghiệm mẫu SKTB Thông đỏ theo 
TCCS đã đề xuất. Kết quả mẫu đều đạt các 
chỉ tiêu chất lượng theo bản TCCS đã công 
bố (phiếu kiểm nghiệm số: 42TCH/01 ngày 
11 - 12 - 2011 của Viện Kiểm nghiệm Thuốc 
Trung ương). 
Như vậy, TCCS đã khảo sát được có thể 
sử dụng để kiểm nghiệm, đánh giá 
chất lượng của mẫu SKTB Thông đỏ thu 
được từ quá trình nuôi cấy SKTB. 
KẾT LUẬN 
Đã khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của 
SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu 
chất lượng của sản phẩm, bao gồm: hình 
thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro 
không tan trong axít, định tính, định lượng, 
độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất 
lượng quan trọng là định tính, định lượng 
paclitaxel và baccatin III: hàm lượng 
paclitaxel không được ít hơn 0,03% và 
baccatin III không được < 0,005%. Với các chỉ 
tiêu chất lượng khảo sát được, có thể sử 
dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng 
của SKTB Thông đỏ thu được từ quá trình 
nuôi cấy sinh khối. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam. Nhà xuất 
bản Y học. 2009. 
2. Đỗ Huy Bích và CS. Cây thuốc và động vật 
làm thuốc ở Việt Nam, tập 2. Nhà xuất bản Khoa 
học và Kỹ thuật. 2009, tr.897-900. 
3. Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương. Sản xuất 
thuốc điều trị ung thư paclitaxel từ các loài Thông 
đỏ bằng công nghệ SKTB thực vật. Tạp chí 
Thông tin Y Dược học. 2011, số 8, 9, tr.7-10, 12-
15. 
4. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Phạm 
Văn Hiển, Chử Đức Thành. Nghiên cứu nuôi cấy 
SKTB Thông đỏ Việt Nam trong môi trường lỏng. 
Tạp chí Y - Dược học Quân sự. 2011, 8, tr.7-14. 
5. Vũ Bình Dương, Đào Văn Đôn, Nguyễn 
Văn Long, Nguyễn Thị Thiện, Phạm Thị Thanh 
Hà. Nghiên cứu định lượng các hoạt chất trong 
sinh khối Thông đỏ bằng phương pháp sắc ký 
lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược học. 2010, 9, 
tr.21-24.