Bài giảng Sản xuất protein trong y học - Trần Hoàng Dũng (Phần 1)

Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành
Khoa Công Nghệ Sinh Học
SẢN XUẤT PROTEIN
TRONG Y HỌC
TS. TRẦN HOÀNG DŨNG
Tháng 04/2012
Sản xuất protein trong y học
1
Chương 1
DNA - CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG
Những khái niệm chính
 Các thông tin di truyền được chứa trong các axit nucleic.
DNA là một sợi đôi xoắn song song ngược chiều nhau.
 Cặp base (A với T và G để C) giữ hai sợi xoắn lại với nhau.
 Sự sao chép DNA xảy ra thông qua việc tháo xoắn của các sợi DNA và sao
chép trên mỗi chuỗi.
 Các nguyên lý trung tâm của sinh học phân tử:
DNA phiên mã RNA dịch mã Protein
 Phiên mã là việc sản xuất một bản sao RNA của một trong các sợi DNA.
Dịch mã là giải mã của một phân tử RNA để sản xuất protein.
Mỗi sinh vật sở hữu các thông tin cần thiết để xây dựng và duy trì một bản sao
sống của chính nó. Các khái niệm cơ bản về di truyền và kết quả cho thấy các gen có
thể được truy hồi trở lại năm 1865 và các nghiên cứu của Gregor Mendel được thảo
luận bởi Orel (1995). Từ những kết quả của thí nghiệm của ông với đậu Hà Lan,
Mendel kết luận rằng mỗi cây đậu Hà Lan có hai alen cho mỗi gen nhưng chỉ hiển thị
một kiểu hình đơn lẻ. Có lẽ thành tích xuất sắc nhất của Mendel là khả năng xác định
đúng một hiện tượng phức tạp mà không có sẵn những kiến thức về các quá trình phân
tử liên quan đến việc hình thành các hiện tượng đó. Sự di truyền qua tinh dịch và trứng
được biết cùng một thời điểm và Ernst Haeckel ghi nhận tinh trùng bao gồm phần lớn
các vật liệu từ nhân, mặc nhiên đã công nhận rằng nhân đóng vai trò về tính di truyền.
1.1. Acid nucleic là vật chất của di truyền
Ý tưởng cho rằng vật chất di truyền là chất truyền từ cha mẹ sang con theo quy
luật tự nhiên đã được thừa nhận như là các khái niệm về sự di truyền đã được kế thừa
trước đây. Cả hai protein và axit nucleic được xem là chất có vai trò quan trọng trong
vật chất di truyền. Cho đến những năm 1940, nhiều nhà khoa học nghiên cứu về
protein. Có hai lý do chính cho việc này. Thứ nhất, protein có nhiều ở các tế bào, mặc
dù số lượng của một protein riêng biệt thay đổi đáng kể từ các loại tế bào khác nhau,
hàm lượng protein tổng thể của tế bào nhất chiếm trên 50% trọng lượng khô. Thứ hai,
axit nucleic có thể dễ dàng để vận chuyển các thông tin phức tạp, cần thiết để truyền
đạt những đặc điểm của tính di truyền. DNA (deoxyribonucleic acid) lần đầu tiên được
xác lập vào năm 1869 bởi nhà hóa học Thụy Sĩ Johann Friedrich Miescher. Ông tách
nhân từ tế bào chất của tế bào và sau đó nó được tách bởi một chất có tính axit từ các
nhân mà ông gọi là nuclein. Miescher cho thấy nuclein có chứa một lượng lớn
phosphorus và không có lưu huỳnh, đặc tính mà có thể phân biệt chúng với protein. Từ
những gì đã được chứng minh cho ta có một cái nhìn tổng thể, ông cho rằng "nếu
muốn giả định rằng một chất đơn lẻ. . . là nguyên nhân của sự thụ tinh thì chúng ta nên
chắc chắn rằng tất cả các suy nghĩ đầu tiên là về nuclein.
Năm 1926 dựa trên ý tưởng về DNA bao gồm bốn nhóm nucleotide khác nhau,
bằng cách xác định các loại hình liên kết mà nó đã tham gia liên kết với các
Sản xuất protein trong y học
2
nucleotide, Levene và Simms đề xuất một cấu trúc của bốn nucleotide (Hình 1.1) để
giải thích trình tự sắp xếp hóa học của nucleotide trong axit nucleic (Levene và
Simms, 1926). Họ tìm thấy một nucleotide đơn của bốn loại đã được lặp đi lặp lại
nhiều lần để tạo thành phân tử acid nucleic dài. Bởi vì cấu trúc của bốn nucleotide là
tương đối đơn giản, axit nucleic không có khả năng làm biến đổi tính chất hóa học của
các vật chất di truyền. Protein có chứa 20 acid amin khác nhau.
Hình 1.1. Đề xuất của Levene Simms năm 1926 về các mô hình bốn nucleotide
của cấu trúc axit nucleic. Vào thời gian đó mô hình này đã được đề xuất, người ta cho
rằng acid nucleic của thực vật và động vật có thể là khác nhau và sự khác biệt giữa
DNA và RNA chưa hoàn toàn được hiểu rõ.
Năm 1928, Frederick Griffith tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng một vài
chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae khác nhau (Griffith 1928). Một số các dòng
sử dụng được gọi là dòng độc hại, chúng gây ra viêm phổi ở cả người và chuột. Một số
dòng khác thì không gây độc và không gây bệnh. Cả hai dòng này có hình thái riêng
biệt trong đó các dòng gây bệnh có một lớp vỏ polysaccharide bao quanh vi khuẩn và
hình dáng bên ngoài mượt mà, tạo bề mặt nhẵn khi được nuôi cấy trên các tấm thạch.
Vi khuẩn không độc thì không có lớp vỏ và tạo một vùng nhám trên cùng một mẫu.
Các vi khuẩn dòng nhẵn thì nguy hiểm vì các viên đường cấu tạo từ lớp vỏ sẽ loại bỏ
hệ thống miễn dịch của động vật nhiễm bệnh và do đó chúng có thể nhân rộng và gây
ra bệnh viêm phổi. Các vi khuẩn gặp khó khăn khi không có các viên nang
polysaccharide nên sẽ không có sự bảo vệ này, do đó chúng dễ dàng xâm nhập và phá
huỷ hệ thống miễn dịch của vật chủ.
Griffith biết rằng chỉ có vi khuẩn độc sống sẽ tạo ra bệnh viêm phổi khi tiêm vào
chuột. Nếu giết chết vi khuẩn gây độc bởi nhiệt sau đó tiêm vào chuột, kết quả cho
thấy không có bệnh viêm phổi cũng giống như vi khuẩn sống không độc, không gây
bệnh khi tiêm vào chuột. Thí nghiệm quan trọng của Griffith (hình 1.2) liên quan đến
việc tiêm vào chuột vi khuẩn sống không độc (avirulent) kết hợp với vi khuẩn độc xử
lý nhiệt. Không có loại tế bào gây ra tử vong ở chuột khi họ tiêm, nhưng tất cả những
con chuột thu được kết hợp tiêm thuốc thì sẽ bị chết. Các phân tích máu của những con
chuột đã chết cho thấy một số lượng lớn các vi khuẩn độc sống khi nuôi trên các tấm
thạch. Griffith đã kết luận rằng nhiệt giết chết vi khuẩn nhẵn và bằng cách nào đó chúng
đóng vai trò chuyển vi khuẩn nhẵn vào vi khuẩn sống. Ông gọi hiện tượng này là hiện
tượng biến nạp và cho rằng nguyên tắc biến nạp có thể là do một số thành phần của viên
nang hay hợp chất polysaccharide là nguyên nhân để tổng hợp nên tác nhân gây bệnh,
mặc dù ông lưu ý rằng các viên đường một mình nó không gây ra bệnh viêm phổi.
Sản xuất protein trong y học
3
Hình 1.2. Các tính năng chính của thí nghiệm của Griffith, kết hợp với dữ liệu
của Avery, MacLeod và McCarty để xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi từ
Streptococcus pneumoniae. Griffith lưu ý rằng tiêm vi khuẩn nhẵn sống vào chuột dẫn
đến sự hình thành của bệnh viêm phổi và cuối cùng đến cái chết của chuột. Xử lý nhiệt
trước khi tiêm vi khuẩn không gây ra sự hình thành của bệnh. Không độc đối với
chủng vi khuẩn, mà không gây ra các bệnh riêng của chúng, có thể được chuyển đổi
bằng cách tiêm kết hợp với xử lý nhiệt vi khuẩn độc hại. Avery, MacLeod và McCarty
xác định DNA là nguyên tắc chuyển đổi.
Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế cầu khuẩn
từ R chuyển sang S. Người ta chứng minh được rằng :DNA tách từ vi khuẩn S nếu
được đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R sang S, phát hiện này khẳng
định DNA là vật chất di truyền. Trong hơn 10 năm trời kể từ sau thí nghiệm của ông,
Oswald Avery cùng với Macleod và McCarty đã tiến hành trở lại thí nghiệm biến nạp
này nhưng dùng trong in vitro.
Năm 1944, Oswald Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty xuất bản tác
phẩm của họ cho thấy rằng các phân tử đóng vai trò là yếu tố cơ bản chuyển đổi là
DNA (Avery, MacLeod và McCarty, 1944). Họ bắt đầu bằng cách nuôi số lượng lớn tế
bào Streptococcus pneumoniae nhẵn. Các tế bào được thu nhận từ các môi trường nuôi
cấy và sau đó giết chết bởi nhiệt. Sau đó đồng nhất và sử dụng chất tẩy rữa, họ thu
được một phần chiết được kiểm tra bằng cách tiêm vào vi khuẩn sống theo những
nguyên tắc biến nạp. Protein đã được gỡ bỏ từ dịch chiết của chloroform và
polysaccharides được nhiều enzyme tiêu hóa và loại bỏ. Cuối cùng, những phần kết
tuả với ethanol đã tạo ra một khối lượng xơ mà vẫn giữ lại khả năng gây ra biến nạp
của các tế bào vi khuẩn sù sì (avirulent). Từ 75 lít môi trường nuôi cấy của các tế bào
Sản xuất protein trong y học
4
vi khuẩn, sau quá trình thu được 10-25 mg từ các yếu tố hoạt động. Những thí nghiệm
được thiết lập qua một nghi ngờ rằng nguyên tắc biến nạp là DNA. Khối lượng các sợi
sơ được phân tích dựa trên tỷ lệ nitơ / phốt pho, được biểu hiện trùng khớp với tỷ lệ dự
kiến với DNA. Để loại bỏ tất cả các chất gây ô nhiễm có thể xảy ra từ chúng khi giải
phóng, họ tiến hành xử lí với nó với enzym thủy phân protein trypsin và chyomtrypsin
và sau đó họ dùng phương pháp xử lí bằng cách tiêu hóa nó với một RNA enzyme tiêu
hóa ribonuclease, nó sẽ bị phá hủy bất kỳ hoạt động còn lại của protein và RNA nhưng
vẫn giữ lại các hoạt tính chuyển đổi. Việc xác nhận cuối cùng DNA đã được chuyển
đổi bằng cách tiêu hóa dịch chiết với deoxyribonuclease, chúng sẽ bị phá hủy hoạt
động chuyển đổi.
Năm 1944, O.T Avery Mc Carti đã chứng minh được rằng tác nhân biến nạp là
DNA. Phế cầu khuẩn bị xử lí bằng protease hoặc RNA-aza thì hoạt tính biến nạp vẫn
còn: nhưng nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi DNA-aza thì hoạt tính biến nạp không còn
nữa (Cơ sở và phương pháp phân tích sinh học phân tử, T.s Chu Hoàng Mậu, trang 9).
Việc thứ hai chứng minh bằng chứng rằng ADN là vật liệu di truyền đã được
cung cấp bởi các nghiên cứu về sự lây nhiễm của vi khuẩn Escherichia coli bởi một
trong những virus phage T2 . Thường gọi đơn giản là thể thực khuẩn, virus bao gồm
một lớp vỏ protein bao quanh một lõi của DNA (xem hình 1.3).
Hình 1.3. Vòng đời của thể thực khuẩn T2. Trong quá trình xâm nhiễm, vi khuẩn
bám vào các bề mặt của tế bào Escherichia coli. Truyền các thông tin di truyền nhưng
không phải là toàn bộ nhân thể thực khuẩn được chèn vào trong vi khuẩn, nơi nó được
nhân rộng. Các thể thực khuẩn được sao chép, lớp vỏ protein vẫn còn ở bề mặt của vi
khuẩn. Sau khi tổng hợp các nhân thể thực khuẩn mới được sản xuất, ly giải tế bào vi
khuẩn và các nhân thể thực khuẩn được giải phóng vào môi trường xung quanh.
Trong những năm 1950 chúng ta ít được biết về thể thực khuẩn lây nhiễm. Thể
thực khuẩn được biết là hấp thụ vào bề mặt của vi khuẩn, sau đó có một giai đoạn tiềm
Sản xuất protein trong y học
5
ẩn của chúng khoảng mười phút trước khi các virus lây nhiễm bắt đầu được thực hiện,
cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào và phóng thích thể thực khuẩn. Alfred Hershey và
Martha Chase lý luận rằng nếu họ biết bản chất của các protein thể thực khuẩn và acid
nucleic vào đầu của quá trình xâm nhiễm, họ sẽ hiểu hơn về bản chất của những bước
đầu tiến trình.
Hình 1.4. Hershey -Chase thử nghiệm cho thấy acid nucleic là vật chất di truyền.
Hershey và Chase tăng bacteriophages T2 là vi khuẩn có khả năng truyền tải P32trong
môi trường (để đánh dấu phốt pho của axit nucleic) hoặc S35(để đánh dấu lưu huỳnh
của các protein trong các chuỗi bên của các axit amin methionine và cysteine chứa
lưu huỳnh). Họ sử dụng phóng xạ đánh dấu bacteriophages của chúng để lây nhiễm
một môi trường nuôi cấy mới của vi khuẩn không đánh dấu. Sau khi ủ bệnh ngắn, vi
khuẩn đã được thu nhận bằng cách ly tâm và đưa vào máy khuấy để tách các vi khuẩn
đi từ thể thực khuẩn gắn liền với bề mặt của nó. Họ thấy rằng, khi DNA đã được đánh
dấu, các chất đánh dấu được chuyển vào các tế bào vi khuẩn, trong khi các protein
đánh dấu vẫn được gắn phage thực khuẩn. Họ kết luận là vật chất di truyền -tức là
các vật chất truyền cho con cái - là nucleic acid.
Họ sử dụng đồng vị phóng xạ P32và S35 để thực hiện theo các thành phần phân tử
của các thực khuẩn trong xâm nhiễm (Hình 1.4). Vì DNA có chứa phốt pho nhưng
không chứa lưu huỳnh, P32 hiệu quả với DNA và bởi vì các protein có chứa chứa lưu
huỳnh nhưng không phốt pho, S35 được đánh dấu lên protein. Nếu E. coli tế bào được
nuôi cấy trong sự hiện diện của P32 hoặc S35 và sau đó bị nhiễm virus T2, các tổng hợp
thực khuẩn mới sẽ có cả một lõi DNA được đánh dấu phóng xạ hoặc protein vỏ đánh
Sản xuất protein trong y học
6
dấu phóng xạ tương ứng. Những thực khuẩn có đánh dấu có thể được phân lập từ môi
trường nuôi cấy bị nhiễm bệnh và được sử dụng để lây nhiễm vi khuẩn khác không được
đánh dấu. Hershey và Chase đánh dấu các thực khuẩn T2 với một trong hai chất phóng
xạ S35 hoặc P32 và cho phép chúng hấp thu vi khuẩn không được đánh dấu. Các tế bào
này sau đó được tách ra bằng cách ly tâm. Các tế bào được tạo huyền phù và việc dừng
pha trộn để tách phần bên trong của thể thực khuẩn từ vi khuẩn bị nhiễm bệnh. Những
phần không chứa các vật chất di truyền, mà được nhân rộng trong các vi khuẩn chủ.
Hershey và Chase thấy rằng khoảng 80% của S35 đánh dấu đã được gỡ bỏ từ các vi
khuẩn trong khi chỉ khoảng 20% của P32 đánh dấu đã được gỡ bỏ. Họ kết luận rằng hầu
hết các DNA thể thực khuẩn xâm nhập vào tế bào và một dư lượng có ít nhất 80%
protein có chứa lưu huỳnh của thể thực khuẩn vẫn còn ở bề mặt tế bào. Điều này cho
thấy cùng với lúc đó Avery, MacLeod và McCarty cung cấp bằng chứng rằng DNA là
phân tử có vai trò về tính di truyền học. Hershey và Chase hơi nghi nghờ về những phát
hiện của họ và sau đó họ kết luận protein không có chức năng trong nhân thể thực khuẩn
và DNA có một số chức năng (Hershey và Chase, 1952).
1.2 Cấu trúc của acid nucleid
Như chúng ta đã thấy trong phần trên, các vật chất di truyền là DNA hay đúng
hơn axit nucleic. Trong hầu hết các sinh vật, vật chất di truyền là DNA. Tuy nhiên,
một số virus sử dụng RNA (ribonucleic acid) là những khối vật chất xây dựng cho hệ
gen của chúng. DNA và RNA là những phân tử cao phân tử được tạo thành từ chuỗi
tuyến tính của các tiểu đơn vị nucleotide. Mỗi nucleotide có ba phần: một gốc base
nitơ, 5 nguyên tử carbon, đường và một nhóm phosphate (Hình 1.5). Sự kết hợp của
các base và đường được gọi là một nucleoside, trong khi các base-phosphate- đường
được gọi là một nucleotide. Chúng bao gồm đường 2’-deoxyribose, các nucleotide của
DNA được gọi là deoxyribonucleotides, trong khi những thành phần của RNA có chứa
các đường ribose được gọi là ribonucleotides. Các base của nucleotide có thể là bao
gồm một vòng purine hoặc một pyrimidine . DNA và RNA được xây dựng từ hai vòng
purine và hai vòng pyrimidine có chứa nucleotide. Cácvòng purin của cả DNA và
RNA là như nhau bao gồm adenine (A) và guanine (G). Các vòng pyrimidine gồm
cytosine (C) cũng được tìm thấy ở cả hai loại axit nucleic, trong khi pyrimidine gồm
thymine (T) được giới hạn trong DNA, nó được thay thế bởi uracil (U) trong RNA.
Hệ thống đánh số cho nucleotide được sử dụng rộng rãi trong các văn bản này
được thể hiện trong hình 1.5. Mỗi nguyên tử carbon và nitơ trong vòng pyrimidine của
cả hai và vòng purine được đánh số tương ứng 1-6 hoặc 1-9. Các nguyên tử cacbon
của vòng đường hoặc là ribose hoặc deoxyribose được đánh số từ 1 đến 5. Như vậy,
2’-deoxyribose thiếu một nhóm hydroxyl thuộc carbon 2 của vòng đường.Các
nucleotide riêng biệt được kết nối với nhau trong cả DNA và RNA thông qua gốc
phosphate- đường kết nối từ các nhóm hydroxyl trên carbon số 3 của một nucleotide
với nhóm phosphate vào carbon số 5 trên một nucleotide khác. Xem (Hình 1.6. )Hai
nucleotide liên kết với nhau được gọi là một dinucleotide, ba được gọi là trinucleotide
và nhiều kết nối trong một chuỗi dài được gọi là một polynucleotide.
Sản xuất protein trong y học
7
Hình 1.5. Cấu trúc của các purin và pyrim ... ắt để tạo kích thước, được xử lý với enzyme cắt nếu cần thiết và sau đó được
đưa lên các giếng ở gel agarose (Figure 2.20).
Ở đầu agarose và sau đó xử lý những đầu này với enzyme để phân loại vách TB
với protein vì vậy DNA còn nguyên vẹn tinh khiết trên agarose. Những đầu này sau đó
sẽ được cắt để tạo kích thước, được xử lý với enzyme cắt nếu cần thiết và sau đó được
đưa lên các giếng ở gel agarose (Figure 2.20).
Ở đầu agarose và sau đó xử lý những đầu này với enzyme để phân loại vách TB
với protein vì vậy DNA còn nguyên vẹn tinh khiết trên agarose. Những đầu này sau đó
sẽ được cắt để tạo kích thước, được xử lý với enzyme cắt nếu cần thiết và sau đó được
Sản xuất protein trong y học
74
đưa lên các giếng ở gel agarose (Figure 2.20).
2.6 Vết nucleid acid
Khi chúng ta thấy những đoạn DNA trong thuốc nhuộm gel ethidium bromide,tất
cả các dãy DNA ở mỗi loại trên gel thì khác nhau so với loại kia.
Figure 2.20. Chuẩn bị những phân tử DNA có khối lượng phân tử lớn để phân
tích bởi kĩ thuật PFGE. Những TB nguyên vẹn được hòa lẫn vào nhau với agarose
nóng chảy nhưng đã làm mát và được rót vào 1 khối nguyên vẹn. Khối agarose có
thể được xử lý với enzyme thủy phân loại bỏ vách TB và nhận biết DNA NST.
Nếu theo yêu cầu, DNA có thể được phân hủy bởi các enzyme cắt trong khối gel
agarose. Những khối được xử lý sau đó được đem vào các giếng của gel agarose
trước khi được xử lý với kĩ thuật điện di (PFGE).
Thậm chí những đoạn có chiều dài đồng nhất cũng có trình tự khác nhau.Dĩ nhiên
trình tự DNA của chính nó đóng vai trò sự sống trong chức năng của phân tử.Vào giữa
thập niên 1970 phương pháp này được phát triển để phân biệt các dải băng trên gel có
chứa trình tự DNA riêng biệt. Những phương pháp này phụ thuộc cách lai của trình tự
Sản xuất protein trong y học
75
acid nucleic để nhận biết sự có mặt của trình tự bổ sung. Phương pháp truyền thống
được thực hiện bởi ED Southern 1975 để phát hiện phân đoạn DNA trên gel agarose
mà nó bổ sung với trình tự acid nucleic.
2.6.1. Southern Blotting
Hình 2.21. Southern blotting. Các phân đoạn DNA được tách ra trên gel
agarose và chuyển tới màng. DNA được làm biến tính tạo chuỗi đơn trước khi cho kết
hợp với mẫu dò. Sự kết hợp của mẫu dò với màng- thông qua liên kết hydrogen- được
phát hiện bằng màng phim X-ray. Các mẫu dò có gắn phóng xạ hình thành những
băng trên phim tại vị trí tương ứng với trình tự bổ sung trên màng.
Trong qui trình Southern blotting, đoạn DNA tách ra khỏi gel agarose và được
cố định trên màng. Sau khi gel được chạy, đoạn DNA bị biến tính (thành từng chuỗi
riêng biệt) khi dung kiềm.. Bản chất sợi đơn của ADN trên màng tế bào là rất quan
trọng cho phép các trình tự DNA bổ sung có thể gắn vào các đoạn DNA trên màng.
Sau khi các DNA trong gel đã được biến tính, chúng được chuyển đến màng. Quá
trình chuyển có thể là qua trung gian hoặc electrophoretically hoặc lực hút mao dẫn
bằng cách đặt các gel và màng tiếp xúc với các chất khác đệm và cho đệm chảy qua
gel lên màng tế bào - đoạn DNA di chuyển với đệm và bị giữ trên màng. Ban đầu, sử
dụng màng nitrocellulose, nhưng nó mỏng và dễ bị phá vỡ. Hiện nay người ta thường
Sản xuất protein trong y học
76
sử dụng màng nilon. Sau khi chuyển, các đoạn DNA cần được cố định vào màng để
chúng không tách rời ra. Một số phương pháp cố định thường dùng là đun nóng ở 80 ◦
C kết hợp sử dụng ultraviolet cross-linking. Nó dựa trên sự hình thành các liên kết
chéo giữa một lượng T rất nhỏ trong DNA, các nhóm tích điện dương và amino trên bề
mặt của màng nylon. Sau khi đông đặc, màng được đặt trong một dung dịch acid
nucleic có đánh dấu (thường là các chất có tinh phóng xạ) một trong hai sợi đơn DNA
hay RNA. Các nucleic acid đánh dấu (hoặc đầu dò) cho phép lai với các trình tự bổ
sung của nó trên màng. Sự tương tác giữa đầu dò đơn sợi và trình tự bổ sung của nó sẽ
dẫn đến sự kết hợp của các đầu dò với màng thông qua liên kết hydro không đồng hóa
trị- liên kết thường giữ chuỗi ADN xoắn kép với nhau. Sau đó màng này được rửa
sạch để loại bỏ các đầu dò không liên kết.
Hình 2.22. Màng Washing Southern blot tại những nhiệt độ khác cho kết quả
khác nhau. Rửa màng ở nhiệt độ cao sẽ loại những phân tử DNA liên kết yếu- những
phân tử này giống trình tự mẫu dò. Rửa màng ở nhiệt thấp có thể loại bỏ những trình
tự trên màng mà chỉ tương tự chứ không giống trình tự mẫu dò. Nhiệt độ phù hợp để
rửa tùy thuộc chiều dài và khả năng kết hợp chính xác với các trình tự trên màng.
Southern blotting được sử dụng để phát hiện các trình tự ADN hoặc là trùng
hoặc tương tự như trình tự các đầu dò. Việc lai tạo các đầu dò với các trình tự DNA bị
giữ trên màng là yếu tố quan trọng của sự thành công trong những thí nghiệm này.
Như chúng ta đã thấy trước đây, một sợi đơn DNA sẽ liên kết với trình tự bổ sung của
nó bằng một ái lực cao. Cũng có những liên kết tương tự được tạo ra, nhưng không
giống nhau và ái lực với các trình tự DNA giảm. Điều này được thực hiện bằng cách
thay đổi nhiệt độ (hoặc nồng độ muối) mà tại đó các đầu dò được rửa sau khi đã bị kết
Sản xuất protein trong y học
77
hợp (Hình 2,22). Rửa màng ở nhiệt độ cao sẽ gây gián đoạn nhưng các trình tự liên kết
chặt chẽ. Do đó, các băng hiển thị trên phim X-ray hoặc là trùng hoặc liên kết chặt với
đầu dò. Rửa màng ở nhiệt độ thấp hơn sẽ làm giảm mức độ stringency, và trình tự liên
kết yếu với đầu dò sẽ thể hiện điện tích dương trên phim X-ray. Cách tiếp cận này là
vô cùng hữu ích khi bạn không biết chính xác trình tự của gen mà bạn muốn xác định.
Điều này được thực hiện khi kiến thức về các trình tự protein được biết đến, nhưng
chuỗi ADN mã hóa protein mà chưa được biết rõ. Chúng ta sẽ thảo luận về vấn đề này
hơn nữa trong Chương 6.
2.6.2 Những điểm Compass của Blotting
Từ mô tả đầu tiên của Southern và lai tạo, một số phương pháp khác đã được mô
tả. Những sự thay đổi này liên quan đến việc chuyển vật liệu từ gel tới màng và nhận
biết các phân tử riêng biệt. Các kỹ thuật này cho biết tên vị trí điểm đó chứ không chỉ
là mô tả.
• Northern blotting- nhận biết trình tự RNA bằng cách sử dụng các đầu dò
(Thomas, 1980). RNA được tách trên gel agarose và được chuyển đến màng, giống
như mô tả ở trên. Cụ thể, các phân tử RNA này sau đó được nhận biết bằng cách lai sử
dụng sợi đơn RNA, hoặc sợi bổ sung cho RNA có đánh dấu.
• Western blotting- nhận biết các protein cụ thể bằng cách sử dụng các kháng thể
(Bur-nette, 1981). Protein được tách thông qua một gel polyacrylamide có chứa chất
tẩy SDS để giữ chúng không bị cuộn lại (biến tính). Các protein được chuyển từ gel tới
màng giống như mô tả ở Southern blotting. Đặc biệt, các protein này sau đó được phát
hiện bằng cách sử dụng các kháng thể. Sự tương tác cụ thể giữa các kháng thể và
kháng nguyên của nó xảy ra trên màng tế bào, và nhận biết được vị trí liên kết kháng
thể. Ban đầu, sử dụng kháng thể có đánh dấu, nhưng phần lớn đã được thay thế bằng
kháng thể “sandwiches”. Phương pháp này giống bánh mì kẹp chả tức là kháng
nguyên nằm giữa và hai kháng thể nằm hai bên. . Điều này có một số ưu điểm, trước
hết, bản chất của kháng thể là protein thì khả năng bắt cặp với kháng nguyên rất cao
làm tăng đáng kể độ nhạy, và thứ hai, một kháng thể đơn dòng thứ cấp có thể được sử
dụng để phát hiện một số kháng thể sơ cấp khác nhau. Ví dụ, các kháng thể đơn dòng
sơ cấp thường sử dụng ở chuột. Nhưng kháng thể đơn dòng thứ cấp, chẳng hạn
globulins miễn dịch ở thỏ có khả năng tương tác với kháng thể sơ cấp ở chuột.
Sản xuất protein trong y học
78
Hình 2.23. Western blotting sử dụng kháng thể để nhận diện các protein đặc
trưng. Protein được tách nhờ gel polyacrylamide, sử dụng SDS gây biến tính trước khi
cho thấm trên màng nitrocellulose. Các protein không liên kết mà bị dính trên màng- sử
dụng bột sữa hòa tan- trước khi sử dụng kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp kết hợp với
kháng nguyên. Một kháng thê thứ cấp khác sau đó được thêm vào để nhận biết kháng
thể sơ cấp. Các kháng thể thứ cấp thường được gắn nhãn với một loại enzyme có hoạt
động, trong sự hiện diện của các cơ chất thích hợp, kết quả là thay đổi màu sắc trên
màng hoặc phát xạ ánh sáng có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phim X-ray.
• South- Western blotting- xác định các protein liên kết với các trình tự DNA cụ
thể (Singh và cộng sự, 1988). Protein được tách bằng hai cách hoặc trên gel hoặc thấm
trực tiếp trên màng tế bào. Màng tế bào này sau đó được kết hợp với một chuỗi
oligonucleotide DNA có đánh dấu. Nếu một protein có khả năng liên kết DNA, nó sẽ
được phát hiện bởi sự hiện diện của mẫu có đánh dấu này.
Sản xuất protein trong y học
79
2.7 Tinh sạch DNA
Nhiều kĩ thuật được thảo luận trong chương này chủ yếu phụ thuộc vào các DNA
đã được tinh sạch. Sự cô lập vật chất di truyền từ tế bào là quá trình tương đối đơn
giản. Việc phá vỡ vách tế bào làm vật chất di truyền thoát ra khỏi tế bào, nhưng DNA
bị nhiễm với RNA và protein. Vì thế phương pháp này đòi hỏi phải loại hết các thành
phần tạp để tăng hiệu suất tinh sạch phân đoạn DNA. Tổng lượng DNA phân lập được
chủ yếu dựa vào các qui trình sau đây:
• Phá vỡ vách tế bào chủ. Phương pháp phá vỡ tùy bản chất mỗi loại tế bào. Ví
dụ, các tế bào vi khuẩn thường được xử lí với các enzyme lysozyme để phá vỡ bớt
thành tế bào trước khi sử dụng chất tẩy rửa. Mặt khác, tế bào nấm men, được xử lí
bằng zymolase để phá vỡ hoàn toàn thành tế bào trước khi tiến hành phân giải -
thường là bằng cách nghiền các tế bào với hạt thủy tinh để phá vỡ chúng.
• Li tâm để loại các thành phần tạp của tế bào
• Các thành phần hòa tan còn lại sau đó sẽ được vortexed với phenol để loại bỏ
protein sau khi đã gây biến tính. Chlorofom thường được sử dụng kết hợp với phenol,
nó cũng là một chất biến tính protein nhưng tạo sự phân lớp rõ ràng giữa các dịch nước
và phenol.
• Các acid nucleic còn lại trong lớp dung dịch nước có thể được kết tủa bằng cách
sử dụng ethanol. Khi bổ sung ethanol DNA sẽ hình thành một kết tủa trắng dạng sợi có
thể được thu bằng phương pháp ly tâm.
• RNA được loại bỏ từ việc chuẩn bị bằng cách xử lý với RNase.
Đối với nhiều ứng dụng, DNA phải được tinh sạch hơn. Isopycnic centrifugation-
được sử dụng để tách DNA khỏi các tạp chất, và cũng để cô lập từng phân tử DNA.
Các mẫu DNA được trộn với một chất (caseium chloride, CsCl) có khả năng hình
thành self-generating ổn định gradient nồng độ trong quá trình ly tâm. Các phân tử
DNA sẽ lắng xuống ống ly tâm khi gradient của dung dịch bằng gradient của chính nó,
và nó tạo thành một băng. Sau đó, chúng được lấy ra khỏi các ống ly tâm và CsCl
được loại bỏ bằng cách tủa ADN với rượu. Một ưu điểm lớn của kỹ thuật này là khả
năng riêng biệt các loại phân tử DNA khác nhau.
Sản xuất protein trong y học
80
Hình 2.24. Li tâm isopycnic các phân tử DNA nhờ gradient của caesium
chloride- ethidium bromide. DNA mẫu trộn với caesium chloride va ethidium bromide
và li tâm tốc độ cao trong vòng 48h. Mỗi nồng độ sẽ xuất hiện một băng, trong đó, đối
với ADN, chịu ảnh hưởng ở mức mà phân tử không bị biến tính bởi ethidium bromide.
Sự kết hợp của ethidium bromide trong ly tâm để tăng khả năng liên kết của
DNA. Những hạn chế trong cấu trúc xoắn cuộn DNA có nghĩa là các phân tử DNA
khép vòng (ví dụ plasmid) có thể liên kết yếu với ethidium bromide. DNA mạch vòng,
và những đoạn DNA mạch thẳng liên kết với ethidium bromide chặt hơn và cấu trúc
không bị phá hủy khi được chèn thêm chất này (hình 2.12). Kết quả DNA mạch vòng
và mạch thẳng nhẹ hơn so với mạch xoắn cuộn tương ứng của nó, và do đó được tách
ra ở vị trí khác nhau trên CsCl. Nhược điểm chính của isopycnic là thời gian li tâm dài
để hình thành gradients, với băng DNA isopycnic mất 36-48 h để hình thành một
gradient CsCl. Kỹ thuật này hiện nay ít được sử dụng do sự ra đời của bộ “kits”
thương phẩm cho phép phân lập DNA nhanh và không ảnh hưởng tới DNA khi tiếp
xúc với thuốc thử có hại. Cơ sở của những bộ “kits” này được thảo luận dưới đây.
Tinh sạch DNA plasmid (xem Chương 3) là cực kỳ quan trọng đối với nhân bản
vô tính trong ống nghiệm và thao tác các gen. DNA plasmid thường được phân lập từ
tế bào vi khuẩn. Một lần nữa, việc phá vỡ tế bào là một giai đoạn quan trọng trong tiến
trình. Phá vỡ tế bào không tốt sẽ dẫn đến lượng plasmid thấp. Các phương pháp phổ
biến nhất trong chiết xuất DNA từ tế bào chủ yếu dựa trên qui trình của Birnboim và
Doly (1979). Phương pháp này được gọi là qui trình phân giải nhờ dung dịch kiềm,
dựa vào pH hoạt động trong môi trường kiềm (giữa 12,0 và 12,5) chỉ có DNA mạch
thẳng bị biến tính còn DNA mạch vòng thì không. Qui trình này đảm bảo kết quả cắt
của genome E.coli dạng vòng để tạo ra những đoạn lớn AND mạch thẳng. Hầu hết các
phương pháp để tinh sạch DNA plasmid dựa trên quan sát này đòi hỏi môi trường nuôi
cấy tế bào vi khuẩn là 1-5ml. Các phương pháp cơ bản để tinh sạch plasmid như sau.
Sản xuất protein trong y học
81
Hình 2.25. Tinh sạch DNA plasmid. Sử dụng SDS phá vỡ DNA plasmid chứa
trong tế bào vi khuẩn. Bổ sung sodium hydroxide để gây biến tính genomic DNA. Sau
khi trung hòa, genomic DNA hình thành dạng kết tủa với phức SDS-protein. Chúng
được loại bỏ bằng cách li tâm. DNA plasmid sau đó kết hợp với dịch matrix mà không
kết hợp với tạp chất. DNA plasmid tinh sạch sau đó được phân tách từ dịch này.
• Các tế bào vi khuẩn được xử lí bằng chất tẩy rửa (SDS) trong môi trường
NaOH để đảm bảo pH kiềm. SDS phá vỡ màng tế bào và biến tính protein. Trong quá
trình này, DNA nhiễm sắc thể bị biến tính, nhưng các phân tử DNA plasmid sẽ vẫn
còn trong dung dịch.
• Hỗn hợp này sau đó bất hoạt bằng cách sử dụng acid acetate kali (pH 5.2). Các
DNA nhiễm sắc thể tái cấu trúc sau khi trung hòa, nhưng kết hợp để tạo thành dạng
không hòa tan. Nồng độ acid acetate kali cao cũng gây kết tủa của protein này - phức
Sản xuất protein trong y học
82
SDS và trọng lượng phân tử RNA cao. Một lần nữa, các phân tử DNA plasmid sẽ vẫn
còn trong dung dịch.
• Các kết tủa sau đó được loại bỏ bằng ly tâm và DNA plasmid tiếp tục được tinh
sạch từ dịch nổi này.
• Các DNA plasmid trong dung dịch sau đó được tinh sạch từ các tạp chât (chất
chuyển hóa, ARN, phân đoạn genome DNA v.v) bằng cách liên kết các DNA hoặc là
silica hoặc trao đổi (anionic) ion tích điện dương. Đối với nhiều quy trình nhỏ, các
DNA plasmid được nhốt trong dịch silica với đệm có chứa hàm lượng muối cao.
Trong điều kiện này, các tạp chất khác sẽ không liên kết với các dịch và có thể được
rửa trôi. Sau đó, DNA có thể được phân tách từ dịch silica bằng cách sử dụng dung
dịch đệm nồng độ muối thấp (hoặc nước). Quy trình lớn hơn, các chế phẩm plasmid
thường gắn vào DNA plasmid với một cực trao đổi ion mang điện tích dương, chẳng
hạn như DEAE (diethylaminoethanol), trong môi trường chứa dung dịch đệm, ví dụ,
1M NaCl. Nồng độ muối cho phép DNA kết hợp với dịch, nhưng không kết hợp với
tạp chất. Sau khi rửa, nồng độ muối được tăng lên đến 1,6 M để phân tách các DNA.
Qui trình này đòi hỏi các DNA được kết tủa (với ethanol hoặc isopropanol) và
resuspended trong dịch đệm hàm lượng muối thấp trước khi được sử dụng trong các
qui trình sinh học phân tử.