Bài giảng Công nghệ sinh học - Chương 3: Công nghệ DNA tái tổ hợp - Nguyễn Vũ Phong

3/3/2015
1
Công nghệ DNA tái tổ hợp
Nguyễn Vũ Phong
Lịch sử hình thành
• 1972 – 1973: DNA tái tổ hợp in vitro từ 3 nguồn vật liệu di truyền
khác nhau. (Berg, Boyer và Cohen)
• 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen,
Henlinski, Boyer).
Tên gọi:
• Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology)
• Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay công nghệ gene (Genetic
technology)
• Thao tác gene (Gene manipulation)
• Tạo dòng phân tử (Molecular cloning)
• Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering): thao tác với những phần
lớn hơn của bộ gene.
QUY TRÌNH TIẾN HÀNH
• Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho
• Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế
bào cho
• Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục
tiêu bằng 1 loại enzyme cắt giới hạn
• Bước 4: Trộn và nối 2 loại DNA bằng
enzyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn
chỉnh
• Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế
bào nhận (E. coli, nấm men)
• Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng tế bào
mang gene tái tổ hợp
• Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene
biểu hiện ra sản phẩm
1. Enzyme
1.1. Enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE)
- 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn
- Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ
tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ.
Restriction enzyme.swf
1. Enzyme
1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)
- Trình tự nhận biết: gồm 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom)
- Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .
- Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau.
- EcoRI: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự tìm ra (I: đầu tiên)
1. Enzyme
1.2. Enzyme nối (Ligase)
Hình thành cầu phosphodiester 
gắn các nucleotid kề cận 
hay chụm cầu với nhau
3/3/2015
2
1. Enzyme
1.3. Enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase)
• Tổng hợp sợi DNA bổ sung
c-DNA (complementary
DNA) từ một sợi mRNA
hoặc từ polyribonucleotide
tổng hợp
• c-DNA có thể tổng hợp
thành c-DNA kép (c-DNA
duplex) nhờ DNA
polymerase. c-DNA kép
được dùng trong việc tạo
dòng c-DNA
cDNA.swf
1.4. Các enzyme khác
Enzyme Chức năng
DNaseI Phân hủy DNA mạch kép bằng phản ứng thủy
phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) 
Nuclase BAL31 Phân hủy 2 đầu mút 3’ và 5’ của DNA (Exon
nuclease)
S1 nuclease Cắt DNA mạch đơn
Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 
3’-5’
Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn 
Thermophilus aquaticus
1. Enzyme
2. Các vector chuyển gene
Plasmid:
- DNA vòng tròn
- Sao chép độc lập trong tế bào
- Có khả năng mang một số gene 
có khả năng biểu hiện thành 
protein
Vector: 
- Phân tử DNA có khả năng tự tái bản
- Tồn tại độc lập trong tế bào
- Mang được gene mong muốn
Yêu cầu tối thiểu đối với vector
chuyển gene.
- Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)
để tự sao chép mà tồn tại độc lập
- Trình tự nhận biết cho RE tạo vết
cắt để chèn gene lạ
- Trình tự điều hòa (promoter) tạo
điều kiện thuận lợi phiên mã gene
lạ
- Đảm bảo sự di truyền bền vững
của DNA tái tổ hợp
- Có gene đánh dấu (marker) để dễ
dàng nhận biết các gene lạ.
2. Các vector chuyển gene
2. Các vector chuyển gene
Các loại vector chuyển gene
Vector Đặc điểm Khả năng
chèn
Ứng dụng
Plasmid Dạng vòng 0,1 – 10kb Procaryote
Phage λ Tự động xâm nhiễm và sinh
sản trong TB vi khuẩn
15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene
Cosmid Plasmid + đoạn cos của
phage λ
45kb Lập thư viện gene
Phage 
M13
DNA mạch đơn Xác định trình tự nu
Sản xuất mẫu dò
Gây đột biến điểm
định hướng
BAC NST nhân tạo vi khuẩn 50 – 300kb
YAC Vòng tròn 2 micrometre cải
tiến
100-2000kb
MAC NST nhân tạo động vật có vú >2000kb
2. Các vector chuyển gene
Ứng dụng của vector chuyển gene
- Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA (nhiều bản sao)
- Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn DNA
- Chuyển gene
- Sản xuất RNA
- Sản xuất protein từ gene được tạo dòng.
Hệ thống vector chuyển gen được hoàn thiện không ngừng.
3/3/2015
3
Plasmid Ti
- 200Kb
- Agrobacterium tumefaciens
- Chuyển gen ở thực vật
- Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào
2. Các vector chuyển gene 3. Hệ thống tế bào chủ 
(Host)
Mục đích:
- Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.
- Biểu hiện gene, đặc biệt ở Eukaryote
- Sản xuất protein tái tổ hợp.
3.1. Escherichia coli (E.coli)
- Dễ nuôi cấy và nhân dòng
- Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau.
- Vi khuẩn Gram-, hình que, 
- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base
3. Hệ thống tế bào chủ 
(Host)
3.2. Saccharomyces cerevisiae
- Eukaryote đơn bào
- Dễ dàng nuôi cấy và thu sinh khối
- Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh
- Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có
đủ hoạt tính sinh học.
- Sản xuất protein tái tổ hợp dễ dàng
- Sinh vật an toàn
3.3. Hệ thống tế bào thực vật
3.4. Hệ thống tế bào động vật
- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)
- Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)
- Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney
- Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)
- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người
- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans
3. Hệ thống tế bào chủ 
(Host)
1. Lai nucleic acid
Đặc tính biến tính và hồi tính có thể lai giữa DNA-DNA, DNA-RNA,
RNA-RNA
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
Southern Blot.swf
2. Thu nhận gene
- Thu nhận DNA từ bộ
gene
* Shotgun: toàn bộ
DNA của sinh vật
được cắt đoạn nhỏ
bằng cơ học hay RE
và gắn vào vector tạo
dòng
* Ngân hàng/thư viện
DNA bộ gene
(Bank/Library of
genomic DNA)
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
3/3/2015
4
2. Thu nhận gene
- Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
2. Thu nhận gene
- Lập ngân hàng c-DNA
* Tạo gene từ các mRNA
thông tin nhờ enzyme phiên
mã ngược
Ưu điểm
- Chứa trình tự mã hóa liên
tục của một gene (không
chứa đoạn intron)
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
3. Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Dùng đầu so le
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
3. Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Dùng đầu so le
b) Dùng các đoạn nối (linkers)
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
3. Tạo plasmid tái tổ hợp
a) Dùng đầu so le
b) Dùng các đoạn nối (linkers)
c) Dùng enzyme terminal transferase
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
a) Hóa biến nạp
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
3/3/2015
5
4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
b) Điện biến nạp
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
c) Vi tiêm
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào
d) Bắn gene
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
DNA coated 
golden particles
Gene gun
Cell division
A plant cell with
the new gene
Transgenic plant
Plant cell
Cell’s DNA
Tạo cây chuyển gene 
5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene
a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
Screening.swf
5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene
b) Sự biểu hiện của gene thành protein
Kỹ thuật và phương pháp căn bản
3/3/2015
6
Phản ứng tạo chuỗi nucleotide
(Polymerase Chain Reaction, PCR)
1985, Kary Mullis
1. Nguyên tắc
PCR.swf
PCR dựa trên 3 bước ở nhiệt độ khác nhau.
1. Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94 oC
2. Bắt cặp: lai giữa primers và DNA đơn. Nhiệt độ khoảng 50 oC
3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và
dNTPs: 72 oC.
Lặp lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cần
khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di
Polymerase Chain Reaction, PCR
2. Thành phần phản ứng
- Primer 
- Polymerase chịu nhiệt
- dNTP
- Dung dịch đệm
- Mẫu
- Dung dịch đệm
Sequencing 
1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert
Sequencing 
1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert
2. Phương pháp didesoxy của F. Sanger
Ứng dụng công nghệ gene
1. Khai thác DNA các bộ gene
1.1. Genomics: 
- Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng
- Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng.
1.2. Proteomics
- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến 
đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng 
(function)
- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.
1.3. Human Genome Projet
1.4. Các ngành học khác
- Cellomics
- Metabolomics
- Ionomics 
Ứng dụng công nghệ gene
2. Công nghệ protein tái tổ hợp
- Sản xuất r-protein 
STT Sản phẩm Các bệnh điều trị Năm hết patent
1 Insulin Tiểu đường 2001
2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung 
thư, ..
2002
3 Interferon beta Xơ cứng 2003
4 Hormon tăng tưởng người Thiểu năng tăng trưởng 2003
5 Erythropoetin Thiếu máu 2004
6 T-PA (tissu plasminogen 
activator)
Nhồi máu cơ tim 2005
7 G-CSF (granulocyte –
COLONY Stimulating Factor
Chemotherapy-induced 
neutropenia
2006
3/3/2015
7
Ứng dụng công nghệ gene
3. Chẩn đoán phân tử
- Dựa trên phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, chính xác, đơn giản
- DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt giữa 2 cá thể, 2 dòng 
hoặc 2 giống khác nhau.
- Biomarker: dấu chuẩn sinh học
- DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền
- Microarray và Biochips: 
Ứng dụng công nghệ gene
4. Vi sinh vật chuyển gene
- Genomics vi sinh vật: giải trình tự hơn 200 loài vsv.
- Sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp.
- Công nghệ bề mặt tế bào nấm men.
Ứng dụng công nghệ gene
5. Thực vật chuyển gene
- Cải thiện giống cây trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh,
- Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa
- Tạo sắc tố ở các thực vật chuyển gene
- Biến đổi chất lượng thực phẩm cây trồng
- Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu
- Sản xuất dầu nhờn công nghiệp
- Sản xuất plastid
Ứng dụng công nghệ gene
6. Động vật chuyển gene
- Động vật mang gene người làm mô hình thí nghiệm (bệnh di truyền, 
ung thư,, thoái hóa cơ, viêm khớp,)
- Sản xuất protein tái tổ hợp
- Chăn nuôi gene (gene farming) 
7. Công nghệ gene đối với sức khỏe con người
Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân
* Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị
Pharmacogenomics: (Dược học bộ gene)
Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân
Gene therapy: 
* Chuyển gen lành thay thế gene sai hỏng
* Thay thế gene
Ứng dụng công nghệ gene