Bài giảng Các kỹ thuật miễn dịch thường dùng - Nguyễn Thành Luân

13/12/2012 
1 
KHOA CNSH & KTMT 
Bài giảng Miễn dịch học 
CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH 
 THƢỜNG DÙNG 
1 
GV: Nguyễn Thành Luân 
luannt@cntp.edu.vn 
Vai trò của miễn dịch trong 
sinh học 
• Vô cùng quan trọng trong CNSH y dược & các 
ứng dụng sinh học khác 
• Các bệnh ở người và động vật chủ yếu xuất 
phát từ sự tạp nhiễm hoặc rối loạn của hệ 
thống miễn dịch 
• KN (bệnh) lạ xuất hiện ngày càng nhiều & 
phức tạp dưới các hình thức khác nhau 
 Cải thiện các cách chuẩn đoán bệnh 1 cách 
nhanh chóng là yêu cầu đối với ngành miễn dịch 
học 
2 
13/12/2012 
2 
Nhu cầu đáp ứng sản xuất 
miễn dịch trong sinh học 
• Sản xuất vaccine phòng ngừa các bệnh ở người 
và động vật như: influenza, MMR (measles, 
mumps, rubella), HIV/AIDS, sốt xuất huyết, di 
ứng & hen xuyễn, tiểu đường loại 1, thấp khớp 
• Tăng hiệu quả trong cấy ghép mô TB/cơ quan 
• Cải thiện sức khỏe động vật hoang dã & vật nuôi 
(thú y) 
• Hỗ trợ ngành nông nghiệp/công nghiệp chăn nuôi 3 
Các kỹ thuật miễn dịch cơ bản 
• Định lượng immunoglobulin và các 
protein khác 
– Miễn dịch ngưng kết 
– Miễn dịch kết tủa 
– Miễn dịch khuếch tán đơn & kép 
• Miễn dịch liên kết enzyme 
– Miễn dịch vi hạt 
– Miễn dịch huỳnh quang 
– Miễn dịch hóa/điện phát quang 
4 
13/12/2012 
3 
Kỹ thuật định lƣợng immunoglobulin 
và các protein đặc hiệu khác 
5 
Kỹ thuật cạnh tranh: KN không đánh 
dấu cạnh tranh với KN có đánh dấu, kết 
hợp với KT 
 Yêu cầu của phản ứng này là KT 
phải có tính đặc hiệu cao, KN dùng xác 
lập đồ thị tương quan chuẩn phải rất tinh 
khiết, kháng nguyên không mất hoạt tính 
sinh học sau khi đánh dấu. 
Kỹ thuật định lƣợng 
immunoglobulin và các protein đặc 
hiệu khác 
6 
Kỹ thuật không cạnh tranh: được 
sử dụng rộng rãi trong định lượng 
KN hoặc KT bằng phương pháp 
miễn dịch 
13/12/2012 
4 
Miễn dịch ngƣng kết 
(Agglutination) 
7 
 Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN 
và KT, dùng hạt latex hay HC làm 
nền phản ứng. 
 Bản chất của phương pháp này 
là định tính và định lượng bằng cách 
pha loãng tuần tự. 
Cơ chế miễn dịch ngƣng kết 
8 
13/12/2012 
5 
9 
Agglutination Sperm 
10 Cách hoạt động: 
howitworks.htm 
13/12/2012 
6 
Miễn dịch ngƣng kết 
(Agglutination) 
11 
 Ưu điểm của phương pháp 
 - Đơn giản 
 - Chỉ cần trang bị máy quang phổ kế đo 
được bước sóng 340 nm và ủ nhiệt ở 37oC. 
 Khuyết điểm 
 - Hạn chế trong 1 số thử nghiệm 
 - Độ nhạy của cơ chất phát hiện khá thấp. 
Miễn dịch kết tủa 
(Immuno-precipitation) 
12 
 Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN 
và KT tạo kết tủa trong môi trường 
thích hợp (như polyethylene glycol) 
 Nếu lượng KT quá nhiều sẽ tạo 
thành độ đục và đo ở bước sóng UV 
(340nm). 
13/12/2012 
7 
Miễn dịch kết tủa 
(Immunoprecipitation) 
13 
Miễn dịch khuyếch tán đơn 
(Single radial immunodiffusion, RID) 
14 
13/12/2012 
8 
15 
Kỹ thuật Mancini 
• Kháng huyết thanh này được hòa tan vào 
thạch đun lỏng 
• Hỗn hợp thạch-kháng huyết thanh được đổ rải 
đều 
• Đục các lỗ tròn trên thạch và cho huyết thanh 
cần đo hoặc huyết thanh chứng vào 
• Kháng nguyên sẽ khuyếch tán theo hướng ly 
tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa kháng 
huyết thanh 
• Vòng tủa mất 48 giờ mới ổn định=>tương đối 
nhạy (->5 mg/lít) và đáng tin cậy 
16 
13/12/2012 
9 
Đường chuẩn dùng trong kỹ thuật Mancini 
17 
Miễn dịch khuyếch tán kép trên thạch 
(Double diffusion in two dimensions) 
18 
 Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành 
cấu trúc mạng lưới của agarose. 
 Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn 
200 kDa khuếch tán dễ dàng trong 
agarose, các phân tử có trọng lượng lớn 
di chuyển chậm và khó khăn hơn. 
Kỹ thuật Ouchterlony 
13/12/2012 
10 
Immuno-diffusion 
19 
Miễn dịch khuyếch tán kép trên thạch 
20 
13/12/2012 
11 
21 
Căn cứ vào đường kết tủa có 3 
trường hợp xảy ra 
 + Các giếng chứa kháng nguyên đều đồng nhất 
và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa 
gặp nhau và nối liền nhau => hiện tượng hai kháng 
nguyên đồng nhất 
 + Hai giếng chứa kháng nguyên chỉ có một 
phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng 
thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau => hai 
kháng nguyên không đồng nhất nhau 
 + Hai giếng chứa kháng nguyên có liên quan 
một phần với kháng thể (cùng có chung một epitop A), 
sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một 
đường dài và một đường ngắn hơn 
22 
13/12/2012 
12 
23 
Miễn dịch Enzyme 
(ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) 
24 
 Nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (định 
lượng) bằng chất đánh dấu là một enzyme (alkaline 
phosphatase hoặc peroxidase) 
 ELISA thuộc hệ thống kỹ thuật MD enzyme pha 
rắn (giá đỡ KN hay KT). Pha rắn là điều kiện cần thiết 
cho thành công của phản ứng, trên đó phản ứng MD 
được xảy ra. 
Tùy theo yêu cầu kỹ thuật pha rắn có thể là: 
 - Bề mặt polystyrol, polyvinylchlorid, các chất 
dẽo các thành phần phản ứng được hấp phụ vật lý. 
 - Cellulose, agarose các thành phần phản ứng 
được gắn bởi các liên kết hóa học. 
13/12/2012 
13 
Maùy ño quang 
Maùy uû 
Maùy röûa 
Khaùng IgM 
Khaùng 
nguyeân 
Coäng hôïp 
Cô chaát 
Ño maät ñoä quang 
Phản ứng gồm các giai đoạn cơ bản 
26 
 Giai đoạn 1: Kết hợp KN và KT 
 Giai đoạn 2: Kết hợp chất đánh 
dấu (conjugate enzyme) vào phức hợp 
KN và KT 
 Giai đoạn 3: Biểu hiện màu và 
đọc kết quả 
13/12/2012 
14 
Miễn dịch vi hạt (MEIA) 
(micro-particle enzyme immuno assay) 
27 
 - Cải tiến từ kỹ thuật ELISA: pha 
cứng (solid phase) của phản ứng (KN hay 
KT) được gắn trên các vi hạt treo lơ lững 
trong dung dịch. 
 - Các ưu điểm: 
 + Tăng diện tích tiếp xúc KN và KT, 
làm tăng độ nhạy, giảm thời gian ủ, giảm 
thời gian làm phản ứng 
 + Giúp tự động hóa kỹ thuật rửa, 
giúp rửa sạch hơn 
Miễn dịch huỳnh quang (FIA) 
(fluoro immuno assay) 
28 
 Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn 
cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau: 
 - Thay thế chất đánh dấu bằng chất phát 
huỳnh quang. 
 - Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một 
quang kế huỳnh quang (fluorometer) 
 Khuyết điểm cơ bản nhất là vấn đề nhiễu, 
chất phát huỳnh quang có thể hiện diện trong tự 
nhiên. Do đó tín hiệu huỳnh quang phát ra phải 
cao hơn hẳn so với nhiễu Độ nhạy của thử 
nghiệm này không cao. 
13/12/2012 
15 
KT gắn FITC 
Tiêu bản tế bào nhiễm bệnh 
Kháng thể (KT) 
Miễn dịch huỳnh quang (FIA) 
(fluoro immunoassay) 
Miễn dịch phóng xạ (RIA) 
(radial immuno assay) 
30 
 Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn 
cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm 
sau: 
 + Chất đánh dấu là một đồng vị phóng xạ 
của một nguyên tố như I125 hay Co63 
 + Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một 
máy đếm phóng xạ (Geiger Meter) 
 Phương pháp này có độ nhạy tốt, nhưng 
tốc độ phản ứng chậm và cần nhiều thời gian để 
đếm bức xạ phát ra 
13/12/2012 
16 
Tạo các Ag phóng xạ bằng miễn dịch 
cạnh tranh 
32 
13/12/2012 
17 
33 
Miễn dịch hóa phát quang trực tiếp (DCLIA) 
(Direct-chemiluminescense immuno assay) 
34 
 Chất đánh dấu là phân tử khả năng phát 
quang khi thay đổi pH môi trường (Acridinium 
Ester ). 
 Phức hợp KN-KT sau khi rửa sẽ thêm vào một 
chất acid, sau đó khi cho vào chất kiềm, trong 
vòng 2 giây phân tử Acridinium Ester sẽ phát 
quang. 
 Để định lượng ánh sáng phát ra, cần dùng 
buồng nhân quang (luminometer) trong buồng 
tối, lượng ánh sáng phát ra tỉ lệ với nồng độ cơ 
chất cần phân tích có trong mẫu thử. 
13/12/2012 
18 
35 
PP gaén tröïc tieáp 
Khaùng theå treân pha raén 
gaén vaøo KN trong HT 
beänh nhaân, sau ñoù ñöôïc 
gắùn vaøo chaát lieân keát 
khaùng theå mang 
acridinium 
PP gaén caïnh tranh 
KN caàn ño vaø chaát ñaùnh 
daáu mang acridinium 
gaén caïnh tranh vaøo KT 
treân pha raén 
Miễn dịch điện hóa phát quang 
(ECLIA) 
(Electro-chemiluminescense immuno assay) 
36 
 Dựa trên sự sử dụng phức hợp 
Ru(bry)3
2+ (Ruthemium (II) và tris 
(bipyridyl) và TPA (Tripropylamine). 
 Hoạt động có sự khởi động điện. 
Phản ứng xảy ra dưới tác dụng của điện 
áp. 
 Khi đặt một điện thế lên điện cực 
buồng đo, phức hợp ruthenium được kích 
hoạt và tín hiệu phát quang được hình 
thành 
13/12/2012 
19 
37 
38 
Máy điện hóa phát quang 
13/12/2012 
20 
e
-
Ñieän cöïc 
e
- 
TPA 
TPA
** TPA* 
[Ru(bpy)
3
3+
] [Ru(bpy)
3
2+
] 
[Ru(bpy)
3
2+
] Photon 
(620nm) 
H
+ 
e
- 
NỘI DUNG NẮM BẮT KIẾN THỨC 
40 
PHÖÔNG PHAÙP MIEÃN DÒCH CAÙC XEÙT NGHIEÄM ÑÒNH LÖÔÏNG 
Mieãn dòch ngöng keát ñoä ñuïc 
Caùc heä thoáng maùy sinh hoùa töï ñoäng vaø 
baùn töï ñoäng 
Apo A
1 
, Apo B , C
3 
, C
4
 , CRP, Ferritin 
IgA, IgG, IgM, Microalbumin 
Mieãn dòch men (ELISA, MEIA) 
Caùc heä thoáng ELISA thuû coâng vaø baùn 
töï ñoäng 
Abbott (AxSYM) 
BioMerrieux (Vidas, MiniVidas) 
 Caùc hormon: TSH, LH, FSH, 
Prolactin, FT3, FT4, TBG, 
Thyroglobulin, Insulin, Testosteron, 
Progesteron 
 Caùc chæ ñieåm ung thö: CEA, PAS, 
AFP, NSE 
 Caùc XN vieâm gan sieâu vi: Anti HAV, 
5HBV, Anti HCV 
 Caùc chaát khaùc: Troponi I, TroponinT, 
Ferritin 
Mieãn dòch huyønh quang 
Abbott (iMX, AxSYM) 
Hoùa phaùt quang tröïc tieáp 
Abbott (Architect i2000 ) 
Bayer (ACS:180SE, ADVIA centaur) 
Ñieän hoùa phaùt quang 
Roche (Elecsis 1010, Elecsis 2010) 
13/12/2012 
21 
KẾT THÚC CHƢƠNG 6 
41