Bài giảng Thực hành Vi sinh thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN 
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 
BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HỆ CAO ĐẲNG 
Năm học 2010-2011 
NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM 
Một số vi sinh vật được sử dụng trong các bài thí nghiệm có thể gây bệnh cho người 
và động vật, vì thế các nội qui được ban hành để ngăn ngừa nguy cơ nhiễm bệnh cho 
sinh viên và cán bộ phòng thí nghiệm. Bất kỳ cá nhân nào không tuân thủ tốt các nội qui 
hay gây nguy hại cho người khác đều không được phép vào phòng thí nghiệm. Khi có 
bất kỳ thắc mắc nào cần phải yêu cầu sự hướng dẫn của giáo viên hoặc cán bộ phòng thí 
nghiệm. 
1. Các qui định chung 
+ Sinh viên vào phòng thí nghiệm phải mặc trang phục bảo hộ (áo khoác trắng) có 
bảng tên (thẻ sinh viên) 
+ Sinh viên phải tham dự 100% các buổi thí nghiệm 
+ Sinh viên phải đến đúng giờ, nếu đến trễ quá 15 phút, sinh viên không được phép 
vào phòng thí nghiệm và được xem như vắng mặt không lý do 
+ Nếu vì bất kỳ lý do bất khả kháng nào sinh viên không tham dự được buổi thí 
nghiệm, sinh viên phải báo trước (hoặc vào buổi thí nghiệm) cho cán bộ các trách 
nhiệm 
+ Khi làm hư hỏng các trang thiết bị/dụng cụ của phòng thí nghiệm, sinh viên có 
nghĩa vụ phải hoàn trả lại 
+ Sinh viên phải đọc kỹ bài trước khi vào thí nghiệm và không được mang tài liệu 
thí nghiệm vào phòng 
+ Khi làm đổ/tràn các dung dịch hoặc làm bể dụng cụ thủy tinh phải báo cáo cho 
cán bộ phòng thí nghiệm và xin ý kiến giải quyết. 
+ Sinh viên phải nắm vững các thao tác vô trùng. 
+ Giảm thiểu sự hình thành khí dung khi thao tác. 
+ Rửa tay trước và sau khi thí nghiệm. 
+ Không được ăn/uống/nghe nhạc/đọc sách-báo trong phòng thí nghiệm. 
+ Đọc kỹ các nội qui/qui định có ở cửa phòng thí nghiệm. 
+ Vệ sinh bàn/ghế/kệ và các dụng cụ trước và sau khi thí nghiệm. 
+ Đổ bỏ rác thải đúng qui định. 
+ Không ngậm các đồ dùng (viết, kiếng) trong miệng hay gắn vào tai. 
+ Đọc và ký tên vào các qui định/nội qui để chắc chắn sinh viên đã đọc và hiểu. 
+ Trả đầy đủ dụng cụ sau khi hoàn thành xong bài thí nghiệm. Dụng cụ phải được 
rửa sạch. 
+ Vệ sinh phòng thí nghiệm theo yêu cầu của người phụ trách 
2. Các yêu cầu an toàn 
+ Cột tóc, mặc các phục trang bảo hộ (áo khoác trắng, găng tay chống nhiệt) và 
dùng dụng cụ/thiết bị đúng lúc, đúng nơi. 
+ Nghiêm cấm dùng miệng hút pipette. 
3. Trong các tình huống khẩn cấp 
+ Lưu ý vị trí các trang bị cấp cứu khi cần (dụng cụ y tế, bình cứu hỏa, vòi nước, 
điện thoại và số điện thoại cấp cứu). 
+ Báo cáo các tình huống khẩn cấp ngay lập tức cho giáo viên hướng dẫn hoặc cán 
bộ phòng thí nghiệm. 
+ Bình tĩnh khi có tình huống khẩn cấp. 
PTN Chất lượng Thực phẩm 
PHẦN I: ĐẠI CƯƠNG VỀ VI SINH VẬT HỌC 
Bài 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ 
NGHIỆM VI SINH 
1. Môi trường , pha chế và chuẩn bị môi trường 
1.1. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: 
Để phân lập, nuôi cấy hay bảo quản giống vi sinh vật, người ta phải sử dụng các 
môi trường dinh dưỡng đặc (hoặc lỏng). Môi trường dinh dưỡng không chỉ chứa các 
thành phần cần cho sự phát triển của ví sinh vật mà còn phải đảm bảo các điều kiện lý 
hóa thích hợp cho sự trao đổi chất của vi sinh vật với môi trường bên ngoài. 
Vì vậy, để thiết lập môi trường cần phải biết rõ nhu cầu của vi sinh vật về các chất 
dinh dưỡng và các đặc điểm trao đổi chất của chúng. Cần lưu ý là nồng độ các chất hòa 
tan trong môi trường phải cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào vi sinh vật thì mới đảm 
bảo được sự phát triển tối ưu của chúng 
Môi trường thường đặt tên theo người đã sáng tạo ra chúng (ví dụ môi trường 
Kzapek, môi trường Hansen) hay theo các thành phần dinh dưỡng đặc trưng của môi 
trường đó (ví dụ môi trường dịch trích giá đậu, khoai tây) 
1.2. Nguyên tắc pha chế môi trường: 
Nguyên tắc cơ bản nhất để pha chế môi trường là phải đảm bảo các nhu cầu cơ bản 
của vi sinh vật (nguồn C, N và các khoáng). Ngoài ra còn có một số nguyên tắc sau: 
a. Tùy theo nhu cầu nghiên cứu hay học tập mà pha chế môi trường phù hợp: 
- Nếu muốn nuôi cấy vi sinh vật để quan sát hình thái thì phải nuôi cấy trên 
môi trường đặc 
- Nếu muốn tìm hiểu sự trao đổi chất của vi sinh vật thi dùng môi trường 
lỏng 
- Môi trường chỉ chưa cao thịt, pepton dùng nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh 
b. Tùy vào nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt của vi sinh vật để bổ sung thành phần khác 
nhau nào đó: 
- Cần nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose cần bổ sung cellulose vào môi 
trường 
- Cần nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa N, cần bổ sung các hợp chất chứa N 
vào môi trường 
- Hay bổ sung các kháng sinh vào môi trường nhằm nuôi cấy các vi sinh vật 
có khả năng kháng lại kháng sinh 
1.3. Phân loại môi trường 
i. Dựa vào thành phần 
- Môi trường tự nhiên: Các loại môi trường là các hợp chất tự nhiên như: 
khoai tây, cám gạo, bã khoai mì, phế phẩm chế biến thịt, dịch sữathành 
phần môi trường thường phức tạp và không ổn định 
- Môi trường tổng hợp: sử dụng các loại hóa chất hữu cơ hoặc vô cơ tinh 
khiết để pha chế môi trường với tỷ lệ chính xác 
- Môi trường bán tổng hợp: sử dụng cả các hóa chất tinh khiết lẫn các thành 
phần tự nhiên. 
ii. Dựa vào tính chất vật lý 
- Môi trường lỏng 
- Môi trường rắn: thường có từ 1,5-2% agar hoặc gelatine 
- Môi trường bán lỏng: có khoảng 0,3-0,7% agar 
iii. Dựa vào công dụng: 
- Môi trường đặc trưng hay chọn lọc: môi trường có chứa một thành phần 
đặc biệt chỉ phù hợp với 1 hoặc 1 nhóm vi sinh vật nào đó. Ví dụ môi 
trường dùng để phân lập vi sinh vật chuyển hóa đạm, chuyển hóa lân 
- Môi trường kiểm định: dùng để xác định một tính chất nào đó của vi sinh 
vật. Người ta thương bổ sung một hợp chất đặc biệt có sự biến đổi có thể 
nhìn thấy được trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật như các chất chỉ thị 
màu. 
1.4. Cách pha chế môi trường 
Pha chế môi trường là một khâu quan trọng do vậy cần phải chính xác. Gồm các 
bước sau: 
- Cân các thành phần môi trường 
- Nếu là môi trường lỏng: pha các thành phần vào nước, chú ý thứ tự pha 
chế 
- Nếu là môi trường đặc: hòa tan các thành phần vào nước rồi thêm 1,5-2% 
agar và đun đến khi agar tan chảy. 
- Lọc: thường lọc môi trường qua vải hoặc bông 
- Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật hoặc yêu cầu nghiên cứu, thường 
điều chỉnh pH phù hợp. Thường dùng các loại hóa chất như: H2SO4, 
H3PO4, KOH, NaOH 
- Phân phối vào dụng cụ chứa: nếu là bình chứa thì cho vào khoảng 2/3 thể 
tích bình, nếu là làm môi trường thạch dĩa thì cho vào khoảng 10-15ml/dĩa, 
nếu làm thạch nghiêng thì cho vào 1/4-1/5 chiều cao ống nghiệm. 
- Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu là nhiệt ẩm với 
áp suất cao (121oC, 1atm) nhằm tiêu diệt tất cả các bào tử cũng như các vi 
sinh vật không mong muốn có sẵn trong môi trường . 
Thực hiện pha chế môi trường 
 Mỗi nhóm thực hành pha chế hai môi trường dùng để nuôi cấy vi sinh vật như 
sau: 
 - Môi trường 1 (môi trường dịch trích giá đậu): 
 + Giá đậu: 200g 
 + Glucose: 10g 
 + Trypton: 5g 
 + Yeast extract: 1g 
 + Agar: 15g 
 + H2O: đủ 1000 ml 
 - Môi trường 2 (Môi trường dịch trích khoai tây): 
 + Khoai tây: 200g 
 + Saccharose: 50g 
 + Pepton: 5g 
 + Yeast extract: 1g 
 + Agar: 20g 
 + H2O: đủ 1000 ml 
Cách thực hiện: giá đậu hoặc khoai tây đun với H2O để sôi trong 20 phút, lọc lấy 
dịch trong, bổ sung các thành phần còn lại. Sau đó tiếp tục đun đến khi agar tan hoàn 
toàn. Phân phối vào các bình chứa và đem tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. 
2. Các dụng cụ sử dụng trong vi sinh vật học 
2.1. Dụng cụ dùng cấy chuyền 
Các loại dụng cụ được sử dụng cấy chuyền đều nhằm mục mục đích chuyển vi 
sinh vật từ môi trường cũ sang một môi trường mới cho các nhu cầu khác nhau: cấy 
chuyền, nhân giống, phân lập vi sinh vật. 
Tất cả các dụng cụ dùng cấy chuyền đều phải đảm bảo được vô trùng bằng nhiều 
cách khác nhau, nhằm tránh việc đưa vào môi trường những vi sinh vật không mong 
muốn. thường sử dụng phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô 140-150oC trong ít nhất 1 
giờ. Các dụng cụ kể trên đều chủ yếu dùng chuyển đổi vi sinh vật từ một môi trường 
lỏng sang môi trường khác. Để chuyển vi sinh vật từ môi trường rắn sang môi trường 
khác, người ta chủ yếu sử dụng que cấy vòng/ thẳng hoặc que cấy móc. 
Que cấy thẳng (a) và que cấy vòng (b) 
Khi sử dụng que cấy, thường que cấy sẽ được tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn 
hoặc đèn Bunsel. Khi tiệt trùng phải đảm bảo đầu que cấy hoặc bất cứ thành phần nào 
của que cấy phải được tiệt trùng hoàn toàn bằng cách đốt nóng đỏ. 
2.2. Các phương pháp phân lập và cấy chuyền vi vi sinh vật: 
Phân lập vi sinh vật là việc phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự 
nhiên và cô lập chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích 
khác nhau. Để phân lập vi sinh vật, người ta thường tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trên 
các môi trường chọn lọc nhằm ưu tiên sự phát triển của một loại vi sinh vật nào đó. 
Nếu như không có được môi trường đặc trưng thì thường người ta sẽ nuôi vi sinh 
trên các môi trường rắn và làm cách nào đó tách rời các tế bào vi sinh vật và cho chúng 
phát triển riêng rẽ trên môi trường rắn để tạo thành khuẩn lạc (colony) với hình dáng đặc 
trưng và việc chọn lựa sẽ được tiến hành trên các khuẩn lạc này. 
Một số hình dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường rắn: hàng 1 (nhìn từ trên xuống), 
hàng 2 (nhìn ngang), hàng 3 (dạng rìa khuẩn lạc) 
Các phương pháp cấy 
Cách cấy trong ống thạch nghiêng 
 Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy vòng 
Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que trãi 
Các thao tác chính khi cấy ví sinh vật 
Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, dễ chọn lựa 
Thực hành: 
Sử dụng môi trường đã pha chế ở phần trên, tiến hành làm các dạng môi trường 
thạch đĩa, thạch nghiêng và tiến hành cấy một số giống vi sinh vật do phòng thí nghiệm 
cung cấp. Nuôi ủ ở nhiệt độ thích hợp và đánh giá kết quả sau 48 giờ nuôi cấy. 
Bài 2:KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG 
Một kính hiển vi tốt là một dụng cụ rất quan trọng trong phòng thí nghiệm vi sinh. 
Có nhiều loại kính hiển vi khác nhau, trong đó loại thường dùng nhất là kính hiển vi 
quang học nền sáng (bright-field light microscope). Kính hiển vi này có nhiều thấu kính 
và có một nguồn ánh sáng trắng. Chúng phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ bé như 
vi khuẩn và các vi sinh vật khác mà chúng ta không thể nhìn thấy bằng mắt thường. 
Kính hiển vi loại này sẽ được chúng ta sử dụng trong toàn bộ môn học này. Nếu sử dụng 
thành thạo kính hiển vi, sinh viên có thể thu nhận được những thông tin chính xác và 
hữu ích về các tiêu bản hoặc mẫu nuôi cấy vi sinh vật. Việc nghiên cứu trong phòng thí 
nghiệm với kính hiển vi sẽ giúp cho chúng ta có được những ấn tượng sâu sắc về các 
hình thái rất nhỏ bé của sự sống, những hình thái chỉ quan sát được khi chúng được 
phóng đại nhiều lần. 
1. Các bộ phận chủ yếu của kính hiển vi quang học nền sáng và chức năng của 
chúng 
a. Hãy nhìn vào kính hiển vi trước mặt và so sánh nó với hình vẽ. Kính hiển vi được 
đặt trên một chân đế (base) vững chắc và có một bộ phận tay cầm (arm) để chúng 
ta có thể di chuyển kính hiển vi đến vị trí khác (Lưu ý: khi cầm hoặc mang kính 
hiển vi đi nơi khác, luôn phải sử dụng cả hai tay; một tay nắm lấy bộ phần tay 
cầm trong khi tay khác đỡ vào chân đế). Không bao giờ được nhấc kính lên bằng 
cách nắm vào các thấu kính. 
b. Hãy nhìn vào bàn chứa tiêu bản, chúng nằm giữa hệ các thấu kính bên trên và 
một bộ phận cung cấp ánh sáng bên dưới. Bàn chứa tiêu bản có một lỗ tròn ở vị 
trí trung tâm. Nó cho phép ánh sáng từ bên dưới đi xuyên qua và đến được các 
thấu kính bên trên. Tiêu bản cần quan sát sẽ được đặt trên bàn chứa tiêu bản, nơi 
mà có ánh sáng chiếu từ bên dưới tới. Lưu ý đến núm điều chỉnh bên cạnh bàn 
chứa tiêu bản, chúng dùng để di chuyển tiêu bản qua trái/phải hoặc trước/sau trên 
bàn chứa tiêu bản . Bàn chứa tiêu bản loại này gọi là bàn chứa tiêu bản cơ khí 
(mechanical stage) 
c. Một đèn chiếu được đặt trong chân đế. Anh sáng sẽ đi xuyên qua tụ quang Abbe 
(Abbe condenser). Tụ quang có chứa các thấu kính. Chúng có tác dụng tập trung 
các tia sáng vào tiêu bản. Tụ quang có cửa sập (iris diaphragm, shutter) dùng để 
điều chỉnh lượng ánh sáng. Một thanh gạt (rotating knob) được gắn kèm theo để 
điều chỉnh cửa sập. Tụ quang có thể được nâng lên hay hạ xuống nhờ một núm 
điều chỉnh (adjustment knob). Khi hạ kính tụ quang xuống sẽ làm giảm lượng tia 
sáng chiếu vào tiêu bản (điều này thường không được thực hiện khi nghiên cứu vi 
sinh vật). Cách tốt nhất là giữ tụ quang ở vị trí cao nhất và chỉ điều chỉnh lượng 
sáng bằng cách đóng/mở cửa sập. 
d. Phía trên bàn chứa tiêu bản, được gắn với tay cầm, là một ống tròn (tube) có các 
thấu kính phóng đại. Bên dưới ống tròn là một cổ xoay (rotating nosepiece) được 
gắn với ba hay bốn vật kính (objective lenses). Khi xoay cổ xoay, một trong số 
các vật kính sẽ được đặt đúng vào vị trí lỗ tròn trên bàn chứa tiêu bản. Bên trên 
ống tròn là thị kính (ocular lens, eyepiece) (kính hiển vi có thể có một thị kính, 
loại hai thị kính cho phép chúng ta có thể nhìn bằng cả hai mắt). 
e. Tùy loại kính hiển vi đang sử dụng mà cổ xoay và bàn chứa tiêu bản có thể được 
nâng lên hay hạ xuống bằng núm sơ cấp (coarse adjustment knob) và núm thứ 
cấp (fine adjustment knob). Trong một số loại kính hiển vi, chúng được đặt tại hai 
vị trí riêng hoặc sẽ được đặt cái này bên trên cái kia. Khi sử dụng phải vặn nút sơ 
cấp một cách nhẹ nhàng để nâng hoặc hạ bàn chứa tiêu bản. Đầu tiên, điều chỉnh 
cho bàn chứa tiêu bản được nâng lên tối đa gần sát với vật kính, đồng thời phải 
đưa mắt nhìn từ phía bên ngoài để tránh việc vật kính đâm thủng tiêu bản, từ đó 
làm hỏng vật kính. Nút thứ cấp sẽ làm di chuyển bàn chứa tiêu bản một cách rất 
chậm chạp vì vậy không thể thấy sự di chuyển này khi nhìn bên ngoài. Ta sử 
dụng nút thứ cấp khi mắt đang nhìn vào thị kính và điều chỉnh nhẹ nhàng để 
chỉnh rõ nét ảnh đang quan sát. 
f. Lưu ý chỉ được hạ bàn chứa mẫu vật đi xuống khi đưa mắt vào quan sát ở thị kính 
để tránh trường hợp vật kính đâm thủng tiêu bản; chỉ khi người kỹ thuật viên 
quan sát từ bên ngoài mới cho phép nâng bàn chứa tiêu bản lên 
g. Khi xoay nút thứ cấp quá nhanh có thể làm cho nút xoay bị kẹt cứng, khi đó 
không được cố xoay tiếp mà phải thông báo ngay cho giáo viên hướng dẫn. 
h. Tổng số lần phóng đại tùy thuộc vào vật kính và thị kính đang dùng. Nhìn vào thị 
kính, sinh viên sẽ thấy một ký hiệu “10X”, có nghĩa là phóng đại 10 lần. Nhìn vào 
các vật kính sẽ thấy ký hiệu “4X”, “10X”, “40X” và “100X”, tương ứng với độ 
phóng đại 4, 10, 40, và 100 lần. Vật kính low-power còn được gọi là vật kính 10x 
hay 16mm. Vật kính high-dry (high-power) còn được gọi là vật kính 40x hay 
4mm. Vật kính dầu còn gọi là vật kính 90x, 100x hay 1.8mm. Khi độ phóng đại 
tăng, kích thước của đầu vật kính sẽ nhỏ dần và cho phép ít ánh sáng đi qua. Đó 
là lý do mà sinh viên cần phải điều chỉnh vị trí của tụ quang và cửa sập chắn sáng 
khi dùng các vật kính khác nhau để có thể nhìn tiêu bản được rõ ràng hơn. Tụ 
quang tập trung ánh sáng lên một vùng nhỏ bên trên bàn chứa tiêu bản, còn cửa 
sập điều chỉnh lượng sáng đi vào tụ quang. Kh ...  nhiệt độ và thời gian thích hợp. 
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định 
trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục). Ghi nhận số 
lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa 
vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100 
ml, MPN/1 g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp 
lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị 
số vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu 
kiến thích hợp. Ví dụ, môi trường BGBL ở 37oC có thể định lượng nhóm coliforms, 
cùng môi trường này ở 45oC cho phép định lượng coliforms phân hoặc môi trường 
Mannitol Salt Broth có thể dùng để định lượng Staphylococcus 
3. Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN 
Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi 
ống chứa 10 ml môi trường LST và ống Durham úp ngược. Thực hiện tương tự với dịch 
mẫu đã pha loãng 10-2, 10-3 đến 10-10Ủ ống nghiệm trong 48 giờ ở 37oC. Ống dương 
tính là ống có sinh khí bọt khí trong ống Durham). Ghi nhận số ống dương tính. 
Thử nghiệm khẳng định: dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LST 
dương tính sang các ống chứa môi trường BGBL và ủ ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số 
ống dương tính ứng với mỗi độ pha loãng 
Lưu ý: cần loại bỏ các ống nghiệm có chứa bọt khí trong ống Durham sau khi tiệt trùng 
môi trường. Các ống có khả năng hiện diện của Coliforms là các ống dương tính ở cả 
môi trường LST lẫn BGBL. 
 Các thao tác chính 
4. Lựa chọn các độ pha loãng để tính kết quả 
Mỗi mẫu kiểm nghiệm chọn 3 độ pha loãng liên tiếp ứng với 1 trong 3 trường hợp sau 
sao cho thích hợp. Tiến hành thứ tự theo các trường hợp và các bước (a, b,c) sau: 
Trường hợp 1 
a. Chọn độ pha loãng cao nhất (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho 
3 ống dương tính, cùng với hai độ pha loãng cao hơn tiếp theo (tức là độ pha 
loãng này có nồng độ mẫu là 1/10 và 1/100 của độ pha loãng thứ nhất đã được 
chọn (xem ví du) 
b. Xem trường hợp 3 
c. Nếu các dịch pha loãng tiếp theo ngoài dịch pha loãng cao nhất cũng cho 3 ống 
dương tính thì chọn tiếp 3 độ pha loãng cao nhất trong cả dãy (tức là những độ 
pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) (xem bảng 1, ví dụ 2) 
Trường hợp 2 
a. Nếu trường hợp 1 không thể áp dụng, chọn 3 độ pha loãng cao nhất trong cả dãy 
(tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất), trong số đó ít nhất thu 
được 1 kết quả dương tính (xem bảng 1, ví dụ 3) 
b. Xem trường hợp 3 
Trường hợp 3 (trường hợp đặc biệt) 
Trong tất cả các trường hợp, khi có nhiều hơn một trong 3 độ pha loãng được 
chọn theo trường hợp 1 và 2 không có ống dương tính, thì hãy chọn độ pha loãng nào có 
độ pha loãng thấp nhất không có các ống dương tính (tức là độ pha loãng có nồng độ 
mẫu cao nhất) và 2 độ pha loãng thấp hơn kế tiếp trong dãy pha loãng (tức là có nồng độ 
mẫu gấp 10 lần và 100 lần độ pha loãng thứ nhất đã chọn), (xem bảng 1, ví dụ 4 & 5), 
trừ khi các ống dương tính chỉ tìm thấy ở mức pha loãng đầu tiên được chuẩn bị từ mẫu 
thử. Trong trường hợp cuối cùng này, cần chọn ra 3 độ pha loãng đầu tiên để tính MPN, 
thậm chí loạt ống này bao gồm 2 độ pha loãng không có ống dương tính nào 
Ví dụ lựa chọn các kết quả dương tính đối với việc tính toán MPN 
5. Xác định chỉ số MPN 
Sử dụng kết quả của phần 4. để tra bảng 2 
Kết quả (MPN/ml) = kết quả trang bảng x f/10 
f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n) 
Ví dụ 
Bảng tra MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp 
BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP TẾ BÀO VI SINH VẬT 
1. Định lượng trực tiếp tế bào bằng buồng đếm 
Có thể sử dụng buồng đếm để định lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như 
nấm men, bào tử nấm mốcvới độ phóng đại x100 đến x400. Với tế bào vi khuẩn, do 
kích thước nhỏ, nên phải sử dụng buồng đếm Petroff-Hasser. Phương pháp đếm trực tiếp 
còn giúp quan sát được hình thái tế bàoKết quả đếm được là tổng số tế bào có trong 
mẫu, không phân biệt được tế bào còn sống hay tế bào chết (chỉ phân biệt tế bào nấm 
men chết khi tiến hành nhuộm với dung dịch methylen blue ) 
2. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 
Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm 
phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 400 ô vuông nhỏ có diện tích tổng cộng là 1mm2.Bao 
gồm 25 ô vuông lớn; mỗi ô vuông lớn này gồm có 16 ô vuông nhỏ. Vì thế, diện tích một 
hình vuông nhỏ là 1/400 mm2 và một hình vuông lớn là 1/25 mm2. 
3. Cách tiến hành 
a. Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật sao cho trong mỗi ô lớn chỉ từ 10 – 50 tế 
bào). 
b. Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào (đã pha loãng), dùng pippet Pasteur để hút dịch 
2. huyền phù này. 
3. Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng 
4. Nhẹ nhàng dùng đầu pippet (chứa một giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh 
buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng 
đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng 
không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, 
còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt. 
5. Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó, 
dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0.1mm 
6. Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm. Chỉnh 
thật rõ, sau đó chuyển qua vật kính x40 để đếm 
7. Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào 
lẫn các đường kẻ. Tuỳ vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế 
bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại 
diện. Thông thường ta chọn 1 ô trung tâm và 4 ô nằm ngoài bìa hoặc 5 ô theo 
đường chéo (các ô đánh dấu X) 
8. Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 – 5 phút; phải đếm các tế bào nằm 
trên 2 đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô. 
PHẦN 3: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ 
BIẾN THỰC PHẨM 
Bài 1: LÊN MEN RƯỢU VANG QUẢ 
1. Giới thiệu: 
Danh từ rượu vang quả được dùng để chỉ loại rượu được lên men từ dịch ép trái 
cây (nho, dâu, thơm, táo...) của một số chủng nấm men. Rượu vang quả thu được không 
qua chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, có độ cồn nhẹ (10 – 15%) 
là loại nước giải khát thơm ngon, giàu chất bổ dưỡng, đặt biệt rất thích hợp đối với phụ 
nữ. Tùy theo lượng đường khử còn lại trong rượu vang sau khi lên men xong, người ta 
phân biệt: (a) rượu vang khô: 10 g đường/l, (b) nửa khô: 20 – 30 g đường/l, (c) nữa ngọt: 
45 g đường/l, và (d) rượu ngọt: 80 – 110 g đường/l. Trong rượu vang có chứa các acid 
hữu cơ và vô cơ (acid tartric, acid malic, acidcitric, acid oxalic...). pH của rượu vang 
khoảng từ 2.9 – 3.9. 
2. Qui trình thí nghiệm 
1. Rửa sạch quả (2~3kg) 
2. Làm dập quả (nho,...) hoặc xay dập (thơm, xoài,...) hoặc cắt thành lát mỏng. 
Với chuối, nên tiến hành xắt lát và sấy khô trước đó. Với các loại quả khác, ta 
xay dập, vắt lấy nước quả bằng túi vải lọc. 
3. Cho quả (hoặc dịch quả) vào trong hũ plastic loại 5 L đã rửa sạch (chọn loại có 
nắp vặn chắc). 
4. Bổ sung thêm nước (1~2 L) sao cho đạt 2/3 thể tích bình chứa. 
5. Bổ sung đường cát trắng sao cho dung dịch đạt nồng độ chất khô 25oBx (khuấy 
đều để đường tan hoàn toàn). 
6. Điều chỉnh về pH 5.0 (sử dụng giấy quỳ tím và acid citric). 
7. Bổ sung môi trường chứa huyền phù Saccharomyces oviformis đã qua nhân 
giống trong 30oC /48 giờ với thể tích phù hợp 
8. Kết thúc quá trình lên men chính khi nồng độ chất khô không tiếp tục giảm và 
hầu như không có sự hình thành bọt khí trong bình lên men (khoảng 5 –7 ngày). 
Ta có được rượu non 
9. Lọc bỏ xác quả bằng vải lọc thưa. 
10. Tiến hành quá trình lên men phụ trong các chai plastic (chai pet loại 1.25–1.50 
L) ở nhiệt độ 15 – 18oC (ngăn mát tủ lạnh). Thỉnh thoảng mở hé nắp vặn để xả 
bớt lượng khí CO2 tích lũy trong chai (phòng tránh phồng/nổ chai) 
11. Sau 7 ngày, lọc bỏ cặn nhiều lần (qua bông gòn loại thấm nước) để có được 
rượu sống. 
12. Tiếp tục ủ chín trong các chai plastic như trên ở 15 – 18oC với thời gian vài 
tháng để có được rượu vang chín. 
Gợi ý: tùy điều kiện, sinh viên có thể dùng 100% dịch quả (không bổ sung thêm 
nước) để có được hương vị của rượu tốt hơn. Để có được loại rượu với hương vị tốt, 
sinh viên nên sử dụng nho và thơm để làm thí nghiệm. Sinh viên có thể sử dụng rượu 
sống hoặc tiếp tục ủ chín để có rượu vang chín với hương vị tốt hơn 
3. Theo dõi quá trình lên men qua một số chỉ tiêu sau 
Trong giai đoạn lên men chính: 
a. Nồng độ chất khô (oBx): kiểm tra 2 ngày/lần. 
b. pH. 
c. Sự tạo thành bọt khí bên trong hũ nhựa (ghi nhận kết quả quan sát được). 
d. Độ cồn: mẫu rượu sau khi kết thúc lên men chính được chưng cất và xác định độ 
cồn bằng phương pháp chuẩn độ (hoặc phương pháp dùng bình tỉ trọng). 
Các kết quả được ghi nhận vào bảng biểu và được vẽ đồ thị theo thời gian. 
. 
Bài 2: LÊN MEN GIẤM 
1. Giới thiệu: 
Theo khái niệm của Tổ Chức Nông Lương Thế Giới (FAO), giấm được định 
nghĩa như sau: “Giấm (vinegar) là dung dịch acid loãng mà con người có thể sử dụng 
được thông qua đường tiêu hóa. Giấm phải được sản xuất từ những nguyên liệu có 
nguồn gốc từ nông nghiệp chứa tinh bột, đường, đầu tiên bằng quá lên men chuyển 
đường thành rượu sau đó tiếp tục lên men acetic chuyển rượu thành acid acetic (thành 
phần chủ yếu của giấm)”. Đây là khái niệm được sử dụng phổ biến nhất trên thế giới cho 
tới ngày nay. 
Một số ứng dụng quan trọng của giấm trong công nghệ thực phẩm là: 
− Chất gia vị làm tăng giá trị cảm quan của một số sản phẩm thực phẩm như: xốt, tương 
cà, tương ớt, mayonaise, salad trộn, rau dầm giấm (dưa chuột dầm giấm, rau cải dầm 
giấm, hành dầm giấm, hương thảo dầm giấm) 
− Phụ gia bảo quản, khử mùi tanh của thịt cá trước khi chế biến. 
Ngày nay, giấm đang được đa dạng hóa từ nhiều nguyên liệu khác nhau. Ở Nhật, ngoài 
vai trò tăng giá trị cảm quan, người ta còn sản xuất một số loại giấm chức năng như 
giấm từ gạo lức giàu acid amin, giấm từ củ hành giàu acid amin, K, Mg. Hàng năm, trên 
thế giới, sản lượng giấm tiêu thụ là rất lớn. 
2. Quy trình thử nghiệm 
i. Tiến hành làm rượu vang quả (dứa, nho) hoặc rượu gạo, rượu nếp than, rượu từ 
dịch chiết malt  để thu được rượu non. 
ii. Lọc bỏ bã bằng vải lọc 
iii. Hiệu chỉnh nồng độ rượu về 5% bằng nước 
iv. Bổ sung giống vi khuẩn Acetobacter aceti với tỉ lệ 10% - 30%. 
v. Cho phần rượu non đã bổ sung giống vi khuẩn đã lọc vào hũ (nhựa hoặc thủy 
tinh) sao cho phần rượu chiếm 50 – 70% thể tích vật chứa. Lưu ý, sau khi bổ sung 
giống nồng độ acid của dịch lên men phải đạt tối thiểu 0.5% (tính theo acid 
acetic), nếu chưa đạt phải hiệu chỉnh bằng acid acetic 
vi. Để yên trong khoảng 1 tháng. Hàng ngày mở nắp hũ chứa một lần trong khoảng 
thời gian 1 – 2 phút. Tuyệt đối không được lắc hũ chứa hoặc làm cho lớp váng 
mỏng bị vỡ hay chìm xuống 
vii. Kiểm tra độ acid định kỳ hàng tuần. Nếu đạt nồng độ acid acetic >4.5% là đạt yêu 
cầu. Ta thu được giấm non. 
viii. Lọc kỹ qua một lớp bông gòn thấm nước hoặc ly tâm 5000 rpm trong 15 phút 
ix. Cho vào chai thủy tinh và đóng nắp sau đó tiến hành thanh trùng 80 – 90oC (đun 
cách thủy) trong 15 – 30 phút 
x. Để có được loại giấm ngon ta có thể tiếp tục ủ chín giấm non ở điều kiện 30oC 
trong 1 – 2 tháng tiếp theo. Sau đó, lọc, đóng chai và thanh trùng như trên. 
MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG 
- M1 (môi trường giá đậu đường) 
Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước. Đun sôi 30 phút. Lấy phần dịch 
trong. Thêm nước cho đủ 1000ml. bổ sung thêm glucose với hàm lượng 5% (w/v) 
- M2 (môi trường khoai tây đường cám): 1000ml 
Khoai tây cắt nhỏ, rửa sạch, cân lấy 300g. Thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút. Lọc 
lấty nước trong. Cân 100g cám, thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút. Lọc lấy nước trong. 
Trộn 
2 loại dịch lọc trên và thêm sucrose 5% (w/v). Bổ sung nước cho đủ 1000ml. 
Khoai tây 30% Cám 10% 
Sucrose 5% Nước đủ 1000ml 
- M3 (môi trường Sabouraud): 1000ml 
Pepton 1% Glucose 4% 
Agar 2% Nước đủ 1000ml 
pH 5.6 – 6.0 
- M4 (môi trường Hansen) 
Glucose 5% Pepton 1% 
K2HPO4 0.3% MgSO4.7H2O 0.2% 
Agar 2% Nước đủ 1000ml 
- M5 (môi trường Potato Dextrose Agar) 
Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ với 
1000ml nước trong 30 phút. Lọc qua vải thưa, giữ lại phần dịch, đó là chất chiết khoai 
tây. 
Trộn với các thành phần khác rồi đun sôi để hoà tan (đối với môi trường Potato dextrose 
salt: chuẩn bị như môi trường M5 rồi thêm: 7.5% NaCl) 
Chất chiết khoai tây 20% (v/v) Dextrose 2% 
Agar 2% Nước đủ 1000ml 
- M6 (môi trường thạch malt) 
Lấy 250g malt, nghiền nhỏ, hoà vào 1000ml nước cất. Dùng đũa thủy tinh khuấy 
đều và gia nhiệt từ từ, đến 45 – 50oC, giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút. Sau đó nâng 
nhiệt độ lên 65 – 68oC, có khuấy, cho đến khi quá trình đường hóa xảy ra hoàn toàn 
(không thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch Lugol). Lọc tách bã 
qua vải thô (hay bông gòn thấm nước), đem hấp phần dịch 121oC / 30 phút, lấy ra để 
lắng. Lọc bỏ kết tủa, pha loãng để đạt 6 – 8o Brix, thêm 2% agar, đun và khuấy đều cho 
đến khi thạch tan hết. Cho môi trường thạch vào các dụng cụ chứa, hấp tiệt trùng 121oC / 
15 phút. 
- M7 (môi trường BGBL 2% Broth – dạng pha sẵn) 
Peptic digest of animal tissue 1% 
Lactose 1% 
Oxygall 2% 
Brilliant green 0.0133g/L 
Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để pha thành 1000ml môi trường. 
- M8 (môi trường Plate Count Agar – ATCC medium 1048): 1000ml 
Agar 150 g 
Yeast extract 2.5 g 
Trypton 5 g 
Glucose 1.0g 
- M9 (môi trường LST - Lauryl Sufate Broth/Lauryl Trypton Broth): 1000ml 
Trypton 20 g 
Lactose 5 g 
NaCl 5 g 
K2HPO4 2.75 g 
KH2PO4 2.75 g 
Sodium lauryl sufate 0.1 g 
pH 6.8 ± 0.2 Nước Đủ 1000ml 
- M10 (Môi trường VRBL- Crystal Violet neutral Red Bile Lactose agar): 
Pepton 7g Neutral Red 0,03g 
Yeast Extract 3g Crystal Violet 0,002g 
Lactose 10g Agar 15g 
NaCl 5g Nước đến 1000 ml 
Muối mật 1,5g 
Hòa tan các thành phần trên trong nước, để yên vài phút, đặt lên bếp đun sôi và 
khuấy đều, để sôi 2-5 phút. Làm nguội đến 45oC để sử dụng. 
Chú ý: 
- Không để sôi quá lâu 
- Không được tiệt trùng môi trường 
- Pha chế xong sử dụng ngay trong vòng 3 giờ 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm – Trần Linh 
Thước – Nhà xuất bản Giáo dục, 2003 
2. Thực tập Vi sinh vật học thực phẩm – Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn 
Việt Mẫn – Đại học Bách Khoa TP.HCM 
3. Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm – Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương – Nhà 
xuất bản Đại học quốc gia TP.HCM, 2006 
4. Handbook of Microbiologycal Media for the Examination of Food – Ronald M. 
Atlat – CRC Press, Taylor &Francis Group, 2006 
5. Laboratory Manual of Food Microbiology for Ethiopian health and Nutrition 
Research Institute – Dr. Ciira Kiiyukia – Unido project, 2003 
6. Food Microbiology Laboratory Manual – Professor Nagendra Shah – School of 
Molecular Sciences Victoria University, 2004