Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương - Chương II: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Phần 2)

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI 
(10 TIẾT) 
 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 
 Các phương pháp lai phân tử 
 Phương pháp PCR, ứng dụng 
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA 
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 
8/26/2014 1 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• Nhân dòng DNA là kỹ thuật dùng để tái sản xuất 
các đoạn DNA. 
• Hai cách: 
 ▪ sử dụng tế bào chủ 
 ▪ dùng PCR 
• Một vector là yêu cầu cần thiết để mang đoạn DNA 
mục tiêu vào trogn tế bào chủ 
Nhân dòng DNA 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
 Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn 
DNA/gen đã được tách dòng 
 Trong thực tế, một đoạn DNA lạ không thể duy trì và nhân bản 
trong tế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ 
mới chỉ ở dạng một đoạn DNA đơn độc. 
 Do enzyme DNA polymerase làm nhiệm vụ tái bản DNA 
không thể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào 
trên DNA mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tái 
bản” (origins of replication) Các đoạn DNA (các gen) muốn 
tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vào 
một vectơ (cloning vectors). 
 Vector nhân dòng thực chất là một phân tử DNA có gốc 
tái bản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn. 
Vector nhân dòng DNA 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• Chỉ có một địa điểm nhận biết cho một RE nào đó. 
– Nếu như số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân 
dòng sau này. Một vector nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu 
như nó có thể được cắt nhờ nhiều loại RE và tất nhiên ứng với mỗi 
loại cũng chỉ có một địa điểm nhận biết. 
• Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc 
– Thí dụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng 
tạo mầu. Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã 
được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng 
mầu của chúng. 
• Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế 
bào chủ mới. 
– Trong một số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm 
vector nhân dòng cho hai tế bào chủ không có liên quan với nhau 
như E.coli và Bacillus subtilis. Các vector hai chức năng này phải 
có số điểm tái bản lớn hơn 1. 
Tiêu chuẩn của một vector nhân dòng 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Các loại vector nhân dòng DNA 
vectors 
Plasmid-based Virus-based 
Chromosome-based 
Phage-based 
Eukaryotic virus- based 
YAC 
BAC 
MAC 
Hybrid 
(phagemid, 
cosmid ) 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• Các loại vector nhân dòng khác nhau 
được sử dụng cho các thí nghiệm nhân 
dòng khác nhau. 
• Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào kích 
thưứoc và loại DNA cần nhân dòng 
Các loại vector nhân dòng DNA 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Plasmid 
• Các tế bào vi khuẩn 
có thể chứa các DNA 
ngoài DNA nhiễm Sắc 
thể gọi là các plasmid. 
• Plasmid thường ở 
dạng các DNA nhỏ 
mạch vòng. 
• Một số plasmid có mặt 
trong tế bào với nhiều 
bản sao. 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
 Kích thước nhỏ (3-20kb) 
 Genome đã được giải mã 
 Số bản copy cao 
 thấp (1 – 10) hoặc cao (100 – 1000) copies/tế bào 
 Chứa gen chỉ thị hoặc chọn lọc 
 kanamycin resistance gene (kanR) 
 tetracycline resistance gene (tetR) 
 ampicillin resistance gene (ampR) 
 . 
Chứa trình tự nhận biết duy nhất cho nhiều RE 
Ưu điểm của plasmid vectors: 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Một số plasmid vector 
 pBR plasmid 
 pUC 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
 “p” : plasmid 
“BR” : tên của hai nhà khoa học F. Bolivar và R.Rodrigues 
“332”: số thứ tự. 
4363bp 
Nhóm plasmid pBR 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• Đây là nhóm các plasmid được phát triển từ plasmid pBR322 
• Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40 % DNA) được cắt bỏ còn 
phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại. 
• Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn ADN ngoại lai (cũng 
là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC được phân bố tập trung 
vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS). 
Nhóm plasmid pUC 
 • Gốc tái bản 
• Marker chọn lọc 
• Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS/polylinker) 
Older cloning vector 
Thành phần của một plasmid 
• Là một đoạn DNA với nhiều vị trí 
nhận biết duy nhất cho các 
enzyme giới hạn. Việc cắt 
plasmids với một trong các RE 
trong vùng MCS không ảnh 
hưởng gì đến các đặc tình cần 
thiết khác của vector 
• Gene cần nhân dòng được gắn 
vào vector nhân dòng ở một vị trí 
giới hạn trong vùng polylinker 
Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS / polylinker) 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• Không nhân dòng được các đoạn DNA 
kích thước lớn 
• Thường nhân đoạn 4 - 10 kb 
• Hiệu suất biến nạp thường không cao 
Hạn chế của plasmid vectors 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số 
vector nhân dòng 
STT Vector Khả năng chứa đoạn DNA (kb) 
1 Plasmid <10 kb 
2 Bacteriophage 9 – 20 kb 
3 Cosmid 33 – 47 kb 
4 BAC 100 – 300 kb 
5 YAC 100 – 1000 kb 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
• DNA cloning cho phép chọn lọc và sao 
chép bất kỳ một đoạn trình tự đặc thù của 
DNA (hoặc RNA) và sản xuất với một 
lượng không giới hạn 
• Là bước đầu tiên trong một loạt các thí 
nghiệm về kỹ thuật di truyển 
– Tạo thư viện DNA 
– PCR 
– DNA sequencing 
Nhân dòng DNA 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Các bước cơ bản của nhân dòng gen 
1. Tách chiết DNA từ mẫu nghiên cứu, 
cắt DNA bằng enzym cắt giới hạn để 
tạo ra các đoạn DNA là nguyên liệu 
cho quá trình nhân dòng (tách dòng) 
2. Gắn các đoạn cắt vào một vector nhân 
dòng 
3. Chuyển nạp các vector nhân dòng sau 
phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật 
chủ để nhân bản các đoạn DNA đã 
được gắn cùng với vector 
4. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành 
từng dòng riêng hình thành thư viện 
mẫu đã nhân dòng. Từ đây có thể 
chọn lọc ra các trình tự cần quan tâm. 
Xử lý 
vector với 
enzyme 
cắt giới 
hạn hình 
thành 
đoạn bổ 
sung với 
đoạn DNA 
cần nhân 
Đoạn DNA cần nhân 
dòng đã được xử lý 
enzyme giới hạn 
Nối đoạn DNA với 
vector nhờ enzyme 
DNA ligase 
Phân tử DNA tái tổ hợp 
Chuyển vào tế bào vi khuẩn 
Nhiễm sắc thể vi khuẩn 
Phân tử DNA tái 
tổ hợp 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 
Bước 1: Cắt DNA mẫu và plasmid bằng RE 
Xử lý enzyme EcoRI 
Xử lý enzyme EcoRI 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Bước 2: Nối mẫu DNA vào pUC19 
Mẫu DNA đã 
được xử lý bằng 
EcoRI 
Vector plasmid 
được xử lý bằng 
EcoRI 
Quá trình lai thực 
hiện nhờ DNA ligase 
Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Bước 3. Biến nạp 
• Biến nạp (transformation): là quá trình 
chuyển DNA ngoại sinh vào trong 1 tế bào 
• Có một số phương pháp để biến nạp DNA 
vào vi khuẩn, 2 phương pháp thường sử 
dụng đó là : 
– Phương pháp hóa học sử dụng CaCl2 và sốc nhiệt để 
thúc đẩy DNA đi vào trong tế bào 
– Dùng xung điện (electroporation) để kích thích quá 
trình tế bào tiếp nhận DNA 
Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Biến nạp theo phương pháp dùng CaCl2 và sốc nhiệt 
Nuôi cấy vi 
khuẩn E.coli 
đến pha log 
Li tâm 
Hòa tủa trong 
dung dịch CaCl2 
Đặt trong đá 
Chia thành các ống 
tế bào khả biến 
Bảo quản ở -80oC 
Plasmid 
tái tổ hợp 
Đặt trong đá 
Sốc nhiệt 
Bể ổn nhiệt 42oC 
Cấy trải trên 
môi trường 
chọn lọc 
Khuẩn lạc mọc 
trên môi trường 
chọn lọc 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Biến nạp bằng xung điện 
Nuôi cấy vi 
khuẩn E.coli 
đến pha log 
Li tâm Hòa tủa trong dung 
dịch H2O vô trùng 
Li tâm 
Hòa tủa trong dung 
dịch H2O vô trùng 
Tế bào khả 
biến được sử 
dụng ngay 
Xung điện 
Plasmid 
tái tổ hợp 
Cấy trải trên 
môi trường 
chọn lọc 
Khuẩn lạc mọc trên 
môi trường chọn lọc 
Đệm 
Đặt trong đá 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Bước 4. Chọn lọc 
• Nuôi dịch khuẩn vừa biến nạp trên môi 
trường chọn lọc. 
Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Các sản phẩm thu được sau biến nạp 
plasmid + đoạn DNA 
ngoại 
Kháng ampicillin 
Plasmid không mang 
đoạn DNA ngoại 
Kháng ampicillin 
Không mang plasmid 
Không kháng ampicillin 
Làm thế nào để phân biệt và chọn lọc được 
sản phẩm mong muốn? 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Chọn lọc trắng xanh 
Dựa vào hệ thống lac Operon: điều khiển phản ứng 
đối với lactose trong tế bào E. coli 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
 - galactosidase &  -glucuronidase 
Lactose Galactose + Glucose 
 - galactosidase 
-D-glucuronid + H2O Glucuronic acid + Glucose 
 - glucuronidase 
X-Gal 
5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-galactoside 

 - g
a
la
c
to
s
id
a
s
e
5-Brom-4-chlor-indigo 
X-Gluc 
5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-glucuronid 

 - g
lu
c
u
ro
n
id
a
z
a
5-Brom-4-chlor-indigo 
Không màu 
Màu xanh sẫm 
_cleanup1.jpg 
LacZ gene promotor 
RNA 
pol. 
Gene LacZ ở trạng thái hoạt động 
DNA 
LacZ mRNA 
Ribosome 
β-galactosidase 
RNA 
Protein 
X-gal BLUE colonies 
WHITE colonies X-gal 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
LacZ promotor operator 
Repressor 
Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc 
LacZ promotor 
RNA 
pol. 
RNA 
pol. 
IPTG 
IPTG 
IPTG 
LacZ promotor operator 
IPTG 
IPTG 
RNA 
pol. 
X-gal 
beta-galactosidase 
X + galactose 
MÀU TRẮNG MÀU XANH 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
X 
X X 
X 
X 
Plasmid + đoạn DNA ngoại 
Plasmid + đoạn DNA ngoại 
Không chứa plasmid 
LacZ 
Insert 
Khuẩn lạc TRẮNG Khuẩn lạc XANH 
Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc 
P O 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Như vậy: 
• Chỉ các vi khuẩn nào có chứa plasmid đã chuyển nạp thì 
tồn tại được trên môi trường và sinh khuẩn lạc (vì có 
plasmid chuyển nạp thì mới có gen chịu kháng sinh ). 
• Do cấu trúc của plasmid, vùng gen chịu trách nhiệm sinh 
màu (gen mã hoá  -galactozidase) sẽ là vùng bị cắt để 
gắn DNA ngoại vào, cho nên các khuẩn lạc có mầu xanh 
là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn DNA 
ngoại lai, còn khuẩn lạc có mầu trắng chính là khuẩn lạc 
có chứa 1 đoạn DNA cần nhân dòng được ghép vào. 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Bước 4: 
(tiếp...) 
• Chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong môi trường lỏng có 
bổ sung ampicillin để nhân nhanh sinh khối. 
• Tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả nối DNA 
vào plasmid (khẳng định sự có mặt của đoạn DNA mong 
muốn trong plasmid) bằng các phương pháp như PCR, sử 
dụng RE. 
Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 
BM CNSH TV – Khoa CNSH 
Movie on making recombinant DNA 
BM CNSH TV – Khoa CNSH