Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Phần 5)

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI 
(10 TIẾT) 
1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 
2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 
3. Các phương pháp lai phân tử 
4. Phương pháp PCR, ứng dụng 
5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 
6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 
BM CNSH TV – Khoa CNSH BM-CNSHTV 
KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH 
TRÌNH TỰ DNA 
BM-CNSHTV 
Khái niệm 
 Xác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật 
tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA. 
BM-CNSHTV 
Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau 
Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật 
đã được giải mã trình tự 
BM-CNSHTV 
Maxam-Gilbert (1977) 
Sanger (1977) 
Các phương pháp xác định trình tự 
Xác định trình tự tự động 
 Xác định trình tự thế hệ mới 
BM-CNSHTV 
Phương pháp Maxam-Gilbert 
• Là phương pháp phân giải hóa học 
• Sử dụng hóa chất để biến đổi DNA 
ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra 
các đoạn có chiều dài khác nhau Walter Gilbert 
BM-CNSHTV 
 Dimethyl sulfat methyl hóa G. 
 Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G. 
 Hydrazin gây biến đổi tại C và T. 
 Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến 
đổi tại C. 
 Piperidine được dùng để loại bỏ các 
base sau khi bị biến đổi và cắt mạch. 
Các loại hóa chất sử dụng 
BM-CNSHTV 
Base 
specificity 
Chemical used for 
base alteration 
Chemical used for 
altered base 
removal 
Chemical used 
for strand 
cleavage 
G 
Dimethylsulphate 
Piperidine 
Piperidine 
A+G 
Acid 
Acid 
Piperidine 
C+T 
Hydrazine 
Piperidine 
Piperidine 
C 
Hydrazine + alkali 
Piperidine 
Piperidine 
A>C 
Alkali 
Piperidine 
Piperidine 
BM-CNSHTV 
G A T C T C G 
A T C T C G G 
CH3 
T C T C G A 
T C T C G A 
DNA labeled at one 
end with 32P 
Base modification 
Release or displace- 
ment of reacted bases 
Strand scission 
 Maxam and Gilbert 
chemical method 
J2 nucleic acid sequencing 
BM-CNSHTV 
BM-CNSHTV 
BM-CNSHTV 
• Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn 
toàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng 
phụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt. 
• Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do 
đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng 
mẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ 
tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác. 
• Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, do 
vậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiến 
hành xác định trỡnh tự. 
• Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn, 
khoảng 250 bp 
Hạn chế của phương pháp 
Maxam- Gilbert 
BM-CNSHTV 
Phương pháp Sanger 
• Còn gọi là phương pháp kết 
thúc mạch (chain termination 
method) hay phuong pháp 
dideoxyribonucleotide 
(dideoxyribonucleotide 
method) 
BM-CNSHTV 
Phương pháp Sanger 
(chain termination or dideoxy method) 
•Phương pháp enzyme 
•Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn 
được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA 
polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung. 
Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại 
các vị trí đặc hiệu. 
•DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn 
đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không 
có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại 
• Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các 
dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid) 
BM-CNSHTV 
Cho phép kéo dài mạch ở đầu 3’ Ngăn cản sự kéo dài mạch ở đầu 3’ 
BM-CNSHTV 
Sự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTV 
Sự kéo dài mạch DNA 
khi xuất hiện ddNTP 
BM-CNSHTV 
Các bước thực hiện 
1. Chuẩn bị DNA khuôn sợi đơn 
2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng 
3. Thực hiện phản ứng 
4. Điện di kết quả 
 Thu nhận kết quả giải trình tự DNA 
BM-CNSHTV 
 Có 4 ống hỗn hợp phản ứng, mỗi ống 
chứa các thành phần như sau: 
− DNA khuôn mạch đơn 
− Mồi được tổng hợp hóa học (có thể đánh 
dấu phóng xạ) 
− dNTPs 
− ddNTP (mỗi ống phản ứng bổ sung 1 trong 
4 loại ddNTP là ddATP, ddTTP, ddGTP, 
ddCTP) 
− DNA polymerase 
− Dung dịch đệm thích hợp 
Thành phần phản ứng 
BM-CNSHTV 
DNA khuôn và mồi 
Mồi 
DNA khuôn mạch đơn chưa biết 
trình tự 
Bổ sung DNA 
 polymerase 
Các đoạn kết thúc 
bằng ddG 
Các đoạn kết thúc 
bằng ddC 
Các đoạn kết thúc 
bằng ddT 
Phân tách mạch mới được tổng hợp ra 
khỏi mạch khuôn 
Lớn 
nhất 
Nhỏ nhất 
Chia thành 4 ống phản ứng 
BM-CNSHTV 
BM-CNSHTV 
VD bản gel điện di xác định trình tự 
theo phương pháp Sanger 
BM-CNSHTV 
Bài tập tại lớp 
Cho biết thông tin về 
trình tự DNA thông qua 
bản gel điện di bên 
BM-CNSHTV 
• Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô 
lớn. 
• Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng 
hoá của các chất hoá học, không có phản ứng 
phụ. 
• Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần 
lượng DNA mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm 
được ảnh hưởng của DNA cấu trúc bậc 2. 
• Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài, 
khoảng 300 ~ 400 bp. 
Ưu điểm của phương pháp Sanger 
BM-CNSHTV 
Bài tập về nhà 
 Giả sử đoạn DNA cần xác định trình tự có 
trình tự như sau: 
 3’ ATTCTCAATGCTATGCTA 5’ 
 Nêu các bước tiến hành xác định trình tự 
theo phương pháp Sanger. 
BM-CNSHTV 
Xác định trình tự DNA tự động 
Nguyên lý: 
• Hoạt động trên cơ sở của phương pháp Sanger. Nhưng : 
• Quá trình tổng hợp DNA thực hiện nhờ kỹ thuật PCR 
• Các chất đánh dấu phát huỳnh quang được đưa vào mạch DNA 
tổng hợp mới nhờ sử dụng các mồi được gắn chất đánh dấu phát 
huỳnh quang ở đầu 5’ hoặc các ddNTP được gắn chất phát huỳnh 
quang. 
• Hệ thống xác định trình tự DNA phát hiện sự phát huỳnh quang từ 
4 chất nhuộm khác nhau được sử dụng để phân biệt A, C, G và T 
trong các phản ứng kéo dài. Mỗi chất nhuộm hấp thu ánh sáng ở 
các bước sóng ở bước sóng khác nhau. Có 4 màu và do đó 4 loại 
base có thể được phát hiện và phân biệt được với nhau. Máy 
cũng như hệ thống phần mềm sẽ thu nhận thông tin về màu sắc 
và từ đó chuyển đổi sang thông tin về trình tự của DNA. 
• Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lý số 
liệu 
BM-CNSHTV 
• Chuẩn bị DNA khuôn 
• Nhân DNA bằng PCR 
• Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự 
sequencer, chạy máy 
• Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do 
máy cung cấp, so sánh kết quả đọc trên 
hai mạch và đồ thị. 
Các bước tiến hành 
BM-CNSHTV 
BM-CNSHTV 
Bigdye terminator 
Sequencing với BigDye terminator 
BM-CNSHTV 
Điện di gel 
BM-CNSHTV 
Điện di mao quản 
BM-CNSHTV 
Điện di gel 
Applied Biosystems PRISM 
377 
(Gel, 34-96 lanes) 
Điện di mao quản 
Applied Biosystems PRISM 
3700 
(Capillary, 96 capillaries) 
BM-CNSHTV 
Sequencing (Sanger) – kết quả 
BM-CNSHTV 
BM-CNSHTV 
Xác định trình tự thế hệ mới 
BM-CNSHTV 
Pyrosequencing là một phương pháp xác định trình tự DNA dựa trên 
nguyên lý đọc trình tự qua "tổng hợp“ dựa vào khả năng phát hiện sự 
giải phóng pyrophosphate mỗi khi một nucleotide được gắn vào 
mạch. 
- Nguyên tắc: Pyrosequencing là dựa trên khả năng phát hiện hoạt 
tính của DNA polymerase với một enzym phát quang 
(chemiluminescent.) 
- Về bản chất, phương pháp cho phép đọc trình tự của một sợi đơn 
của DNA bằng cách tổng hợp sợi bổ sung dọc theo nó, và phát hiện 
những bazơ đã thực sự được gắn vào ở mỗi bước. Các mẫu DNA 
được cố định, và các dung dịch của A, C, G, và T nucleotide được 
thêm vào và bỏ đi sau mỗi phản ứng một cách tuần tự. 
Pyrosequencing 
BM-CNSHTV 
  Việc thêm một nucleotid vào đầu cuối của sợi là có thể nhận biết 
bởi nó được kèm theo sự giải phóng một phân tử pyrophosphate, là 
phân tử sau đó được chuyển hóa thành tín hiệu phát sáng nhờ 
enzyme sulfurylase. Ánh sáng sản xuất bởi phản ứng xúc tác 
luciferase-được phát hiện bởi một máy ảnh và phân tích trong một 
chương trình 
 Mỗi dNTP được thêm vào riêng rẽ một cách tuần tự. nucleotidase 
enzyme (apyrase ) cũng có trong thành phần phản ứng nên những 
dNTP không được gắn vào mạch sẽ được phân hủy trước khi các 
dNTP tiếp theo được bổ sung. 
BM-CNSHTV 
BM-CNSHTV 
 Hiện nay, một hạn chế của phương pháp là độ dài của mỗi 
lần đọc chỉ xung quanh 300-500 nucleotide, Điều này có thể 
làm cho quá trình lắp ráp bộ gen khó khăn hơn, đặc biệt là 
cho các hệ gen có chứa một lượng lớn ADN lặp đi lặp lại. 
Đến năm 2007, pyrosequencing là phổ biến nhất là sử dụng 
cho resequencing hoặc đọc trình tự của bộ gen mà hệ gen 
của loài họ hàng gần gũi đã hoàn tất. 
BM-CNSHTV