Bài giảng Kết hợp kháng nguyên, kháng thể - Nguyễn Văn Đô

KẾT HỢP 
KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ 
PhD: Nguyễn Văn Đô 
MỤC TIÊU 
1. Trình bày được các đặc tính và lực liên kết 
của phản ứng kết hợp kháng nguyên (KN)-
kháng thể (KT). 
2. Nêu được nguyên lý và các loại phản ứng 
tủa, cho ví dụ 
3. Trình bày được nguyên lý và các loại phản 
ứng ngưng kết 
4. Trình bày được các loại miễn dịch đánh dấu 
1. ĐẠI CƯƠNG 
1.1. Ba đặc tính của phản ứng kết hợp KN-KT. 
•  Đặc hiệu: KT chỉ kết hợp đặc hiệu với KN. 
Ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh và 
nghiên cứu. 
•  Thuận nghịch: Kết hợp và phân ly, cấu trúc 
KN và KT không thay đổi. Sự phân ly phụ 
thuộc vào một số yếu tố như pH, nồng độ 
muối, nhiệt độ. 
•  Tạo nhiệt: 2-4Kcal/mol. 
9/23/15 PhD. Nguyễn Văn Đô, Bôn môn: MD-SLB 
1.2. Các lực liên kết giữa KN-KT 
Là những lực hóa lý thông thường, gặp trong các liên kết enzyme-
cơ chất, hocmon với receptor 
Các lực Nguồn gốc 
Cầu nối hydro 
Lực hút tĩnh điện 
Lực Van der Waal 
Lực hút kỵ nước 
Tương tác giữa các nhóm 
mang điện trái dấu 
Hydro liên kết với các nguyên 
tử mang điện âm (N,O) 
Chuyển động của các đám 
mây điện tử xung quanh 
các phân tử làm cho phân 
tử có cực 
Các nhóm kỵ nước gần 
nhau tương tác và giải 
phóng các phân tử H20 
9/23/15 PhD. Nguyễn Văn Đô, Bôn môn: MD-SLB 
1.3. Khái niệm epitop và paratop 
•  Epitop là vị trí kháng nguyên kết 
hợp trực tiếp với kháng thể. Có 
nhiều loại epitop khác nhau (xem 
hình) 
Paratop là vị trí của kháng thể 
kết hợp với kháng nguyên 
KN nhỏ: 2 epitop; Vị trí KHKN: 2 
KN trung bình: 6 epitop;KHKN: 4 
KN lớn: 10 epitop; KHKN: 8 
KN vừa: 6 epitop; Vị trí KHKN: 4 
KN lớn: 10 epitop; Vị trí KHKN: 8 
1.4. Ái tính và háo tính 
1.4.1. Ái tính (affinity) của 
KTvới KN được biểu thị 
bằng tổng hợp tất cả các 
lực liên kết giữa 1 paratop 
với 1 epitop. 
KT + KN KN-KT 
[KN.KT] 
[KN]x[KT] 
K 
K: là hằng số kết hợp 
Sự kết hợp và phân ly của 1 KN 
đơn hóa trị 
Sự kết hợp và phân ly của 1 KN 
đa hóa trị 
1.4.2. “Háo tính”(avidity) của KT 
là biểu thị tất cả các lực liên 
kết giữa các KT và KN đa hóa 
trị 
•  Háo tính phụ thuộc vào số 
epitop của KN và số hóa trị của 
KT (IgG, IgM..), pH, các lực, 
nhiệt độ và hằng số kết hợp. 
•  Ái tính có ý nghĩa lý thuyết, 
còn háo tính có ý nghĩa thực 
tế. 
Sự kết hợp và phân ly của 1 KN 
đơn hóa trị 
Sự kết hợp và phân ly của 1 KN 
đa hóa trị 
9/23/15 PhD. Nguyễn Văn Đô, Bộ môn: MD-SLB 
•  Phản ứng tủa 
•  Phản ứng ngưng kết 
•  Phản ứng miễn dịch đánh dấu 
2. CÁC LOẠI PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN-KT 
2.1. Phản ứng tủa 
Nguyên lý chung. 
Các KN hoặc KT ở dạng 
hòa tan kết hợp với KT 
hoặc KN đặc hiệu tương 
ứng tạo thành các phức 
hợp miễn dịch (tủa) có 
thể nhìn thấy được. 
 Các loại phản ứng tủa: 
•  Môi trường lỏng 
•  Môi trường gel 
Thừa KT Tương 
đương 
Thừa KN 
Lượng KN thêm vào 
Lư
ợn
g 
K
T 
ng
ư
ng
 k
ết
2.1.1. Phản ứng tủa trong môi trường lỏng để 
phát hiện KN hoặc KT (Định tính) 
- Cho KT vào mỗi ống nghiệm 
- Nhỏ từ từ KN lên trên lớp KT 
- Vòng tủa xuất hiện giữa 2 lớp KN và KT (ống 5) 
- Các ống chứng: 1,2,3,4: 
1 
Vòng tủa 
3 4 5 2 
2.1.1.1. Vòng tủa trong môi trường lỏng 
KN 100µl 
KT 100µl 
Tủa: mờ, đục 
1 2 
2.1.1.2. Tủa đều trong môi trường lỏng 
- Cho KT vào một ống nghiệm 
- Thêm một lượng KN tương ứng 
- Lắc đều và quan sát tủa hình thành 
Dung 
dịch 
đệm KN 
KT 
Lượng KN tăng dần 
Thừa KN Thừa KT 
Lư
ợ
ng
 tủ
a 
Tương 
đương 
2.1.2.3. Kết tủa 
trong môi trường 
lỏng: Heidelberger 
và Kendall 
2.1.2. Kết tủa trong môi trường gel 
(argarose) 
•  Khuếch tán một chiều trong gel 
•  Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony. 
•  Điện di đối lưu, kỹ thuật Kohn 
•  Điện di miễn dịch. 
2.1.2.1. Định tính 
2.1.2.2. Định lượng 
•  Khuếch tán vòng đơn. Mancini 
•  Điện di tên lửa-Laurell 
•  Điện di miễn dịch hai chiều 
Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony 
KN KT 
β2m 
thỏ 
KT 
kháng 
β2m 
Cơ chế 
hình thành 
hình cựa 
gà 
β2m 
lợn 
2 
1 
3 
KN1 KN1 
KT1 
KN1 KN2 
KT1 
KT2 
Điện di miễn dịch 
+ 
Nơi để huyết thanh 
Rãnh để kháng HT 
+ - - 
- Lam kính đã phủ kín một lớp gel 
- KN: HT người bình thường 
- KT: Kháng HT người bình thường (ngựa) 
Mancini: HT ngựa bình thường+ KT kháng chuỗi gamma 
A 
B 
C 
1 2 3 4 5 6 
Đường kính vòng tủa (mm) 
N
ồn
g 
độ
 Ig
G
 (m
g/
m
l) 
- Gel chứa KT 
- A6 - A1:HT ngựa: Không pha loãng, ½, ¼  
- B: IgG ngựa tinh khiết đã biết nồng độ (từ 
trái sang phải: 30,15,7,2 và 15 mg/ml) 
- C: Các mẫu HT ngựa cần định lượng IgG 
Điện di tên lửa 
KT đã được 
trộn đều 
trong gel 
Nồng độ KN 
Nơi đặt mẫu 
KT đã trộn đều 
trong gel 
Điện di miễn 
dịch hai chiều 
2.2. Phản ứng ngưng kết 
2.2.1. Nguyên lý chung: 
KN nằm trên bề mặt tế bào (hồng cầu, bạch 
cầu) hoặc các hạt nhân tạo mang kháng 
nguyên kết hợp với KT đặc hiệu tạo thành các 
mạng lưới KN-KT (ngưng kết) và có thể quan 
sát được. 
 2.2.2. Các loại ngưng kết: 
–  Chủ động (KN là các tế bào hồng cầu, bạch cầu, 
tiểu cầu, tinh trùng). 
–  Thụ động (KN hoặc KT gắn nhân tạo lên các hạt 
 Khi KN gắn lên hạt nhân tạo như HC nhóm O, 
HC cừu hoặc hạt latex thì phản ứng gọi là 
ngưng kết thụ động thuận, còn khi KT gắn lên 
các hạt trên thì gọi là thu động ngược). 
2.2.3. Một số ví dụ. 
•  Ngưng kết chủ động (xác định nhóm hồng cầu) 
Các loại hồng cầu 
Các cấu trúc cacbohydrat 
Các loại HT 
KTK A&B 
KTK B 
KTK A 
Không 
 KTK A&B 
HT mẫu 
Các loại hồng cầu 
PhD. Nguyễn Văn Đô, 
Bôn môn: MD-SLB 
Mẹ Rh-, Con Rh+ 
Trực tiếp Gián tiếp 
 HC con+KT mẹ Huyết thanh mẹ 
Thêm HC Rh+ và rửa KT 
không gắn 
+KT thỏ kháng Ig người +KT thỏ kháng Ig người 
Ngưng kết 
•  Nghiệm pháp 
Cooms trực tiếp và 
gián tiếp 
2.3. Phản ứng miễn dịch đánh dấu 
Nguyên lý chung: 
KN hoặc KT được gắn với enzym hoặc một 
trong số các chất hóa học khác (phóng xạ, 
huỳnh quang) để làm tăng khả năng nhận 
biết phức hợp KN-KT lên rất nhiều lần. 
Đặc điểm: 
•  Độ nhạy rất cao: có thể phát hiện được các 
phân tử KN hoặc KT ở nồng độ hoặc mật độ 
thấp 
•  Các chất đánh dấu không làm biến tính KN 
hoặc KT 
•  Thường phải đọc kết quả ở các thiết bị 
chuyên dụng. 
2.3.1. Miễn dịch huỳnh quang (MDHQ) 
2.3.1.1. Nguyên lý 
Ánh sáng kích thích Ánh sáng phát ra 
2.3.1.2. Các loại MDHQ 
•  MDHQ trực tiếp: Xác định các kháng 
nguyên ở các vị trí khác nhau của tế bào 
và lát cắt tổ chức: Insulin ở mô tụy 
•  MDHQ gián tiếp: Phát hiện kháng thể 
kháng nhân 
2.3.2. Nguyên lý cơ bản 
của kỹ thuật ELISA 
(enzyme-linked 
immunosorbent assay) 
và RIA (Radio 
Immunoassay). 
Mẫu 1: KN A Mẫu 2: KN B 
Thêm KT kháng A 
gắn Enzyme 
Rửa KT Ko gắn 
Enzyme phân hủy 
cơ chất, tạo màu 
Đo độ hấp phụ ánh sáng 
Enzyme: Peroxidase 
Đồng vị phóng xạ: Iod 125, 
Cacbon 14 
Xin trân trọng cảm ơn 
PhD. Nguyễn Văn Đô, 
Bộ môn: MD-SLB