Bài giảng Phương pháp phân tích ADN
Phương pháp
phân tích ADNCHIẾT TÁCH ADN
CÁC PP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC
KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ ỨNG DỤNG
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ADN
KỸ THUẬT PCR
48 trang
3320
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Phương pháp phân tích ADN", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
Tóm tắt nội dung tài liệu: Bài giảng Phương pháp phân tích ADN
Phương pháp 1 phân tích ADN CHIẾT TÁCH ADN CÁC PP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ ỨNG DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ADN KỸ THUẬT PCR Phương pháp chiết tách ADN Phương pháp chiết tách Nguyên tắc chung: 3 bướ – Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa họ – Chiết tách acid nucleic: Phenol pha tủa, thu ADN trong pha – Kết tủa acid nucleic: cồn tuy ADN c c -Chloroform loại Protein trong tan ệt ñối hoặc isopropanol, Phương pháp chiết tách Các trường hợp cụ thể: – Plasmid: loại NST bằng sự khá – ADN thực khuẩn: tủa phage – Tế bào Thực vật: phá tế bào – Tế bào ðộng vật: phá tế bào ADN c nhau về cấu dạng - kích thước bằng PEG, loại bỏ capsid bằng cách nghiền bằng enzym - chất tẩy Tinh chế acid nucleic Ly tâm phân ñoạn: acid nucleic trọng saccarose hay CsCl2 (lượng Sắc ký • Lọc gel: tách acid nucleic theo • Trao ñổi ion trên vi cột thu • HPLC:ñối với các oligonucleotide, • Hấp phụ (ái lực): mARN ñược dT hay dU. • ðiện di gel, polyacrylamid ñược siêu ly tâm trong thang tỷ acid nucleic cần tinh chế lớn kích thước phân tử ở qui mô lớn hồi những lượng ADN rất nhỏ ñộ phân giải cao (1 nucleotid hấp phụ bằng resin có gắn oligo ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic ðịnh lượng = Quang ph – Nguyên tắc: sự hấp thụ – 1 ñơn vị OD260nm tương ñương 50 µg/ml dung dịch ADN ( 40 µg/ml dung dịch ARN ( 20 µg/ml oligonucleotid (tới – ðộ tinh khiết: OD260/230 họ tinh khiết: 1.8 ≤ OD260/280 ổ kế: ̣ mạnh của base ở λ = 260 nm nồng ñộ: hoặc ARN) sợi ñôi hoặc ADN) sợi ñơn 70 base) ặc OD260/280 và OD320nm(ADN ̀ ≤ 2). ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic Điện di gel: phân tách acid nucleic gel – Định tính theo kích thước khi – Định lượng bằng so sánh vớ Nguyên tắc: ADN tích điện âm, di chuyển Hệ gel: agarose hay acrylamide Tốc độ điện di ADN qua gel Kích thước ADN Cấu dạng ADN: siêu xoắn, vòng Nồng độ gel Điện thế bằng dòng điện trong so với chuẩn i chuẩn về cực dương tùy thuộc vào: , thẳng ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic Điện di trong trường xung tích ADN lớn (>50kb) ADN NST ĐV có vú kích thước trước khi phân tích (đổi hướng điện trường): phân lớn: thủy phân với RE ðiện di CẮT, NỐI, LAI ADN & ỨNG DỤNG CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN (RE) CÁC LIGASE & ỨNG DỤNG ðỂ NỐI CÁC ð0ẠN ACID NUCLEIC KỸ THUẬT LAI NUCLEOTID & ỨNG DỤNG CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN Cấu tạo: – Enzym cắt hạn chế (restriction endonuclease cắt ADN nhận diện ñặc hiệu. Chức năng – Cắt và thoái hóa các ADN phage) bộ gen của enzym - RE): các tại hay gần một trình tự ngoại lai (ví dụ ADN vi khuẩn ñược ổn ñịnh. I & III Hoạt tính Endonuclease Metyl hóa ATP Cần Vị trí cắt Khá xa ñiểm nhận diện CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN Ứng dụng Ít Danh pháp 3 ký tự Latin (in nghiêng chỉ chủng (strain) hoặc hiện enzym. VD: BamHI: là RE của ñược phát hiện ñầu II Endonuclease Không Tại hoặc rất gần vị trí nhận diện Phổ biến trong nghiên cứu ) - tên chi và loài (ký tự thứ tư ñể plasmid), 1 số La mã - thứ tự phát Bacillus amyloliquefaciens chủng H, tiên. ðặc ñiểm RE loại II và cá Trình tự nhận diện cắt thường có kiểu palindrome toàn giống nhau khi ñọc Kiểu cắt: – ðầu tù: cắt hai mạch tạ – ðầu so le/dính: cắt mỗi Ứng dụng – Cắt ADN trong kỹ thuật – Phân tích ña hình cắt giớ c kiểu cắt của nó gồm 4-8 nucleotid, (2 mạch của tt hoàn theo chiều 5’ – 3’), i cùng một ñiểm mạch tại một ñiểm khác nhau tái tổ hợp di truyền i hạn ñịnh danh, phân biệt ðầu cắt của RE -AATCAGCTGTTA- -TTAGTCGACAAT- -AATCAG CTGTTA- -TTAGTC GACAAT- Cắt với HaeIII Đầu tà (tù) -TAAGGATCCAAA- -ATTCCTAGGTTT- -TAAG GATCCAAA- -ATTCCTAG GTTT- Cắt với BamHI Đầu so le (dính) ðầu cắt của RE Ligase - ứng dụng Là enzyme tạo liên kết OH và 5’-P của hai sợi ADN ligase ðối tượng ADN ñôi ADN ligase của Năng lượng ATP Cơ chế Nối ñầu dính & ñầu phosphodiester giữa 3’- acid nucleic ARN ligase ADN ñơn, ARN phage T4 ADN ligase của E.coli NAD tù Chỉ nối ñầu dính Phản ứng nối của ligase A T C A G T A G T C T C C A T C A A G G T A G T Lai acid nucleic (lai phân tử) Lai hóa: 2 phân tử acid nucleic phân tử sợi ñôi = phân tử lai Biến tính: duplex tách ra thành Phản ứng lai ñặc hiệu: bắt cặp một vùng liên tục giữa hai mạch Phản ứng lai không ñặc hiệu: với phân tử kia G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T + Lai hóa Biến tính sợi ñơn bắt cặp bổ sung với nhau = duplex các sợi ñơn bổ sung hoàn toàn xảy ra trên một phân tử chỉ bắt cặp một phần G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng ðộ ñặc hiệu và ñộ bền của duplex – Nhiệt ñộ: quyết ñịnh ñộ bền – ðộ dài các trình tự lai: càng phản ứng càng lâu. – Tỷ lệ GC trong duplex: càng – Nồng ñộ ion: ảnh hưởng ñến – Nồng ñộ các phân tử (ADN) phụ thuộc vào: của liên kết hydro lớn duplex càng bền; thời gian cao duplex càng bền ñộ bền của liên kết hydro và thời gian phản ứng Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng Nhiệt ñộ chảy (Tm): nhiệt ñộ thành Phụ thuộc chiều dài và tỷ lệ Tm (oC) = 4(GC) + 2(AT) To > Tm: biến tính duplex To < Tm: phản ứng lai (hồi mà 50% số duplex ñược hình GC của duplex, nồng ñộ ion tính) Các kỹ thuật lai acid nucleic và ứng dụng Phản ứng lai diễn ra giữa một phân phát hiện) và một ñoạn dò (probe). Kỹ thuật – Lai trên màng rắn: kỹ thuật blot Southern blot: ñích ADN Northern blot: ñích ARN Dot blot: hh acid nucleic ñích ñược – Lai tại chỗ – Lai trong dung dịch: chẩn ñoán Lai sau tử ñích (phân tử cần ñược . Các biến thể của lai trên màng: chấm trực tiếp phát hiện dựa trên acid nucleic. khi ñiện di, cố ñịnh trên màng cellulose ðoạn dò ðoạn dò là oligonucleotid ñược – phóng xạ, huỳnh quang, enzyme, phát hiện ñược sự lai có diễn ñích có tồn tại hay không. Ứng dụng: •Trong shpt, phát hiện sự tồn tại cứu sự biểu hiện gen. •Trong y học : chẩn ñoán phát hiện nghiên cứu bệnh học. ñánh dấu: ra hay không hay phân tử của acid nucleic ñích, nghiên bệnh dựa trên acid nucleic và So u t h e r n b l o t S o u t h e r n b l o t Kỹ thuật PCR: sao chép ADN in vitro Khuôn ADN sợi ñơn ñượ ñặc hiệu ADN polymerase kéo dài bổ sung với khuôn ADN Phản ứng ñược quay vò • Mồi thừa Polymerase • Tái tạo khuôn ADN sợi bằng nhiệt ñộ cao 3’-OH5’-P 3’-OH nucleotid c gắn mồi nhờ lai hóa mồi theo nguyên tắc sợi ñơn ADN sợi ñôi ng nhờ ñơn từ sản phẩm sợi ñôi 5’-P PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ ADN đích ADN đích biến tính Gắn mồi Kéo dài 3’ 3’ Đoạn đích Biến tính Gắn mồi Kéo dài Biến tính và gắn mồi Kéo dài quay lại Tiếp tục biến tính, gắn mồi và kéo dài trong 20 3’ 3’ Đoạn đích Sau mỗi chu kỳ số ADN sợi ñơn làm khuôn mẫu cho việc gắn mồi tăng gấp ñôi số sản phẩm tăng theo cấp số nhânquay lại -40 chu kỳ Kỹ thuật PCR gồm 3 bước biến tính ADN sợi ñôi thành các sợi ñơn nhiệt ñộ, ủ các ñoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp ñặc hiệu) với các AND enzym kéo dài các ñoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu nhờ sợi ñơn, . PCR - Các yếu tố kỹ thuậ Chương trình PCR – Biến tính khởi ñầu: 95oC / 5 – Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặ Biến tính: 94-95oC, 30 giây Gắn mồi: 40-70oC (< Tm củ Kéo dài: nhiệt ñộ ≈ nhiệt ñộ 74oC ñối với enzym polymerase dài khuôn (thường 1 phút cho – Kéo dài kết thúc: 72-74oC / Thành phần phản ứng: 20 – Khuôn mẫu: 1 pg - 1 µg, nồng – Mồi: 0,1 - 1 µM, nồng ñộ quá giảm tính ñặc hiệu. – ðệm: cung cấp pH thích hợp thay ñổi (cần tối ưu hóa), thường – Hỗn hợp các dNTP: A, T, G va – ADN polymerase chịu nhiệt: – Nước vừa ñủ. t -10 phút p lại 25-40 lần vài phút a mồi), 30 - 60 giây tối thích của enzym (thường là 65- chịu nhiệt), thời gian tùy theo ñộ mỗi kb) vài lần thời gian kéo dài -100 µl ñộ cao sẽ ức chế phản ứng. cao sẽ dẫn ñến bắt cặp sai và làm cho phản ứng và có nồng ñộ Mg2+ trong khoảng 0,5-5 mM. ̀ C, nồng ñộ 200-250 µM 0,5 - 2,5 ñơn vị cho mỗi phản ứng Nguồn gốc và ñặc ñiểm một s Lựa chọn tùy theo – ðộ chính xác mong muố – ðộ dài của khuôn mẫu – Giá thành và tính sẵn có ố ADN polymerase chịu nhiệt n Yêu cầu của mồi (primer) Chiều dài 18-30 nucleotid, với khuôn mẫu Khoảng cách các vị trí bắt mồi không quá 10 kb (tốt Tỷ lệ GC chiếm 40-60%. Các phân bố ñều, tránh dồn vào không tạo cấu trúc kẹp tóc nhau Nhiệt ñộ chảy của hai mồi khoảng 40-65oC, nhưng tốt trong PCR có trình tự bổ sung ñặc hiệu cặp trên khuôn mẫu giữa hai nhất là < 3kb) nucleotid AT và GC ñược một chỗ. Trình tự của mồi và hai mồi không bắt cặp với phải gần nhau và trong nhất là 52-58oC Nồng ñộ mồi, nhiệt ñộ bắ Nồng ñộ: 0,1 µM - 1 µM Công thức tính Tm = 2 Nhiệt ñộ bắt cặp = Tm t cặp (A+T) + 4(G+C) - 5oC (cần ñược tối ưu) Các yếu tố cần ñược tối ưu hóa trong PCR Nồng ñộ Mg2+: liên quan ñến khả năng xử lý khuôn mẫu của polymerase, cần tối ưu hóa cho từng khuôn mẫu khác nhau. khoảng 0,5-5 mM Nhiệt ñộ gắn mồi = Tm – quyết ñịnh tính ñặc hiệu của phản ứng. – quá cao phản ứng khó diễn ra, quá thấp hiệu. Thường trong - 5oC (cần ñược tối ưu) → không ñặc Yếu tố quyết ñịnh kích thước ñoạn khuếch ñại Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược Tối ña tùy theo khả năng xử lý của enzym Thường <3 kb ñối với enzym thông thường. Có thể ñến 40 kb ñối với một số enzym ñặc biệt. Vai trò, nồng ñộ Mg++ Liên quan ñến cấu trúc nhiệt ñộ chảy và sự gắ Thường ñược cung cấp hay sulfat Mỗi phản ứng có nồng nhau cần khảo sát b Nồng ñộ thường dùng: , tính ổn ñịnh của khuôn, n mồi dưới dạng muối chlorid ñộ Mg++ tối ưu khác ằng thực nghiệm 0,5-5 mM Nồng ñộ dNTP trong PCR Nồng ñộ: 20-200 µM / Nồng ñộ quá cao làm tăng tỷ lệ lỗi hoặc ức chế hoạt ñộng enzym Taq Mất cân bằng về tỷ lệ cá Nồng ñộ quá thấp tạo các sản phẩm không hoàn chỉnh mỗi loại polymerase c nucleotid tăng lỗi Ưu nhược ñiểm Ưu – Nhanh, ðơn giản, Nhạy, Nhược – Phải biết trình tự 2 ñầu – Ngoại nhiễm mất tính ñ ðặc hiệu ñể thiết kế mồi ặc hiệu Kiểm soát ngoại nhiễm trong PCR Phản ứng dễ bị nhiễm ngoại lai và chúng có thể với mẫu. Các ADN lạ này có thể sự khuếch ñại trước ñó nguồn khác. Kiểm soát: – qui trình thực hiện phải – kiểm tra chất lượng enzym – sử dụng bộ pipet riêng – các thành phần phản ứng – khu vực chiết tách ADN, hiện sản phẩm nên tách chiếu UV ñể làm giảm acid nucleic tạp của các ñoạn ADN ñược khuếch ñại cùng ñược mang sang từ các (amplicon) hoặc từ các ñược tuân thủ chặt chẻ, một cách nghiêm ngặt nên ñược phân liều trước, thực hiện phản ứng và phát biệt và thường xuyên ñược trong không khí. Các Biến thể: Nested PCR (PCR tổ) Khi khuôn mẫu có chất lượng kém hoặc việc thiết kế mồi có tính ñặc hiệu gặp khó khăn → sản phẩm PCR không ñặc hiệu PCR (tổ): thực hiện 2 phản ứng PCR liên tiếp với nhau: – Phản ứng 1: thực hiện trên khuôn mẫu nguyên thủy, dùng bộ ngoài, cho sản phẩm chứa khuôn mẫu của bộ mồi thứ – Phản ứng 2: dùng sản phẩm của phản ứng mồi trong (1 trong 2 mồi trong Tăng tính ñặc hiệu hoặc khuếch ñại các khuôn mẫu không tốt 2 bộ mồi khác mồi 2 (mồi trong) 1 làm khuôn mẫu, với bộ có thể trùng với mồi ngoài) Phản ứng 1 Sản phẩm 1 Phản ứng 2 Sản phẩm cuối cùng Biến thể PCR: Multiplex PCR Dùng nhiều bộ mồi của nhi một phản ứng Cho phép khuếch ñại cùng lúc nhiều khuôn mẫu, ñược ứng dụng trong chẩn ñoán hiện, vd. phát hiện ñề kháng ña kháng sinh Cần thiết kế mồi và ñiều kiện PCR ñể: – Các phản ứng không ức chế hay cạnh tranh lẫn nhau – Các sản phẩm của khuôn mẫu khác nhau có kích thước hoặc ñánh dấu khác nhau. ều khuôn mẫu trong -phát Biến thể PCR: RT-PCR (PCR ngược) Khuôn mẫu là ARN Gồm 2 phản ứng liên tiếp trong – Phiên mã ngược: sử dụng ARN làm khuôn, enzym revese transcriptase, nhiệt ñộ thấp ( bản sao ADN – PCR: sử dụng bản sao ADN làm khuôn 1 ống: 40-50oC): tạo Khuôn ARN, phản ứng 1 Khuôn ADN, phản ứng 2, sản phẩm sợi ñôi Khuôn ADN, phản ứng 2, tiếp tục Sản phẩm cuối cùng Ứng dụng PCR Tạo ñoạn ADN mong mu Giải trình tự Gây ñột biến Chẩn ñoán, Phát hiện Xác ñịnh quan hệ di truy Nhận dạng tội phạm, ốn và ñịnh danh sinh vật ền Các phương pháp xác ñịnh Phương pháp hóa học Phương pháp enzym Sanger & trình tự ADN Maxam & Gilbert cộng sự Phương pháp giải trình t Phương pháp hóa học: dựa ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert) Qui trình: – Tạo ADN sợi ñơn từ ñoạn – ðánh dấu các phân tử ADN ở – Thực hiện 4 (hoặc 5) ống 1. G: + dimethyl sulphate 2. AG: + formic acid Adenin 3. TC: + Hydrazine biế 4. C: + Hydrazine + 1,5 – Xử lý 4 ống trên với piperidine kết phosphat kế nucleotid 5. A>C: NaOH 1,2N/90oC – Mỗi ống ñược nạp vào m – Kết quả ñiện di ñược ñọc ự Maxam và Gilbert vào sự thủy giải ñặc trưng của ADN cần giải trình tự một ñầu phản ứng riêng biệt: Guanine bị methyl hóa và Guanine bị metyl hóà n ñổi Thymin và Cytosin M NaCl biến ñổi Cytosin 1M/90oC ñể cắt ADN ở liên bị biến ñổi cắt ADN ở Adenin > Cytosin ột giếng ñiện di và biện luận trình tự Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert Phương pháp giải trình t Phương pháp enzym/dideoxy: ngừng tổng hợp ADN khi g nucleotid (Frederick Sanger) Qui trình: – Thực hiện 4 phản ứng PCR riêng bi 1.A: có dNTP + ddATP T: có dNTP + ddTTP2. 3.G: có dNTP + ddGTP 4.C: có dNTP + ddCTP – Mỗi ống sản phẩm ñược – Kết quả ñiện di ñược ñọ ự Sanger dựa vào sự ặp phải dideoxy ệt với 1 mồi: nạp vào một giếng ñiện di c trình tự ðọc kết quả Phương phá 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ Trình tự cần giải: Kết quả điện di các phản ứng: Phản ứng với ddA (T): số nu 5’-CCGGCGCA 8 5’-CCGGCGCAGA 10 5’-CCGGCGCAGAA 11 5’-CCGGCGCAGAAGCGGCA 17 Sản phẩm của các phản ứng: Phản ứng với ddC (G): số nu 5’-C 1 5’-CC 2 5’-CCGGC 5 5’-CCGGCGC 7 5’-CCGGCGCAGAAGC 13 5’-CCGGCGCAGAAGCGGC 16 5’-CCGGCGCAGAAGCGGCATC 19 Phản ứng với ddG (C): số nu 5’-CCG 3 5’-CCGG 4 5’-CCGGCG 6 5’-CCGGCGCAG 9 5’-CCGGCGCAGAAG 12 5’-CCGGCGCAGAAGCG 14 5’-CCGGCGCAGAAGCGG 15 Phản ứng với ddT (A): số nu 5’-CCGGCGCAGAAGCGGCAT 18 5’ 3’ G A T C Số nu 19 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 18 p Sanger 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ ddG ddA ddT ddC 3’ 5’ ðọc kết quả Phương pháp Sanger
File đính kèm:
- phuong_phap_phan_tich_adn.pdf
