Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng của CNSH động vật, người và y sinh

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG 
(SH3014)
Giảng viên:
BM CNSH TV – Khoa CNSH
1
CHƢƠNG III: CÁC PHƢƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG CỦA CNSH ĐỘNG VẬT, 
NGƢỜI VÀ Y SINH (8 TIẾT)
2
BM CNSH TV – Khoa CNSH
3.1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
3.2. Công nghệ tế bào gốc
3.3. Công nghệ nhân bản động vật
3.4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật
3.5. Công nghệ vacxin tái tổ hợp và sản xuất kháng
thể đơn dòng
3.6. Dự án genom ngƣời và các ứng dụng
3.7 Công nghệ hỗ trợ sinh sản
3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
(kiến thức cần nhớ)
3
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Đặc điểm của tế bào động vật
•
10-100 microns 
Có hình cầu trong dung dịch 
Không có thành tế bào 
Màng plasma mỏng, dễ vỡ và 
dễ bị biến đổi 
Bề mặt tích điện âm Sinh 
trƣởng trên bề mặt tích điện 
dƣơng ví dụ: Collagen 
3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
(kiến thức cần nhớ)
4
BM CNSH TV – Khoa CNSH
•
Chu kỳ tế bào 
G1 Phase:
·Tế bào bƣớc vào pha tổng hợp 
hoặc 
·Thoát khỏi chu kỳ tế bào để tiến 
hành phân hoá (reversible or 
irreversible) 
·Các tế bào rất nhạy cảm để tác 
động điều khiển ở thời điểm này 
S Phase: Tổng hợp DNA
G2 Phase: Tế bào chuẩn bị cho 
nguyên phân Mitosis
3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
5
BM CNSH TV – Khoa CNSH
3.1.1 KHÁI NIỆM
Là nuôi cấy mô, tế bào tách rời khỏi cơ thể nếu đƣợc đặt
trong môi trƣờng đảm bảo dinh dƣỡng và nhiệt độ thích hợp
thì tế bào sẽ sống và tiếp tục phân chia.
Quá trình có thể diễn ra liên tục nếu sau từng thời gian
nhất định tiến hành rửa và bổ sung dung dịch nuôi cấy mới.
Các mô, tế bào động vật hay sử dụng trong nuôi cấy: phôi
ngƣời, phôi gà, thận khỉ, phôi lợn, màng ối ngƣời
3.1.2 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY
• NUÔI CẤY CƠ QUAN
• NUÔI CẤY MÔ
• NUÔI CẤY TẾ BÀO
3.1 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO 
ĐỘNG VẬT
6
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Nuôi cấy cơ quan (Organ Culture): là quá trình nuôi cấy toàn bộ phôi,
cơ quan hoặc mô đƣợc cắt ra khỏi cơ thể bằng giải phẫu mẫu sống
(vivisection) hoặc ngay sau khi não dừng hoạt động .
Đặc điểm:
Kiến trúc và các chức năng sinh lý bình thƣờng đƣợc duy trì.
Các tế bào vẫn ở trạng thái phân hóa (fully differentiated).
Tốc độ sinh trƣởng chậm.
Cần mẫu tƣơi cho mỗi lần thí nghiệm.
Hạn chế khi nuôi cấy trên quy mô lớn.
Nuôi cấy mô (Tissue Culture): Nuôi cấy những mẩu cắt ra từ các mô cắt
rời
Đặc điểm:
Một số chức năng bình thƣờng có thể vẫn đƣợc duy trì.
Tổ chức ban đầu của mô bị phá huỷ.
Có thể ứng dụng cho nuôi cấy quy mô lớn
3.1 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ 
TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
10/18/2011 7
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Nuôi cấy tế bào (Cell Culture): Mô hoặc một phần của mẫu 
đƣợc làm tan rã ra, chủ yếu là bằng xử lý enzyme, thành 
dịch huyền phù tế bào. Nguồn nguyên liệu này đƣợc sử dụng 
cho nuôi cấy đơn lớp hoặc nuôi cấy huyền phù.
Đặc điểm:
Phát triển dòng tế bào qua một số thế hệ
Có thể nuôi cấy trên qui mô lớn
Các tế bào có thể bị mất đi một số đặc tính phân hoá.
NUÔI CẤY ĐƠN LỚP
8
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Ƣu điểm:
Dễ dàng thay đổi môi trƣờng và rửa tế bào trƣớc khi bổ
sung môi trƣờng mới
Các tế bào liên kết nhau thể hiện dễ dàng hơn
Linh hoạt (Flexible) và có thể sử dụng đối vơi tất cả các
loại tế bào
Nhƣợc điểm:
Khó triển khai trên qui mô lớn
Cần nhiều không gian hơn so với nuôi cấy huyền phù
Khó định lƣợng các thông số cho mẫu để điều khiển sự
sinh trƣởng tế bào
Việc đo Oxygen và pH gặp khó khăn
Nuôi cấy các tế bào phát triển theo kiêu liên kết bám 
dính (Anchorage Dependent Cultures)
9
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Đặc điểm:
- Sự nhân lên của các tế bào liên kết bám dính chỉ có thể xảy
ra khi tạo đƣợc bề mặt nuôi cấy phù hợp.
- Quá trình liên kết của các tế bào liên quan một loạt các
bƣớc:
• Sự bám của các yếu tố dinh kết với bề mặt nuôi cấy (Cold insoluble
globulin or other attachment glycoproteins)
• Sự liên kết giữa tế bào với bề mặt nuôi cấy
• Sự dính kết các tế bào với bề mặt đƣợc bao phủ. (các chất heparan
sulfate đa dạng được tổng hợp bởi tế bào )
• Sự phát triển lan rộng của các tế bào đã liên kết
- Bề mặt nuôi cấy phải có tính hút nƣớc và đƣợc tích điện tối
ƣu trƣớc khi qúa trình dính kết xảy ra.
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
10
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Đặc điểm:
Có khả năng sinh trƣởng và phân hoá mà không cần quá trình gắn
kết các tế bào với nhau.
Có thể sử dụng các thiết bị nuôi cấy trên qui mô lớn Spinner
Flasks, Stirred-Tank Bioreactors, Air lift Bioreactors
Phƣơng pháp nuôi cấy
11
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Một số khái niệm dòng tế bào
10/18/2011 12
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Dòng tế bào (Cell Lines) – là thuật ngữ dùng để chỉ một
quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban
đầu
Dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Lines) –là dòng tế
bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ và có
khả năng duy trì khả năng phân bào trong thời gian rất dài
hoặc vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính.
Sự sinh trƣởng của tế bào nuôi cấy
13
BM CNSH TV – Khoa CNSH
14
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
15
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Thành phần : các muối vô cơ,
dinh dƣỡng, các chất đệm
(phenol red).
Các muôí vô cơ (Na, K, Ca, Mg,
Cl, P), vi lƣợng (iron, zinc,
selenium), Đƣờng (glucose là
phổ biên nhât), Axit amin, vitamin
Huyết thanh
Kháng sinh
pH
Hầu hết tế bào sinh trƣởng tốt ở
pH 7.4 Một số fibroblasts cần pH
7.4-7.7
Các tế bào biến nạp pH 7.0-7.4
Các tế bào Epidermal đôi khi cần
pH 5.5
Sử dụng chỉ thị Phenol Red
– Có mầu tím ở pH 7.8
– Mầu hồng ở pH 7.6
– Mầu đỏ ở pH 7.4
– Da cam ở pH 7.0
– Vàng ở pH 6.5
Ví dụ về 
nuôi cấy 
mô não 
chuột 
ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
17
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh
• Sản xuất các hợp chất sinh học
+ Vacxin virus
+ Hoạt chất sinh học
+ Interferon
+ Kháng thể đơn dòng
• Tạo các nguyên liệu cấy ghép
• Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy
• Sản xuất các virus diệt côn trùng
+Bacolovirus
3.2 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC
18
BM CNSH TV – Khoa CNSH
3.2.1 KHÁI NIỆM
Là các tế bào có khả năng phân chia liên tục trong nuôi cấy và phát
triển thành các tế bào chuyên hoá.
3.2.2 ĐẶC TRƢNG CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO GỐC
– có khả năng tự tái tạo mới
– có thể biệt hoá thành những tế bào và tổ chức chuyên biệt đảm 
nhiệm những chức năng đặc biệt. 
– có thể phân lập và duy trì đƣợc ở trạng thái chƣa bịêt hoá. 
– có thể tăng sinh và biệt hoá khi đƣợc chuyển vào động vật có hệ 
thống miễn dịch đã bị tổn thƣơng. 
PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo tiềm năng biệt hóa)
19
BM CNSH TV – Khoa CNSH
•
2
các TB phôi ở giai
đoạn tiếp sau giai
đoạn nêu trên (nút
phôi và dưỡng
phôi). Phân hóa
thành các TB vài
tiềm năng
3
TB có khả năng
phân hóa thành một
loại hay một họ các
TB chuyên hóa xác
định
TB đa tiềm năng
TB toàn năng
TB vài tiềm năng 
(TB mầm)
1
Tế bào hợp tử và
các tế bào phôi ở
giai đoạn 4-8 tế
bào.
Có thể phát triển
thành cơ thể hoàn
chỉnh
Day 1
Fertilized egg
Day 3-4
Multi-cell embryo
Day 5-6
BlastocystDay 11-14
Tissue Differentiation
PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo nguồn gốc)
21
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Tế bào gốc phôi (Embryogenic Stem Cells)
Tế bào gốc trƣởng thành (Adult/Mature Stem 
Cells)
ĐẶC ĐiỂM CỦA ASC VÀ ESC
22
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Tế bào gốc trƣởng thành Tế bào gốc của phôi/ bào thai
có mặt trong nhiều tổ chức của cơ thể
mặc dù với một số lƣợng rất ít.
mature body tissues, umbilical cord,
placenta
chỉ có ở một số vị trí, trong một số tổ 
chức nhất định của phôi, phôi nang và 
bào thai
có khả năng biệt hoá thấp hơn và chỉ 
sản xuất ra những tế bào đặc hiệu 
cho loại tổ chức cội nguồn của 
chúng.
có thể tạo nên những cụm tế bào có 
thể biệt hoá tự nhiên tạo ra nhiều 
loại tế bào (toàn năng, đa năng).
Đƣợc phân lần đầu năm 1960s Phân lập lần đầu năm 1998
Đã áp dụng trị liệu thành công trên 
bệnh nhân 
Chỉ nên áp dụng trên động vật
TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Có hai loại:
* Tế bào gốc bào thai (ES embryonic stem cell) lấy từ khối tế 
bào nội phôi
* Tế bào mầm bào thai(EG embryonic germ cell) lấy từ rãnh 
sinh dục của bào thai 
ES phân chia 300-450 lần/2 năm 
EG 40-80 lần /2năm
NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
phôi thụ tinh in vitro
phôi nạo
NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
chuyển nhân soma
ƢU ĐiỂM CỦA TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
•Có thể tạo thành tất cả các loại tế bào trong cơ 
thể
•Nếu lấy từ phôi nhân bản không có phản ứng đào 
thải của hệ miễn dịch 
•Có thể duy trì thời gian dài trong nuôi cấy 
HẠN CHẾ CỦA TẾ BÀO GỐC PHÔI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
•Nếu lấy từ IVF, có thể bị đào thải 
•Khó điều khiển quá trình phân hoá 
•Yêu cầu nhiều bƣớc trung gian để định hƣớng 
sinh ra loại tế bào mong muốn
TẾ BÀO GỐC TRƢỞNG THÀNH
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Có nhiều trong tổ chức của động vật và ngƣời: não, tuỷ 
xƣơng, máu, tuỷ răng, tuỷ sống, võng mạc, gan
TẾ BÀO GỐC TRƢỞNG THÀNH 
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Mục đích: 
–Chữa và điều trị bệnh 
–Khai thác khả năng tự sửa chữa của gen 
• Ứng dụng: 
–Bệnh nhân có thể dùng tế bào gốc của bản 
thân để trị bệnh. 
–Không cần tìm ngƣời hiến tƣơng thích (Giống 
trƣờng hợp cấy ghép nhƣng không bị đào thải)
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Không có quá trình thụ tinh
• Đƣợc nuôi sống trong đĩa petri giống nhƣ các loại tế
bào khác
Từ các mô trƣởng thành
Từ mô dây rốn & nhau thai
Nguồn cung cấp tế bào gốc trưởng thành
Khả
Năng
Phân
Hoá
của
ASC 
Ví dụ bệnh bạch cầu
ƢU ĐiỂM CỦA ASC
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Có thể nuôi cấy ngoài cơ thể làm nguồn tế bào cung cấp 
cho cấy ghép. 
• Sự đào thải cơ quan hoặc mô đƣợc hạn chế nếu bệnh 
nhân đƣợc tiếp nhận chính tế bào của mình 
• Có khả điều khiển để kích thích sự sinh trƣởng của các 
loại tế bào chuyên hóa
NHƢỢC ĐIỂM CỦA ASC
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Thời gian duy trì trong nuôi cấy ngắn 
Khó phân lập và tách chiết 
Chỉ phân hoá thành một số loại tế bào chuyên hoá 
Không phổ biến, hầu nhƣ rất hiếm ở ngƣời cao tuổi 
Sự phát triển và tăng trƣởng cần đƣợc định hƣớng khi cấy vào cơ 
thể nhận.
Khả năng bị đào thải nhƣ một mô lạ là khá cao 
Sự nhiễm bởi viruses, bacteria, fungi, and Mycoplasma.
• Còn đang đƣợc nghiên cứu: “vì sao có tế bào gốc không 
biệt hoá trong khi các tế bào lân cận đã biệt hoá”?
• Có bao nhiêu loại? Có ở tổ chức nào?
• Có khả năng biệt hoá đa năng không?
• Chƣa biết các tế bào gốc nuôi cấy in vitro (ngoài phôi) có 
thể hiện đầy đủ các chức năng nhƣ tế bào tự nhiên hay 
không 
• Các tế bào gốc cần đƣợc cho phân hóa thành tế bào thích 
hợp trƣớc khi dùng để trị bệnh.
• Gần đây đã phát hiện một số bất thƣờng về số lƣợng và 
cấu trúc của nhiễm sắc thể trong ba dòng ESC của ngƣời.
1968, cấy ghép thành công tế bào tuỷ cho bệnh nhân 
bị suy giảm hệ thống miễn dịch (SCID-Severe 
combined immunodeficiency)
Từ 1970’s, cấy ghép tuỷ đƣợc ứng dụng để chữa bệnh 
immunodeficiencies và leukemias (bạch cầu)
• 1954 – John Enders nhận giải thƣởng Nobel về y tế về công trình
nuôi cấy virus bại liệt trong tế bào thận của ngƣời
• In 1998, James Thomson (University of Wisconsin-Madison) phân lập
đám tế bào lớp trong của phôi non và phát triển dòng tế bào gốc phôi
ngƣời đầu tiên.
• 1998, John Gearhart (Johns Hopkins University) phát triển tế bào
mầm thai từ các tế bào trong các mô sinh dục của thai (Tế bào mầm
nguyên thuỷ-primordial germ cells).
• Các dòng tế bào đa tiềm năng(Pluripotent stem cell “lines”) đƣợc
phát triển từ hai nguồn trên
• 2001 – phôi ngƣời lần đầu tiên đƣợc nhân 
dòng (chỉ nhân đến giai đoạn 6 tế bào) bởi 
Advanced Cell Technology (USA)
• 2004* – First human cloned blastocyst 
created and a cell line established (Korea)
*Hwang, W.S., et al. 2004. Evidence of a Pluripotent Human 
Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned 
Blastocyst. Science 303: 1669-1674.
KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Trong nghiên cứu cơ bản1
Thử nghiệm về an toàn dƣợc phẩm2
Tế bào trị liệu3
Trong nghiên cứu cơ bản
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Tìm hiểu các tác nhân tham gia vào quá trình xác định
hƣớng biệt hóa của tế bào, Trong quá trình này sự đóng
mở các gen có vai trò quyết định
• Nắm đƣợc cơ chế điều khiển các gen biệt hóa sẽ góp
phần quan trọng trong việc phòng và chữa các bệnh do
rối loạn chức năng của các gen này ( ƣng thƣ, sự phát
sinh các dị tật...)
• Là cơ sở cho việc điều khiển một tế bào qua thao tác
gen phát triển thành một cơ thể
Thử nghiệm về an toàn dƣợc phẩm
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Các TB đa tiềm năng là đối tƣợng quan 
trọng để thử nghiệm về an toàn dƣợc 
phẩm in vitro và in vivo
Dƣợc phẩm
Mô, 
cơ quan
Nuôi cấy 
biệt hóa
Nghiên cứu
Tìm hiểu đƣợc cơ
chế, hiệu quả và
những tác động
không mong muốn
của dƣợc phẩm thử
nghiệm đối với cơ thể
sống
Tế bào trị liệu
Bệnh gây nên do 
rối loạn chức 
năng tế bào, sự 
thoái hóa các tế 
bào mô cơ thể
Thay thế các cơ 
quan lấy từ cơ thể 
khác
Nguồn cung hạn 
chế
Kích thích các tế 
bào đa tiềm năng 
phát triển thành tế 
bào chuyên biệt, 
cấy các tế bào này 
vào cơ thể
Có triển vọng lớn
nhưng cần phải nắm rõ các sự kiện diễn ra trong quá trình biệt hóa, để 
đinh hướng sự biệt hóa.Vượt qua hàng rào miễn dịch của cơ thể.
1 2
TẾ BÀO TRỊ LiỆU
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Tế bào trị liệu
–Sử dụng tế bào gốc tạo máu:
–Sử dụng tế bào gốc phôi thai:
• Điều trị đái tháo đường
• Tái tạo hệ thống thần kinh bằng tế bào gốc
• Điều trị bệnh lý tim mạch
• Điều trị thực nghiệm bằng gen
SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC MÁU
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Điều trị bệnh của cơ quan tạo máu và các cơ 
quan khác
–Ung thư máu: chiếu xạ hoặc hoá chất phá hỏng tế 
bào tạo máu rồi thay thế tế bào gốc tạo máu.
–Tế bào gốc tạo máu có tác dụng điều trị nhiều 
bệnh ung thư khác: ung thư phổi, tuyến tiền liệt, 
ung thư vú có khả năng chống khối u, tế bào 
bệnh lý. 
SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC THAI
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Sử dụng tế bào gốc bào thai: điều trị các bệnh của
các tổ chức khác nhau: tế bào gốc (tế bào mầm bào
thai) tế bào chuyên biệt: bệnh parkinson, đái đƣờng,
bệnh tim mạch, bệnh sƣng khớp.
– Bệnh đái tháo đƣờng: tế bào gốc có thể sinh ra tế
bào beta sản xuất insulin.
– Parkinson: tế bào gốc biệt hoá thành tế bào sản xuất
dopamin, các tế bào này có thể thiết lập lại hệ thần
kinh trung ƣơng.
– Tim mạch: Thay thế tế bào cơ tim tổn thƣơng: tế bào
gốc sẽ phát triển thành tế bào nội mạc mạch máu và
tế bào cơ trơn tạo thành mạch máu. đây là hai loại tế
bào quan trọng cấu trúc lên cơ tim.
Triển vọng ứng dụng của công nghệ tế bào gốc
Thần kinh-Neural Võng mạc-Retinal
Xƣơng-Bone Sụn-Cartilage Biểu mô -Epithelial
Ví dụ bệnh tiểu đường
3.3 CÔNG NGHỆ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT 
(Kỹ thuật cloning)
53
BM CNSH TV – Khoa CNSH
3.3.1 KHÁI NIỆM
Sử dụng nhân của tế bào sinh dƣỡng (tế bào soma) và tế bào
trứng đã loại bỏ nhân để tạo phôi vô tính trong ống nghiệm. Sau đó
cấy phôi này vào tử cung của con cái để nuôi phôi vô tính thành cơ
thể hoàn chỉnh.
Nhân bản vô tính động vật thành công đã chứng minh đƣợc tính
toàn năng của tế bào động vật.
3.3.2 CƠ SỞ KHOA HỌC
• SỰ BIỆT HÓA
• SỰ PHẢN BIỆT HÓA
• TÍNH TOÀN NĂNG CỦA TẾ BÀO
SỰ BIỆT HÓA
54
B ... ôû choã caùc phaàn cuûa gen ñöôïc söû 
duïng nhö theá naøo ñeå taïo neân caùc saûn phaåm khaùc nhau 
trong gheùp noái caùc phaàn cuûa gen theo löïa choïn 
(Alternative Splicing). Söï phöùc taïp ñöôïc gia taêng töø 
nhieàu nguoàn khaùc laø haøng nghìn bieán ñoåi hoùa hoïc sau 
dòch maõ (Post-translational chemical modification) taùc 
ñoäng ñeán caùc protein vaø chöông trình cuûa caùc cô cheá 
ñieàu hoøa kieåm soaùt caùc quaù trình ñoù.
• Ñeå xaây döïng baûn phaùt thaûo haønh ñoäng, 16 
Trung taâm giaûi kyù töï chuoãi ñaõ phaân tích hôn 
22,1 tyû base cuûa trình töï khôûi ñaàu, goàm caùc 
ñoaïn truøng laép toång coäng 3,9 tyû base vaø cung 
caáp 7 laàn phuû kín boä gen ngöôøi (coù theå hieåu laø 
giaûi kyù töï chuoãi gaáp 7 laàn boä gen ngöôøi). Hôn 
30% ñaït chaát löôïng cao, laø nhöõng trình töï cho 
keát quaû cuoái cuøng, vôùi ñoä phuû kín 8 ñeán 10 laàn, 
ñoä caån troïng 99,99% vaø moät soá choã troáng.
Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn 
CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, 
ĐHNNHN
15
6
Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn 
CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, 
ĐHNNHN
15
7
Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn 
CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, 
ĐHNNHN
15
8
Thôøi ñaïi sau boä gen (Post Genomics Era) ñaõ baét 
ñaàu vôùi caùc daáu hieäu :
– Söû duïng caùc coâng cuï vaø coâng ngheä ñeå khai thaùc 
boä gen ngöôøi. 
– Sinh hoïc phaùt trieån ôû möùc cao hôn nhö Sinh hoïc 
caùc heä thoáng (the Systems Biology).
– Söï phaùt trieån haøng loaït caùc coâng ngheä then choát 
(key tehnologies) môùi nhö Tin sinh hoïc
(Bioinformatics), Biochip vaø microarrays, Coâng 
ngheä sinh hoïc nano (Nanobiotechnology),
• – Cellomics : nghieân cöùu chöùc naêng teá baøo vaø 
taùc ñoäng cuûa thuoác ôû caáp ñoä teá baøo nhôø söï gaén 
keát vôùi coâng ngheä thoâng tin (IT). Söû duïng caùc 
thuaät toaùn (algorithm) ñeå phaân tích töï ñoäng hoùa 
hình thaùi hoïc cuûa caùc teá baøo seõ cung caáp caùc 
keát quaû ñònh löôïng giuùp cho taàm soaùt dung 
löôïng cao (high content screening). 
• Metabolomis : coâng ngheä gen ñieàu khieån trao 
ñoåi chaát. .
• Ionomics : caùc gen chi phoái söï ñieàu hoøa taát caû 
caùc ion trong teá baøo.
• Töø naêm 1999, söï phaùt trieån cuûa Genomics vaø Proteomics
daãn ñeán Coâng ngheä microarray (Microarray technology) vaø
ñeán naêm 2002 saûn phaåm ñaàu tieân coù maët treân thò tröôøng.
Xuaát phaùt töø nhu caàu thöïc teá chaån ñoaùn, caùc haõng döôïc
phaåm cuõng nhö caùc trung taâm nghieân cöùu lôùn ñaõ cho ra ñôøi
nhieàu saûn phaåm duøng cho phaùt hieän nhanh (nhö xaùc ñònh
SNP) coù theå ôû daïng chip (boï ñieän töû), daïng bi (bead) coù töø
tính (hình 4.9) hay caùc microarray (hình 4.10) vaø coù theå ôû
nhieàu daïng khaùc hoaëc laø söï keát hôïp cuûa caùc daïng treân. Töïu
chung, nhaèm taïo thuaän lôïi nhaát cho chaån ñoaùn nhanh, nhaïy
vaø chính xaùc caùc SNP ñang quan taâm.
Microarray và Biochip
Hình 4.9. Caùc vieân bi coù gaén maãu doø 
lai vôùi RNA/DNA muïc tieâu
Hình 4.10. Microarray vôùi caùc daõy 
chaám, phía treân laø chuøm tia saùng cuûa 
ñaàu doø (detector) khueách ñaïi caùc 
ñoám saùng ñeå ñoïc keát quaû
3.7. CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN
168
Gồm:
• Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
• Công nghệ cấy truyền phôi
• Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
• Kỹ thuật cắt phôi, nhân phôi từ tế bào đơn, xác 
định giới tính phôi
• Kỹ thuật điều khiển giới tính 
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
169
Khái niệm:
• TTNT là kỹ thuật mà con ngƣời tiến hành đƣa
tinh dịch hoặc tinh bảo quản (ngắn ngày hoặc
dài ngày) vào đƣờng sinh dục con cái bằng
dụng cụ chuyên dụng ở thời điểm thích hợp.
• Đây là biện pháp cải tạo giống nhanh, tiên tiến
nhằm tạo ra đàn con có sản lƣợng cao, phẩm
chất tốt và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi.
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
170
Lợi ích của thụ tinh nhân tạo
- Phát triển vốn gen - nâng cao khả năng truyền giống của
con đực
- Kiểm soát dịch bệnh (tránh lây lan qua tiếp xúc)
- Thuận tiện trong vận chuyển tinh dịch
- Tiết kiệm đực giống, kéo dài thời gian sử dụng đực giống
- Khắc phục đƣợc khó khăn do sự chênh lệch về tầm vóc
trong giao phối trực tiếp, đực giống bị thƣơng
- Có hiệu quả kinh tế
- Đáp ứng trong việc gây động dục đồng loạt
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
171
Nhƣợc điểm của thụ tinh nhân tạo
• Cần phát hiện động dục tốt
• Cần xử lý, bảo quản tinh dịch tốt
• Cần có cán bộ kỹ thuật đƣợc huấn luyện
• Cần vốn ban đầu cao (đối với cơ sở sản xuất tinh đực
giống)
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
172
Các nội dung chính trong công tác thụ tinh nhân tạo
• Tuyển chọn và huấn luyện đực giống
• Kỹ thuật khai thác tinh dịch
• Kỹ thuật kiểm tra chất lƣợng tinh dịch
• Kỹ thuật pha loãng, bảo tồn (ngắn ngày, dài
ngày)
• Kỹ thuật dẫn tinh (thụ tinh nhân tạo)
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
173
Phƣơng pháp khai thác tinh dịch
Các yêu cầu cơ bản của việc lấy tinh dịch:
+ Lấy đƣợc toàn bộ tinh dịch với phẩm chất tốt nhất và 
thuần khiết nhất
+ Phƣơng pháp lấy tinh phải an toàn cho ngƣời và vật
+ Trang bị không quá phức tạp, kỹ thuật phải đơn giản 
dễ áp dụng trong thực tiễn sản xuất
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
174
Phƣơng pháp khai thác tinh
+ Phƣơng pháp hải miên
+ Phƣơng pháp âm đạo
+ Phƣơng pháp dùng túi đặt sẵn trong âm đạo
+ Phƣơng pháp cơ giới (massage)
+ Phƣơng pháp dùng điện
+ Phƣơng pháp dùng âm đạo giả: là phƣơng
pháp đang đƣợc áp dụng rộng rãi hiện
nay
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
175
KIỂM TRA PHẨM CHẤT TINH DỊCH
* Các chỉ tiêu đánh giá thường xuyên
• Thể tích tinh dịch (V - ml): Lƣợng tinh dịch bài xuất trong 1 lần khai thác
• Hoạt lực (A - %): Tỉ lệ % tinh trùng vận động tiến thẳng trong vi trƣờng
quan sát. A càng càng cao tinh dịch càng tốt chỉ dùng A từ 0.6 trở lên
• Chỉ tiêu khác:
-Độ pH của tinh dịch, màu sắc, mùi, độ vẩn
-Nồng độ tinh trùng (C - triệu tinh trùng / ml): Số lượng tinh trùng / 1ml tinh
dịch
-Mật độ (d) kiểm tra cùng với A người ta ước lượng khoảng cách tương đối
giữa các tinh trùng với chiều dài (l) của tinh trùng nếu d < l thì mật độ dày, nếu
d > l thì mật độ thưa còn nếu d tương đương với l thì mật độ trung bình.
*Chỉ tiêu tổng hợp VAC = VxAxC: Tổng số tinh trùng có khả năng thụ thai
trong một lần khai thác
Yêu câu kỹ thuật đối với tinh dịch theo tiêu chuẩn 
Việt Nam
Chỉ tiêu Đơn vị Lợn ngoại Lợn nội Trâu bò 
Lượng tinh đã 
lọc 
ml ≥ 100 ≥ 50 ≥ 2 
Màu sắc trắng sữa trắng sữa trắng, vàng 
ngà 
Mùi tanh tanh tanh 
Mật độ từ TB trở lên từ TB trở lên từ TB trở lên 
Hoạt lực ≥ 0.7 ≥ 0.6 ≥ 0.7 
Nồng độ 106 ml ≥ 80 ≥ 20 ≥ 500 
Sức kháng ≥ 3000 ≥500 ≥ 10.000 
PH 6.8-8.1 6.8-8.1 6.4-7.8 
Tỷ lệ sống % ≥ 70 ≥ 70 ≥ 70 
Tỷ lệ kỳ hình % ≤10 ≤ 10 ≤ 10 
Độ nhiễm 
khuẩn 
103/ml ≤5 ≤ 5 ≤ 5 
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
177
KIỂM TRA PHẨM CHẤT TINH DỊCH
* Các chỉ tiêu đánh giá định kỳ
• Sức kháng của tinh trùng (R): Sức chịu đựng của tinh trùng
trong dung dịch NaCl 1%
• Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình (K - %)
• Kiểm tra thể acrosome (Ac - %)
• Các chỉ tiêu khác:
Sức kháng thẩm thấu của tinh trùng (Ro),
Độ nhớt và tỷ trọng
Chỉ số tuyệt đối sức sống của tinh trùng ngoài cơ thể (Sa)
Tỉ lệ sống (Sg%) và tỉ lệ chết (Ch%)
Hệ số giảm hoạt lực của tinh trùng (Ghh)
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
178
KIỂM TRA PHẨM CHẤT TINH DỊCH
* Một số máy móc thiết bị
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
179
KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH
Bảo tồn dạng lỏng
• Bảo tồn đông lạnh: tinh đông viên, tinh cọng rạ
( trong Ni tơ lỏng với nhiệt độ -79 tới - 193 o C )
Tinh trùng lợn 6-10o C
Tinh trùng bò -14 tới -20 o C,
Tinh trùng cừu -10o C 
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
180
KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH
Yêu cầu của môi trƣờng pha loãng
 Có các điều kiện lý, hóa, sinh thỏa mãn điều kiện sống
của tinh trùng:
 Áp lực thẩm thấu
 pH
 Có các chất điện giải và không điện giải phù hợp
 Đặc điểm vật lý phù hợp: tỷ trọng, độ nhớt
 Phải có tính kinh tế và thực tiễn
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
181
KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH
Chất liệu tạo môi trƣờng
• Chất cung cấp năng lƣợng: các loại đƣờng glucose, fructose
• Chất đệm: các muối kim loại kiềm yếu (Na3C6H5O7, NaHCO3,
hoặc lòng đỏ trứng gà (NaH2PO4/Na2HPO4)
• Chất chống choáng lạnh: glyxerin, lòng đỏ trứng (leucitin)
• Các chất chống khuẩn: penicillin, streptomycin, tetracycline 
• Các chất rửa sạch môi trƣờng: do trong tinh dịch có các kim
loại nặng đa hóa trị nhƣ Ca2+, Fe2+, Al3+...
-> bổ sung TrilonB (EDTA): Na2H2Y → 2Na
+ + H2Y2
- Ca2+ + H2Y2
- →
CaH2Y
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH
Nồng độ và liều lượng tinh dịch
• Với bò: tổng số tinh trùng trong một liều phối phải là 20 x106 có 
nghĩa là số lượng liều tinh = VxAxC= 20 x106
• Với lợn nội: nồng độ tinh trùng trong 1ml tinh dịch sau khi pha có từ 
20 -30 x 106 , liều tinh là 30ml
• Lợn ngọai: nồng độ tinh trùng trong 1ml tinh dịch sau khi pha từ 
30 - 40 x 106
– Liều phối cho lợn nái nội phải đảm bảo có 1x109 tinh trùng,
– Liều phối cho lợn lai phải đạt 1.5 x 109 tinh trùng, 
– Liều phối cho lợn nái ngoại phải đạt 3.0 x 109 tinh trùng 
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
183
KỸ THUẬT DẪN TINH
Kỹ thuật phát hiện động dục – Ví dụ chu kỳ động dục ở bò cái
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
184
KỸ THUẬT DẪN TINH (THỤ TINH NHÂN TẠO)
Kỹ thuật phát hiện động dục - Ví dụ chu kỳ động dục ở bò
cái
Giai đoạn 1 - trước động dục (hay trước chịu đực)
- Bò cái ngửi bò khác, bồn chồn, tìm kiếm bò cái khác hoặc 
bò đực
- Cố nhảy lên con khác nhƣng không đứng yên khi bị bò cái 
khác hoặc bò đực nhảy lên lƣng.
- Thích gần ngƣời, gần bò khác hơn thƣờng lệ.
- Thỉnh thoảng kêu rống lên.
- Âm hộ ƣớt, đỏ và hơi phồng lên.
- Bò giảm lƣợng ăn vào và sữa giảm.
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
185
KỸ THUẬT DẪN TINH
Kỹ thuật phát hiện động dục - Ví dụ chu kỳ động dục ở bò cái
Giai đoạn 2 - động dục (chịu đực)
- Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-19 giờ.
- Đứng yên cho bò khác nhảy lên.
- Bồn chồn và kêu rống thƣờng xuyên, thích ngửi cơ quan sinh dục bò 
khác.
- Tai dựng lên, tỏ vẻ dễ gần hơn.
- Xƣơng sống lƣng cong lên, phần thắt lƣng lõm xuống, xƣơng hum 
cong lên.
- Âm hộ phồng lên và dịch nhờn tiết ra lúc đầu lỏng sau đặc kéo thành 
sợi.
- Mạn sƣờn lấm bùn và lông ở khấu đuôi xù lên (do bò khác nhảy 
lên).
- Tính thèm ăn giảm, giảm sữa.
- Thân nhiệt cao hơn (1oC).
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
186
KỸ THUẬT DẪN TINH
Kỹ thuật phát hiện động dục - Ví dụ chu kỳ động dục ở bò
cái
Giai đoạn 3 - sau động dục (sau chịu đực)
- Không cho con khác nhảy lên lƣng.
- Ngửi bò khác và bị bò khác ngửi.
- Dịch keo đặc từ âm hộ dính lên mông và đuôi.
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
187
KỸ THUẬT DẪN TINH - Kỹ thuật phát hiện động dục
Lựa chọn thời điểm dẫn
tinh thích hợp:
- Bò - 12h sau khi phát
hiện dộng dục.
- Lợn - 24 và 36h sau
khi bắt đầu động dục.
- Cừu - 12 đến 18h sau
khi bắt đầu động dục
Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo
188
KỸ THUẬT DẪN TINH - Vị trí dẫn tinh thích hợp
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
3.1. Nguyên lý chung của kỹ thuật cấy chuyển phôi 
và phân cắt phôi
• Dựa vào đặc điểm sinh sản của động vật có vú: Sau thụ 
tinh phôi còn ở trạng thái tự do, một vài ngày đầu trong 
phần trên của đƣờng sinh dục con mẹ có thể tách 
phôi ra ngoài cơ thể và nuôi cấy in vitro sau đó lại có thể 
chuyển vào cơ thể mẹ chửa tiếp tục rồi sinh sản.
• Dựa vào đặc tính toàn năng của tế bào ở giai đoạn phôi 
thai (4-8 tế bào) có thể lấy phôi và phân cắt phôi để 
thu đƣợc nhiều phôi hơn nữa (kỹ thuật phân cắt phôi).
Sơ đồ sự phát triển phôi tuần đầu tiên ở động vật có vú.
3.2. ĐẶC ĐIỂM PHÁT TRIỂN PHÔI Ở GIAI ĐOẠN SỚM
3.3.CÁC BƢỚC CHÍNH TRONG CẤY CHUYỂN PHÔI
a. Đối với gia súc cái cho phôi:
• Gây rụng trứng hàng loạt bằng cách tiêm các hocmon 
sinh dục.
• Giao phối với con bố đã lựa chọn ở thời điểm động 
dục cao.
• Thu nhận phôi bằng cách rửa dạ con 4-9 ngày sau giao 
phối.
• Đông lạnh phôi và bảo quản chúng trong nitơ lỏng
Kü thuËtcÊy chuyÓn ph«i
3.3.CÁC BƢỚC CHÍNH TRONG CẤY CHUYỂN PHÔI
b. Đối với gia súc nhận phôi:
• Gây động dục đồng loạt một nhóm gia súc cái đã chọn lựa 
(10 – 15 con). 
• đƣa phôi vào đàn gia súc nhận bằng cách bơm môi 
trƣờng dinh dƣỡng chứa phôi vào tử cung nhƣ thụ tinh 
nhân tạo 
• Theo dõi chặt chẽ quá trinh mang thai trong một số tháng 
đầu 
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
3.3.CÁC BƢỚC CHÍNH TRONG CẤY CHUYỂN PHÔI
c.Kỹ thuật lấy phôi và cấy phôi
• Dùng dụng cụ là ống Foley để thụt rửa để thu phôi
• Dung dịch thụt rửa gồm: muối đệm phốt phát Dulbecco 
(PBS), bổ sung 10 ml huyết thanh bò, 100.000 đơn vị 
penicilin và 50mg/L streptomicin. Nhiệt độ dung dịch khi 
sử dụng 37 0C.
• Thời gian lấy phôi: 4 - 9 ngày sau thụ tinh.
• Cấy phôi vào tử cung theo phƣơng pháp dẫn tinh nhƣ 
thụ tinh nhân tạo
Sơ đồ thụt rửa phôi 
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
Steps in loading a 0.25-cc plastic 
straw in preparation for transfer 
(or freezing) an embryo: labelling 
(A), aspirating embryo in second 
column of fluid (B), and the 
loaded straws (C). Note the air 
bubbles (arrows) to 
compartmentalize the straw. The 
top straw is loaded for freezing 
and the bottom straw is loaded for 
transfer, with a third column of 
medium as an added measure of 
safety
Transfer of frozen embryo
In vitro fertilization and embryo transfer
3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi
a. Nhân nhanh gia súc cái hoặc con thú đặc biệt 
quí 
Trong buồng trứng con bê cái có tới 500.000 tế 
bào trứng. Nếu dùng hocmon kích thích sẽ gây 
rụng trứng hàng loạt. Có thể thu tối đa tới 75 
phôi, thƣờng là 12 - 15 phôi trong một đợt kích 
thích. Một bò cái có thể chịu đƣợc kích thích 8 lần 
liên tiếp và nhƣ vậy có thể cho tới hàng trăm phôi. 
Bằng phƣơng pháp này dễ dàng nhân nhanh bê 
cái từ một bò sữa cao sản 
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi
b. Ứng dụng về vận chuyển gia súc
- Vận chuyển và thƣơng mại giống gia súc dƣới dạng 
phôi. Các phôi này đƣợc bảo quản lạnh sâu trong nitơ 
lỏng (-1960C) hoặc đƣợc bảo quản trong tử cung của 
thỏ. 
- So với vận chuyển con vật sống, vận chuyển phôi rất 
thuận lợi, ít tốn kém, giảm thiểu sự lây lan bệnh, đơn 
giản hóa việc kiểm dịch khi qua biên giới
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi
c. Xác định giới tính phôi trước khi cấy
• Xác định qua NST giới tính: thông qua giải phẫu mô và tế
bào quan sát NST giới tính của phôi
• Xác định qua sự có mặt của kháng nguyên HY chỉ có trong
hợp tử đực
• Phƣơng pháp phân tích ADN:xác định trinh tự lặp đặc hiệu
của NST giới tính qua kỹ thuật PCR (Ví dụ: dùng mồi SE47,
SE48 để xác định NST Y ở cừu và hƣơu đỏ Châu Âu. Trình
tự của mồi:
5’- CAGCCAAACCTCCCTCTGC - 3’ (SE47)
5’- CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC - 3’ (SE48)
( I. Pfeiffer and B. Brenig – Department of Molecular Biology,
Institute of Veterinary Medicine, Goettingen, Germany )
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
Sơ đồ chuẩn đoán sớm giới tính phôi
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI
3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi
d. Nhân nhanh phôi:
Chia cắt các tế bào của phôi có từ 4 – 8 tế bào
để thu đƣợc nhiều phôi hơn, bằng cách này
cho phép thu nhận một số lớn phôi giống hệt
nhau về mặt di truyền.
KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI